黄藤素及其组合物的制备方法及医药新用途.pdf

本发明公开了从防己科(Menispermaceae)天仙藤属(Fibraurea Lour.)植物黄藤(Fibraurea recisa Pierre)及同属植物中提取的黄藤素及组合物具有防治老年痴呆的作用，经酶学及动物实验证明，黄藤素及组合物均具有很好的防治老年痴呆的作用。更进一步研究表明，黄藤素较组合物的活性更强，说明黄藤素是主要的药效物质。

权利要求书
1.  从天仙藤属植物中提取的黄藤素在制备具有防治老年痴呆药物中的应用。

2.  从天仙藤属植物中提取的以黄藤素为主要成分的组合物在制备具有防治老年痴呆药物中的应用。

3.  根据权利要求2所述以黄藤素为主要成分的组合物在制备具有防治老年痴呆药物中的应用，其特征在于：组合物主要含有黄藤素、药根碱、千金藤碱、千金藤宁碱、小檗碱。

4.  根据权利要求3所述以黄藤素为主要成分的组合物，其特征在于：按重量百分比计黄藤素占50-85％，药根碱占1-5％，千金藤碱占0.5-4％，千金藤宁碱占0.5-3％，小檗碱占0.2-3％，组合物中总生物碱的含量不低于95％。

5.  根据权利要求1-4所述的黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物的制备方法，其特征在于：
(1)黄藤粗粉用含乙酸或甲酸的60-95％乙醇回流提取3次，每次2-3小时，合并提取液，加入药液体积0.1％-1％活性炭，搅拌，过滤，滤液减压回收乙醇得浸膏，加水溶解，使每1ml含1g药材，离心，取上清液，通过D101大孔树脂，先用5-15％乙醇洗脱3-5倍树脂体积进，再用50-90％乙醇洗脱4-6倍树脂体积，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得以黄藤素为主要成分的组合物。
(2)取以黄藤素为主要成分的组合物，用甲醇溶解，通过ODS常压色谱柱，以乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，分离得到黄藤素。

6.  根据权利要求1-5所述黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物，其特征在于：可以制成口服制剂，选自于片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的任何一种。

说明书黄藤素及其组合物的制备方法及医药新用途
技术领域
本发明是关于从黄藤及同属植物中提取的黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物在制备具有防治老年痴呆的药物中的应用。也涉及该药物的药物制剂，本发明属于医药技术领域。
背景技术
老年性痴呆是以进行性记忆损伤以及智力丧失、抽象思维障碍、语言能力失常、认知功能障碍、意识障碍、生活自理能力及社会活动能力下降甚至丧失为特征的进行性大脑退行性疾病。其发病机理不清楚，是一种非常复杂的神经和细胞衰老过程。因此老年性痴呆的预防和治疗目前仍是一个世界难题。目前临床治疗药物可分为抗β-淀粉样蛋白沉积药物、拟胆碱药物、促乙酰胆碱释放药物、细胞生长因子促进剂和脑功能改善药物等。已上市或正在进入临床研究的药物有乙酰卡尼汀、他可林、维那克林、水飞蓟素、毒扁豆碱、盐酸多奈哌齐等。已上市的药品毒副作用都较大，故此研究开发毒副作用小、安全有效的抗老年痴呆药物具有重要意义。
黄藤(Fibraurea recisa Pierre)属于防己科(Menispermaceae)天仙藤属(Fibraurea Lour.)植物，其干燥的藤茎又称黄莲藤、大黄藤、金锁匙、土黄莲等，集中分布在热带和亚热带地区，常见于海拔180-1000米的山野沟谷中。我国主要分布在云南、广西等地，毗邻的缅甸、越南、老挝、柬埔寨等国也有分布。黄藤富含生物碱、内酯类等活性天然化合物，是当地少数民族常用的中药和天然染料。其药用 始见于《本草纲目》：“黄藤生岭南，状若防己，俚人常服此藤，纵饮食有毒，亦自然不发。气味甘苦平无毒”。其具有清热解毒、利尿、抗菌、消炎等药效，而且能够防治多种感染性疾病，如皮肤病、恶性疟疾等。经现代药理学研究证明其主要药效活性成分为异喹啉类生物碱：黄藤素、药根碱等，在1977年载入《中国药典》，主治上呼吸道感染、急性扁桃体炎、结膜炎、胃肠炎、急性盆腔炎、阴道炎等。但到目前为止，在国内外尚未见到从黄藤中提取的黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物用于预防和治疗老年痴呆症的报道。本发明具有广泛的应用前景。
黄藤素(fibrauretin)的结构式

发明内容
本发明目的之一是提供黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物在治疗和预防老年痴呆症中的应用。具体的说是黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物用于制备防治老年痴呆药物的新用途。黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物经酶学研究表明，均具有明显抑制乙酰胆碱酯酶的活性；经动物试验证明，均具有显著改善痴呆小鼠学习记忆功能，并能明显提高SOD的活性，降低MDA的含量。并且研究表明，黄藤素较以黄藤素为主要成分的组合物具有更强的药理活性。
本发明的另一目的是，提供了以黄藤素为主要成分的组合物在制备具有防治老年痴呆药物中的应用，组合物主要含有黄藤素、药根碱、千金藤碱、千金藤宁碱和小檗碱。更确切的说，黄藤素占50-85％，药根碱占1-5％，千金藤碱占0.5-4％，千金藤宁碱占0.5-3％，小檗碱占0.2-3％，组合物中总生物碱的含量不低于95％。
本发明首次采用大孔树脂分离黄藤生物碱组合物、采用常压ODS柱分离黄藤素，没有利用三氯甲烷、苯、乙醚、甲醇等有毒的有机试剂分离纯化黄藤素生物碱组合物，只是利用酸性乙醇提取，树脂分离，可以大量制备，并且可操作性强，对环境的污染小，具有明显的技术进步和创新性。
本发明的突出贡献在于：本发明出乎意料的发现，黄藤素具有很强的防治老年痴呆的作用。由于黄藤素为主要原料的制剂收载于中国药典，已经有二十多年的应用历史，证明无任何毒副作用，所以本发明具有开发成防治老年痴呆新药的优越性。
本发明的另一突出贡献在于：本发明出乎意料的发现，黄藤素及组合物具有很强的防治老年痴呆的作用，较小檗碱及药根碱具有更强的药理活性，并且黄藤素体外抑制乙酰胆碱酯酶的活性是阳性对照药盐酸多奈哌齐的20倍，黄藤素组合物体外抑制乙酰胆碱酯酶的活性是阳性对照药盐酸多奈哌齐的14倍，本发明为老年痴呆患者提供一种新的化合物及药用组合物，具有明显的创新性及适用性，也说明了本发明组合物主要活性成分是黄藤素。
本发明还提供了黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物的药物 制剂。主要是口服制剂，主要选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、口服制剂中的任何一种。
本发明的另一目的是提供了黄藤素及黄藤素为主要成分的组合物的制备方法，其特征在于：
(1)黄藤粗粉用含乙酸或甲酸的60-95％乙醇回流提取3次，每次2-3小时，合并提取液，加入药液体积0.1％-1％活性炭，搅拌，过滤，滤液减压回收乙醇得浸膏，加水溶解，使每1ml含1g药材，离心，取上清液，通过D101大孔树脂，先用5-15％乙醇洗脱3-5倍树脂体积进，再用50-90％乙醇洗脱4-6倍树脂体积，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得以黄藤素为主要成分的组合物。
(2)取以黄藤素为主要成分的组合物，用甲醇溶解，通过ODS常压色谱柱，以乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，分离得到黄藤素。
为了实现以上技术方案，黄藤素的含量通过以下方法测定：
色谱条件：色谱柱:ZORBAX SB C18柱(250mm*4.6mm，35μm)；柱温：30℃；流动相:乙腈：0.4％磷酸溶液(42:68)；流速：1.0mL/min，检测波长：345nm；进样量:10μL。
对照品溶液的制备：精密称取黄藤素对照品适量，加甲醇溶解，定容，配成0.05mg/mL的溶液。
供试品溶液的制备：精密称取组合物约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇超声溶解溶定容至刻度，精密量取1ml置10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度。
进样测定，计算黄藤素的含量。
总生物碱的含量通过一下方法进行测定：
对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的黄藤素对照品4.05mg，置100ml容量瓶中，加pH4.0枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解，并稀释至刻度，摇匀即得浓度为0.0405mg/ml的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本发明组合物10mg，精密称定，置250ml容量瓶中，加pH4.0枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解，并稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液。
精密吸取黄藤素对照品溶液1ml及供试溶液1.0ml各加pH4.0枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液至2ml。加入0.05％溴草酚绿溶液1.5ml，三氯甲烷10ml，振摇3min，静止0.5h后，分取三氯甲烷液，另取枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液2ml同法操作所得三氯甲烷液作为空白液，在417nm处测定吸光度值，计算总生物碱的含量。
黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物(简称组合物)具有预防和治疗老年痴呆疾病的作用，这些药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。
黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物均由吉林省中医药科学院提供；阳性对照药盐酸多奈哌齐由卫材药业有限公司制造(140322A)。小檗碱及药根碱购自中国食品药品检定研究院，乙酰胆碱酯酶由上海源叶生物科技有限公司生产(≥200U/g)。
1、黄藤素、以黄藤素为主要成分的组合物对乙酰胆碱酯酶抑制活性
0.05M(pH＝7.8)的Tris-HCl缓冲液的配制：精密称6.0501g Tris 碱于1L烧杯中，加入约800mL蒸馏水溶解，连接pH计，不断加入少许浓盐酸，充分搅拌后测定pH值，最后调至pH＝7.80然后转移至1L容量瓶中，烧杯及玻璃棒用少许蒸馏水洗涤3次，一同转入容量瓶中，最后定容至1L。
0.2M的Na2HPO4溶液：称Na2HPO4·12H2O共7.164g加水溶解至100mL。
0.2M的NaH2PO4溶液：称NaH2PO4·2H2O共3.121g加水溶解至100mL。
0.1M的pH＝7.0的PBS：取39mL 0.2M NaH2PO4溶液和61mL0.2M的Na2HPO4，充分混合即为0.2M PH＝7.0的PBS，将此液稀释1倍，即为0.1M pH7.0的PBS。
0.1M的pH＝8.0的PBS：取5.3mL 0.2M NaH2PO4溶液和94.7mL0.2M Na2HPO4溶液，充分混合即为0.2M PH＝8.0的PBS，将此液稀释1倍，即为0.1M pH＝8.0的PBS。
乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液的配制：100U的乙酰胆碱酯酶被溶解于50mL的Tris-HCl(0.05M，pH＝7.8)缓冲液中，再加入50mg的小牛血清蛋白稳定酶液，即得2U/mL的酶溶液。2U/mL的酶液用pH＝8.0的PBS稀释成0.5U/mL的酶液供Ellman法使用。
2mM DTNB的配制：3.96mg DTNB先用500μL的无水乙醇溶解，再加1.5mg NaHCO3，然后用pH＝7.0的PBS定容到5mL。
15mM ATCI的配制：21.67mg ATCI加蒸馏水溶解并定容至5mL。4℃冰箱保存。
盐酸多奈哌齐溶液的配置：10mg的盐酸多奈哌齐溶解在5mL的pH＝8.0的PBS中，充分震荡配成2mg/mL的溶液，然后依次用pH＝8.0的PBS稀释成0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL的待用溶液。
待测样液的配置：取黄藤素、以黄藤素为主要成分的组合物、小檗碱、药根碱，准确称重，用pH＝8.0的PBS溶液溶解配成浓度为2mg·mL-1的溶液，然后用pH＝8.0的PBS稀释成0.001mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL 0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL的待用溶液。
样品孔：在酶标板小孔中加入140μL PBS缓冲液(0.1M，pH＝8.0)，20μL待测样品溶液和15μL酶溶液，混合均匀后在4℃保存20min。取出加入10μL DTNB(2mM)和10μL ATChI(15mM)，在37℃反应20min后即可在405nm读取吸光度值。
样品本底对照孔：用15μL PBS缓冲液代替15μL酶溶液，其它条件不变。
空白对照孔：用20μL PBS缓冲液代替20μL待测样品溶液，其它条件不变。
实验结果见附图1-5。
图1是阳性对照药抑制乙酰胆碱酯酶抑制曲线图
图2是黄藤素抑制乙酰胆碱酯酶抑制曲线图
图3是组合物抑制乙酰胆碱酯酶抑制曲线图
图4是小檗碱抑制乙酰胆碱酯酶抑制曲线图
图5是药根碱抑制乙酰胆碱酯酶抑制曲线图
根据抑制曲线可知，黄藤素及以黄藤素为主要成分的组合物较阳性对照药盐酸多奈哌齐具有更强的抑制活性。阳性对照药盐酸多奈哌齐的IC50为0.091mg/mL，黄藤素IC50为0.0037mg/mL，组合物的IC50为0.0062mg/mL，小檗碱IC50为0.139mg/mL，药根碱的IC50为0.090mg/mL。
说明黄藤素的活性最好，组合物次之，小檗碱及药根碱也具有一定的抑制乙酰胆碱酯酶的活性，但是活性较黄藤素及本发明组合物相差很多。
2、黄藤素及组合物对AlCl3致小鼠记忆障碍的影响
取小鼠90只，随机分成9组，按表1分组。第1天至第7天，对照组每天皮下注射生理盐水，其余各组小鼠皮下注射AlCl350mg/kg。用药组分别连续灌胃给药2周。进行避暗试验，记录3min内小鼠进入暗室的错误次数，24h后以错误次数及错误百分率测验记忆成绩。实验结果见表1。
表1、黄藤素及组合物对AlCl3致小鼠记忆障碍的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；△与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.0l
说明黄藤素与组合物不同计量对AlCl3致记忆障碍均有不同程度的对抗效果。减少小鼠的错误发生次数及错误发生率。相同剂量条件下，黄藤素较组合物具有较好的活性。在相同剂量下，小檗碱集药根碱较黄藤素及组合物活性较差。
3、黄藤素及组合物对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响
取小鼠90只，随机分成9组，按表2分组。第1天至第7天，对照组及模型组给蒸馏水，其余各组按表2给药。每天一次，连续7天，末次给药1h后，正常组给生理盐水0.1ml/10g，其余各组给氢溴酸东莨菪碱3mg/kg，10min后进行跳台实验，训练3min，24h后进行测试成绩。结果见表2。
表2、黄藤素及组合物对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；△与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.0l
氢溴酸东莨菪碱组小鼠错误次数较正常组显著增加，用药组明显减少了小鼠的错误次数，对氢溴酸东莨菪碱组所致的小鼠记忆障碍有明显的对抗作用。明显减少小鼠的错误发生次数及错误发生率。相同剂量条件下，黄藤素较组合物具有较好的活性。在相同剂量下，小檗碱集 药根碱较黄藤素及组合物活性较差。
4、黄藤素及组合物对30％乙醇致小鼠记忆障碍的影响
取小鼠90只，随机分成9组，按表3分组。第1天至第7天,对照组及模型组给蒸馏水，其余各组按表3给药。每天一次，连续7天，末次给药1h后，正常组给生理盐水0.1ml/10g，其余各组给30％乙醇，15min后进行跳台实验，测试记录5min内每之小鼠的错误次数。结果见表3。
表3、黄藤素及组合物对30％乙醇致小鼠记忆障碍的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；△与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.0l
30％乙醇组小鼠错误次数较正常组显著增加，用药组除小剂量总黄酮外，其余各组对30％乙醇所致的小鼠记忆障碍有明显的对抗作用。相同剂量条件下，黄藤素较组合物对30％乙醇所致的小鼠记忆障碍对抗作用更强。在相同剂量下，小檗碱集药根碱较黄藤素及组合物活性较差。
5、黄藤素及组合物对老年痴呆模型小鼠脑线粒体超氧化物歧化酶SOD活性、丙二醛(MDA)含量及脑系数的影响。
取小鼠90只，随机分为正常对照组和模型组。模型组给A1C13溶 液，开始70天按400mg/kg/d灌胃，以后一直用2g/L A1C13溶液饮用；正常对照组灌胃等量的蒸馏水。将模型组随机分为8组，按表4所示，灌胃给药60天，正常对照组痴呆模型组灌以量的蒸馏水。整个实验过程避免与铝制品接触。处死小鼠，于冰浴中迅速取出脑组织，并精确称取，分别测定SOD、MDA和计算脑系数。实验结果见表4。
表4、黄藤素及组合物对老年痴呆模型小鼠脑SOD活性、MDA含量及脑系数的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；△与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.0l
模型对照组脑SOD活性降低，MDA含量增加，脑系数减少(P<0.05)。与模型组比较，黄藤素高、中、低剂量组SOD活性升高，MDA含量降低，组合物高、中剂量组SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)，说明黄藤素及组合物具有明显的抗氧化作用，改善自由基在体内的过量代谢。增加SOD含量，增强抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制过氧化反应，抑制过氧化产物MDA产生及清除过量的MDA的作用，黄藤素较组合物对脑系数增加显著，从而说明具有更强抗脑萎缩的作用。在相同剂量下，小檗碱集药根碱较黄藤素及组合物活性较差。
6、黄藤素及组合物对老年痴呆模型乙酰胆碱含量的影响。
取小鼠90只，随机分为正常对照组和模型组。模型组给A1C13溶液，开始70天按400mg/kg/d灌胃，以后一直用2g/L A1C13溶液饮用；正常对照组灌胃等容的蒸馏水。将模型组随机分为8组，按表5所示，灌胃给药60天，正常对照组痴呆模型组灌以等体积的蒸馏水。整个实验过程避免与铝制品接触。大鼠断头处死，迅速开颅剥离脑组织(去除小脑组织)，取部分脑组织生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，加入冷生理盐水放入匀浆管在冰浴中充分研碎，制成10％的脑匀浆，离心，取上清用比色法测定脑组织乙酰胆碱酶含量。实验结果见表5。
表5、黄藤素及组合物对老年痴呆模型乙酰胆碱含量的影响(n＝10，X±S)

*与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；△与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.0l
各治疗组和模型组比较，乙酰胆碱含量降低，并有显著性差异。相同剂量下，黄藤素较组合物对乙酰胆碱的含量影响更显著。在相同剂量下，小檗碱集药根碱较黄藤素及组合物活性较差。
本发明是通过如下的实施例得以实现(证实)
具体实施方式
实施例1、组合物的提取制备
黄藤药材5kg粉碎成粗粉，用含2％冰乙酸的70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，加入药液体积0.2％活性炭，搅拌，过滤，滤液减压回收乙醇得浸膏，加水溶解，使每1ml含1g药材，离心，取上清液，通过D101大孔树脂，先用10％乙醇洗脱5倍树脂体积，再用60％乙醇洗脱5倍树脂体积，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得以黄藤素为主要成分的组合物。组合物中黄藤素含量为
78.5％。总生物碱的含量为97.8％。
实施例2、黄藤素的制备
取以黄藤素为主要成分的组合物100mg，，用甲醇溶解，通过ODS常压色谱柱，以乙腈-0.4％磷酸溶液(42:68)为流动相洗脱，合并黄藤素组分，重结晶得到黄藤素。