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1、(10)申请公布号 CN 102750459 A (43)申请公布日 2012.10.24 C N 1 0 2 7 5 0 4 5 9 A *CN102750459A* (21)申请号 201210195233.2 (22)申请日 2012.06.14 G06F 19/16(2011.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 31/20(2006.01) (71)申请人辽宁大学 地址 110136 辽宁省沈阳市沈北新区道义南 大街58号 (72)发明人芦秀丽 高兵 张勇 陈树超 刘汀 贾丹 (74)专利代理机构沈阳杰克知识产权代理有限 公。
2、司 21207 代理人金春华 (54) 发明名称 一种以人乳头瘤病毒HPV的DNA解旋酶E1为 靶点的抗HPV病毒药物的虚拟筛选方法 (57) 摘要 本发明涉及一种以人乳头瘤病毒HPV的DNA 解旋酶E1为靶点的抗HPV病毒药物的虚拟筛选方 法。包括以下步骤：1）确定E1蛋白结构的PDB结 构数据；2）采用分子对接软件，依据E1的活性氨 基酸残基位点确定活性中心，设定活性口袋；3） 对小分子配体进行筛选；4）建立对接用小分子配 体数据库；5）根据设定的活性口袋，利用分子对 接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子 配体与活性口袋一一做对接；6）根据对接结果的 排序，初步确定具有抗宫颈癌效果的。
3、先导药物。采 用本发明可在短时间内获得活性化合物的线索， 然后再利用动物水平筛选或者高通量细胞平台筛 选具有抗宫颈癌药物，大大提高了速度和效率，缩 短新药研究周期。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 4 页 1/1页 2 1.一种以人乳头瘤病毒HPV的DNA解旋酶E1为靶点的抗HPV病毒药物的虚拟筛选方 法，其特征在于：包括以下步骤： 1）确定E1蛋白结构的PDB晶体结构数据； 2）采用分子对接软件，依据E1的活性氨酸残基位点确定分子对接的活性中心，设定活 性口袋；。
4、 3）对小分子配体进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选； 4）建立对接用小分子配体数据库； 5）根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子 配体与活性口袋一一做对接； 6）根据对接结果的排序，小分子配体与活性中心的相互作用方式，进行综合评价，初步 确定具有抗HPV病毒效果的先导药物。 2.按照权利要求1所述虚拟筛选方法，其特征在于：步骤3）置于步骤1）至步骤6）任 何一个步骤之前。 3.按照权利要求1或2所述的虚拟筛选方法筛选出的抗HPV病毒药物在制备预防和治 疗宫颈癌和尖锐湿疣药物中的应用。 权 利 要 求 书CN 102750459 A 1/7页 3 一种。
5、以人乳头瘤病毒 HPV 的 DNA 解旋酶 E1 为靶点的抗 HPV 病毒药物的虚拟筛选方法 技术领域 0001 本发明涉及药物筛选方法，尤其涉及以HPV E1为靶点、利用分子对接进行的新型 抗HPV病毒药物的虚拟筛选方法。 背景技术 0002 宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的疾病，每年约有50万新发病例，25万人死 亡，是引起妇女死亡的第二大原因，其中大部分在发展中国家，占80%左右。宫颈癌是我国 女性生殖道恶性肿瘤中发病率最高的一类肿瘤。据统计，我国每年新发宫颈癌病例约13.5 万人，其中约5万人因此丧生，使广大妇女的身心健康和生命安全受到严重威胁。1977年德 国学者Zur Hausen。
6、等从宫颈癌标本中发现了人乳头状病毒（human papillomavirus，HPV） DNA，推测HPV感染与宫颈癌发生有关(Zur H.at el.,Cancer Res,1976,36: 530.)。进一 步的分子流行病学证据表明，HPV与人类多种癌症，特别是与宫颈癌有着密切的关系。由国 际癌症研究机构（IARC）组织在22个国家进行了针对引起侵袭性宫颈癌（ICC）的HPV类型 的调查。组织学确诊为ICC的1000个病例中有99.7%发现HPV DNA阳性， 其中HPV的类 型主要为HPV16（53%）和HPV18（15%）。由于HPV与多种癌症有关，对人类危害极大，预计 抗HPV病毒药。
7、物将成为今后的研发和市场热点，受到更多关注。 0003 传统的药物筛选无论是动物水平筛选还是高通量细胞平台筛选，都存在着天然药 物及食物成分复杂，从确认提取物有潜在功效到确定有效成分，到最终分离出单体成分需 要花费大量的人力、时间和精力，效率极低。因此，近年来虚拟筛选方法发展和在新药研究 中的应用受到了广泛的重视。于是建立一套高效、有效、速效抗HPV病毒药物和防治宫颈癌 药物筛选体系成为当务之急。 发明内容 0004 本发明的目的是建立一种新颖，快速，高效的一种以人乳头瘤病毒HPV的DNA解旋 酶E1为靶点的抗HPV病毒药物的虚拟筛选方法，以丰富现有的筛选方法。 0005 本发明利用先进的计算。
8、机虚拟筛选技术，结合HPV药物体外细胞模型筛选方法， 旨在发现一批能有效结合HPV E1蛋白（HPV基因组编码的蛋白中唯一的酶类蛋白，具有ATP 依赖的 DNA解旋酶活性）的活性部位从而抑制其ATP依赖的解旋酶活性的药物，从而阻断 HPV病毒的复制进而达到预防以及治疗宫颈癌以及其他HPV病毒感染所致疾病的目的。 0006 本发明，利用计算机进行药物虚拟筛选最关键的是基础理论研究的可靠性以及相 关靶点的选择。所有的乳头瘤病毒都含有一个小的环状的双链只能编码八个特异性蛋白的 DNA（如图1所示）。众多的高度保守的蛋白中，只有E1解旋酶具有酶活性。E1蛋白约68kDa， 在HPV阳性细胞中低水平表达。
9、，其主要的生化特性是具有ATP酶和3 5解旋酶活性，能 够识别HPV的复制起点。E1蛋白识别并结合到富含AT的HPV复制起点序列，在E2蛋白的 配合下，解除HPV 的DNA超螺旋，让复制复合物进入并启动DNA复制。因为E1是病毒复制 说 明 书CN 102750459 A 2/7页 4 和发病机制的根本，所以在抗HPV病毒药物的研究中，E1是具有较大吸引力的靶点。这一 点在白尾野兔乳头瘤病毒模型中已经得到验证(Wu, X., W. Xiao, and J. L. Brandsma. 1994; J. Virol. 68:60976102)。 0007 E1是乳头瘤病毒的复制解旋酶，与E2协同作。
10、用后结合到复制起始点。两者的结合 不仅仅影响了两个蛋白结合到特殊DNA元件的能力，也包括两者在E2 N端激活区和E1 ATP 酶/解旋酶功能域的关联作用。最近报道了一系列的结合到E2 激活区的和阻止与E1关联 的HPV DNA复制的抑制剂。E1-E2的复杂的结合能推进E1分子复合物聚集到起点从而形成 六聚物，当ATP结合时发生应激反应。这些六聚物能催化E1的激活型从而在复制叉前解旋 病毒DNA。作为众多解旋酶中的一例，E1的DNA解旋活性能被ATP的水解产生动力。最近 的通过杆状病毒群表达模型做出了一些具有酶活性的特异性的高纯度的HPV6-11型E1蛋 白。这些研究表明了HPV6-11中的E1。
11、蛋白对于ATP有相似的KM值，结合到E2上的半个E1 的C端组成了核苷三磷酸酶和解旋活性。更有趣的是，E2通过提高其ATP的KM值七倍进而 阻碍E1的核苷三磷酸酶活性。但是，也发现ATP能通过E1-E2之间蛋白相互作用而影响到 两者结合到起点的能力。这一结果表明ATP不仅仅能激活E1的解旋酶活性，也能够作为一 个在引起DNA复制的过程中帮助分割E1-E2关联作用进而在起始位点形成六聚物的一个分 子感应器。进一步的研究发现，位于589位的精氨酸指（Arginine Finger）在E1发挥ATP 酶活性上具有重要作用，而且R589在HPV6,11,16,18中高度保守。另外，现在已经发现， Bi。
12、phenylsulfonacetic Acid的一系列衍生物可以通过作用于HPV6 E1蛋白486位上的酪 氨酸（Y486）而变构性地发挥抑制其ATP酶活性进而抑制其解旋酶活性的作用，而且该类化 合物对于在E1蛋白具有高度保守的Y486的 HPV18也能发挥显著的ATP酶抑制活性（HPV6 的E1蛋白保守残基Y486在HPV18为Y492），提示Y486及其附近区域可能是ATP酶抑制剂 发挥生物活性的活性中心（ATP结合位点为Lys482，HPV18E1为Lys490）。在了解以上的作 用机理后，我们运用分子对接方法，以HPV18 E1与E2蛋白复合物的六聚体的三维立体结构 数据（PDB ID。
13、: 1TUE）为基准，分别以ATP酶功能域中高度保守的活性残基R589以及Y492 为筛选的活性中心，从天然产物数据库和中草药数据库中筛选出具有E1蛋白ATP酶抑制活 性，从而抑制HPV病毒复制的候选药物，并且以HPV感染HaCAT人永生化角质细胞为模型确 认候选药物的抗HPV复制的作用，产生了一系列新型抗HPV病毒先导化合物，预期在防治宫 颈癌以及其他HPV感染疾病方面发挥重要作用。 0008 基于上述机理，本发明的构思如下：本发明中，选用国际天然产物数据库(Dunkel M, at el., Nucleic Acids Res 2006; 34 (Database issue):D678-。
14、D683)及中国天然产 物数据库，首先利用internet蛋白质三级结构数据库中下载HPV18 E1 ATP酶的蛋白晶体 三级结构数据，该三级结构中含有HPV18 E1蛋白的ATP酶功能域。以此为基础，利用国际上 应用最为广泛的分子对接软件Autodock4.2 软件，以E1蛋白的Y492为活性中心构建活性 口袋，通过虚拟筛选和精确对接两种方法，从几万种天然产物中筛选出与该活性口袋对接 较好的分子，并与联苯磺化乙酸类化合物作为对接分子的阳性对照，确定出一批具有抗HPV 活性的先导化合物，再以人永生化上表皮细胞株HaCaT细胞的细胞平台的高通量筛选进行 进一步验证。筛选结果初步证实，本方法丰富了。
15、抗HPV病毒药物筛选技术，具有快速、高效 的特点。 0009 本发明提供的一种以人乳头瘤病毒HPV的DNA解旋酶E1为靶点的抗HPV病毒药 说 明 书CN 102750459 A 3/7页 5 物的虚拟筛选方法，包括以下步骤： 1)确定E1蛋白结构的PDB结构数据； 2)采用分子对接软件，依据E1的活性氨基酸残基位点确定活性中心，设定活性口袋； 3)对小分子配体进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选； 4)建立对接用小分子配体数据库； 5)根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子 配体与活性口袋一一做对接； 6)根据对接结果的排序，小分子配体与活性中心的相互作。
16、用方式，进行综合评价，初步 确定具有抗HPV病毒效果的先导药物。 0010 上述的虚拟筛选方法：步骤3）置于步骤1）至步骤6）任何一个步骤之前。即：可 以对尚未进行分子对接或者已经对接后的小分子数据库中的小分子配体进行毒性、类药性 情况进行筛选，而不受排序限制。 0011 上述虚拟筛选方法，所述的E1蛋白的分子对接活性中心，可以是E1蛋白做为DNA 解旋酶的酶活性中心。 0012 上述虚拟筛选方法，所述的E1蛋白的分子对接活性中心，可以是E1蛋白做为DNA 解旋酶的变构中心。 0013 上述虚拟筛选方法，所述的E1蛋白的分子对接活性中心，可以是E1蛋白做为DNA 解旋酶的影响酶活性的其他氨基酸。
17、残基。 0014 本发明的有益效果是：本发明通过药物的虚拟筛选，可以在短时间内获得活性化 合物的线索，将研究目标从几百万个化合物集中到几百个化合物，而且，虚拟筛选的阳性率 （5%30%）远远高于高通量实验筛选（0.01%0.1%）。然后再从虚拟筛选后的先导化合 物中，利用动物水平筛选或者高通量细胞平台，筛选具有抗宫颈癌药物，因此大大提高了筛 选化合物的速度和效率，缩短新药研究的周期。 附图说明 0015 图1 HPV病毒的基因组结构和开放阅读框架（以HPV11为例）。 0016 图2 HPV18 E1的蛋白质一级结构序列。 0017 图3 E1的活性功能域的蛋白质三级结构模式图。 0018 图。
18、4 小分子配体对接程序中使用的SHELL脚本。 0019 图5A 化合物2-(4-phenylphenyl) sulfonylacetat的结构式。 0020 图5B 化合物2 (4-2-oxo-2-(phenylamino)ethylbiphenyl-4-ylsulfonyl) acetic acid的结构式。 0021 图5C 化合物3(3-(2-methylbenzyl)carbamoylbiphenyl-4-ylsulfonyl) acetic acid的结构式。 0022 图6A阳性对照分子2-(4-phenylphenyl)sulfonylacetate与E1活性中心的成簇 分析及。
19、相互作用图。 0023 图6B阳性对照分子2 (4-2-oxo-2-(phenylamino)ethylBiphenyl-4-yl sulfonyl)acetic acid与E1活性中心的成簇分析及相互作用图。 0024 图6C阳性对照分子3 (3-(2-methylbenzyl)carbamoylbiphenyl-4-yl 说 明 书CN 102750459 A 4/7页 6 sulfonyl)acetic acid与E1活性中心的成簇分析及相互作用图。 0025 图7A (3-2-(1S)-2,3-dihydro-1H-inden-1-ylamino-2-oxoethyl biphenyl。
20、-4-yl) sulfonyl acetic acid的结构式。 0026 图7B(3-2-(1S)-2,3-dihydro-1H-inden-1-ylamino-2-oxoethyl biphenyl-4-yl) sulfonyl acetic acid与E1活性中心的成簇分析及相互作用图。 0027 图8 (3-2-(1S)-2,3-dihydro-1H-inden-1-ylamino-2-oxoethyl biphenyl-4-yl) sulfonyl acetic acid对HPV-DNA复制抑制效果检测。 具体实施方 式 0028 以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发。
21、明，但不以任何形式 限制本发明。 0029 实施例1以HPV18 E1蛋白的酪氨酸残基Y492为活性位点，进行抗宫颈癌药物的 虚拟筛选。 0030 （一）虚拟筛选步骤如下： 1、Protein Data Bank中HPV18 E1蛋白三维晶体结构的获得 利用Protein Data Bank（PDB）数据库，从中将我们实验所需的HPV18 E1蛋白三维晶 体结构（图3）下载下来，并获得E1蛋白的氨基酸序列（FASTA格式，图2），从而进行下步运 算。 0031 2、采用Autodock分子对接软件，依据E1的活性酪氨酸残基位点Y492确定活性中 心，设定活性口袋 本步骤中，首先利用已知的可与E。
22、1的活性酪氨酸残基位点Y492发生加成反应的分子 做阳性对照分子，依据其在以活性位点Y492为中心构建的活性口袋中与口袋相互作用的 结合能及簇的分布情况为标准，确定E1蛋白中以Y492为中心的活性口袋的大小。 0032 2.1利用Autodock分子对接软件进行分子对接计算的程序设置 主要步骤如下： 1)将步骤1中，E1活性功能区域的蛋白质三级结构在MGLTools中进行处理。主要包 括去除水分子，加非极性氢，加上Gasteiger电荷。最后保存为1TUEforMD.pdbqt。 0033 2)计算格点能量 (AutoGrid)，在Grid Set Map Types Directly 中把要。
23、进 行格点能量计算的原子类型输入进去。运行AutoGrid，完成之后会生成一系列文件，主要为 每个原子的map文件。 0034 3)为每个小分子配体准备对接所需的文件夹，这个过程要使用SHELL脚本实现 （图4）。先制作一个小分子配体的列表文件ligands.list，然后按照图4所示的SHELL脚本 的命令依次输入命令运行脚本a.csh； 完成上面的操作后就会为每个小分子配体生成一 个文件夹，该文件夹包含对接所需的所有文件：配体、受体、AutoGrid产生的map文件、dpf 文件等。下一步即可以对接。 0035 4)循环运行AutoDock：循环运行AutoDock，对接每一个小分子配体，。
24、并提取结合 能等对接结果并对对接结果排序。这个脚本可以同时运行多个，互不干扰，因此可以完全利 用计算机资源。 0036 5)提取对接结果：最后得到summary.sort：虚拟筛选至此做完。 说 明 书CN 102750459 A 5/7页 7 0037 2.2以 E1的活性酪氨酸残基位点Y492为活性中心，设定活性口袋 以E1蛋白的Y492为活性中心，以三种已知与Y492活性中心发生相互作用的化合物 小分子，(1) 2-(4-phenylphenyl)sulfonylacetate；（2）2(4-2-oxo-2-(phenylamino) ethylbiphenyl-4-yl sulfony。
25、l) acetic acid；(3) 3 (3-(2-methylbenzyl) carbamoylbiphenyl-4-ylsulfonyl)acetic acid；为阳性对照分子，三个阳性对照分子 的结构式分别如图5A、图5B和图5C所示。调整活性口袋的大小，进行分子对接，从而确定 活性口袋的大小。确定活性口袋大小原则为综合考察评价使阳性对照分子与E1蛋白的相 互作用的结合能和构象簇的集中情况。 0038 对接采用计算机广泛应用的Lamarckian遗传算法（LGA），每个配体产生50个对接 构象，ga_pop_size 设为300 ga_num_evals设为250000，其余参数采用程。
26、序默认值。对 接时小分子配体可以自由转动，蛋白质分子则被固定。计算结束后以RMSD值作为聚类分析 的依据。 0039 根据反复验证，我们最终确定了活性口袋的设置条件。具体如下：以E1的活性 酪氨酸残基位点Y492为活性中心的活性口袋：中心坐标为x为28.807、y为32.339、z为 125.869，网格大小值为645044，步长（spacing）为0.375nm。 0040 下面是在确定的这一活性口袋下，三个阳性对照分子在活性口袋中与活性中心及 周围基团相互作用的分析。 0041 作用图截取簇中构象数大且结合能也较高的进行分析，结果如图6所示。 0042 通过观察这三个参照分子的对接结果可得。
27、出如下结论：binding energy值较高， 大概处于-7左右，结合能较强，配体分子能较好的与受体分子结合。通过以上阳性对照，确 定了上述以E1蛋白中Y492为活性中心的活性中心及活性口袋设置的合理性，可以进行下 一步的小分子配体筛选。 0043 3、对小分子配体进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选 在正式对接前对小分子配体数据库中的小分子配体进行筛选。筛选项目为毒性筛选、 类药性筛选。 0044 小分子配体数据库选定免费的国际天然产物数据库（http:/bioinformatics. charite.de/supernatural/），该数据库中含有45917种目前国际上已经报道过的。
28、并且是 容易从公司购买得到的天然有机化合物的结构数据。 0045 3.1毒性筛选：运用化合物毒性预测软件Osiris对小分子配体数据库中的小分子 配体进行毒性预测，淘汰毒性预测结果显示阳性的分子。 0046 3.2 类药性筛选：运用 ADME（药代动力学）预测软件或相关软件的ADME预测功能 计算小分子配体数据库中各个小分子配体的类药性指数，指标包括多项，比如：分子量、氢 键受体、氢键给体、可旋转键数、脂水分配系数、水溶性指数、分子极性表面积、分子体积、基 于经验的药物类似性指数、化学焓变指数（分子稳定性指数）。依据各指数反映的分子类药 性优劣，再给予各指数以优劣评分，指数最优者为1，指数最劣。
29、者为0。将每个分子的10项 指数优劣性评分加和，得出总类药性评分。 0047 4、建立对接用小分子配体数据库 综合步骤3中的毒性筛选结果，类药性评估结果的小分子配体的搜索结果，建立适用 于本筛选目的对接用小分子配体数据库。 说 明 书CN 102750459 A 6/7页 8 0048 5、根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小 分子配体与活性口袋一一做对接 根据上述步骤确定的活性口袋及对接用小分子配体数据库，运行2.1中设置的分子对 接程序。将小分子配体与活性口袋一一做对接，确定先导药物。分为大批量筛选与精确筛 选两个步骤。 0049 大批量筛选：设置Autod。
30、ock中的参数ga_num_evals=2500000及ga_run=10，运行 2.1中设置的分子对接程序，进行一一对接。 0050 当然也可依据构建的或选定的其它小分子配体数据库的大小进行ga_num_evals 及ga_run的设置。 0051 精确筛选：将Autodock软件中的ga_num_evals 和ga_run参数设置到最高，即 ga_num_evals=250000，ga_run=50，运行2.1中设置的分子对接程序，进行精确筛选。 0052 6、根据对接结果的排序，初步确定具有抗HPV病毒复制效果的先导药物 经过第5步的精确筛选，获得对接后小分子配体数据库，根据对接结果的排。
31、序，初步确 定具有抗HPV病毒复制效果的先导药物。 0053 当然，为了进一步缩小先导药物的个数还可以采用：综合评价对接结果的排序，小 分子配体药效团含有情况以及小分子配体与活性中心的相互作用方式，来确定具有抗HPV 病毒复制效果的先导药物。 0054 经过以上筛选，初步确定与E1蛋白Y492活性中心结合的结合能在-7左右的具有 较强结合能力的先导化合物200余个，其中包含与阳性对照分子具有相同母核的化合物， 这为进一步的抗HPV病毒复制药物活性筛选极大地缩小了范围。 0055 （二）利用细胞筛选平台筛选具有抗HPV病毒复制效果的先导药物。 0056 通过上述的虚拟筛选，从免费的天然产物数据中。
32、筛选出一批与E1蛋白的Y492为 中心构建的活性口袋相互作用较好的候选化合物。然后根据从临床分离HPV6病毒并培养， 加入药物后，进一步验证候选化合物的抗病毒效果。 0057 我们从虚拟筛选后的候选化合物中，挑选结合能在-7左右和作用方式与阳性对 照药类似的候选药物，(3-2-(1S)-2,3-dihydro-1H-inden-1-ylamino-2-oxoethyl biphenyl-4-yl)sulfonylacetic acid，分子结构式如图7A所示，其与E1蛋白的Y492活 性中心相互作用情况如附图7B所示。选用该化合物进行如下体外抗病毒实验。 0058 人乳头瘤病毒感染是引起尖锐湿。
33、疣(CA) 的主要病因，而且主要是由HPV6/11型 感染所致。从临床皮肤科采集来自于尖锐湿疣患者外阴部位的疣体标本(经鉴定为HPV6/ 11 型)，集中到一只离心管中，称重30mg，用玻璃匀浆器匀浆，再加入5 ml 生理盐水，配成 6 mg/ml 的离体CA 混悬液，备用。吸取25l样品液和25l CA 混悬液至115 ml 离心 管中，振摇均匀，使样品与疣体能充分作用，置37 水浴箱培养，另设生理盐水阳性对照、 各提取溶媒空白对照。共设置四组，在样品处理疣体3 、5 、7 天后，各取一组进行以下试 验。从温浴箱中取出经样品处理的CA 混悬液，提取DNA，作为模板进行FQ-PCR（定量PCR。
34、） 扩增，以检验DNA含量。结果如附图8所示，在样品处理5天后，候选物40M时，可以显著 抑制HPV-DNA的复制，处理7天时PCR检测结果呈阴性。结论：确定(3-2-(1S)-2,3-d ihydro-1H-inden-1-ylamino-2-oxoethylbiphenyl-4-yl)sulfonylacetic acid 为抗 HPV病毒药物候选物，可进一步用于动物实验。 说 明 书CN 102750459 A 7/7页 9 0059 通过虚拟筛选出的其它候选化合物，都可以按照上述方法，继续进行体外抗病毒 实验，从而确定其抗病毒效果。 0060 实施例2 一种以E1蛋白的R589为活性位。
35、点构建活性口袋，进行的抗HPV病毒 药物的虚拟筛选。 0061 方法与实施例1相同，不同点在于：设置活性口袋时：以R589的中心坐标为活 性口袋的中心，最终确定活性口袋的设置条件如下：以E1的活性酪氨酸残基位点R589为 活性中心的活性口袋：中心坐标为x为36.410，y为25.423，z为106.056，网格大小值为 404040，步长（spacing）为0.375nm。 说 明 书CN 102750459 A 1/4页 10 图1 图2 图3 说 明 书 附 图CN 102750459 A 10 2/4页 11 图4 图5A 图5B 图5C 图6A 图6B 说 明 书 附 图CN 102750459 A 11 3/4页 12 图6C 图7A 说 明 书 附 图CN 102750459 A 12 4/4页 13 图7B 图8 说 明 书 附 图CN 102750459 A 13 。