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1、(10)申请公布号 CN 102516313 A (43)申请公布日 2012.06.27 C N 1 0 2 5 1 6 3 1 3 A *CN102516313A* (21)申请号 201110367212.X (22)申请日 2011.11.18 C07F 15/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) G01N 21/31(2006.01) (71)申请人安徽大学 地址 230039 安徽省合肥市肥西路3号 (72)发明人吴杰颖 胡桂菊 肖陆飞 梁云科 张志文 田玉鹏 (74)专利代理机构安徽省合肥新安专利代理有 限责任公司 。
2、34101 代理人吴启运 (54) 发明名称 具有抗癌活性及双光子生物显影功能的类顺 铂配合物及其制备方法 (57) 摘要 一种具有抗癌活性及双光子生物显影功能 的类顺铂配合物，其特征在于：有以下结构式： 本配合物抗癌活性高，是传统顺 铂的2倍，同时又是一种细胞显影的双光子吸收 材料，且对细胞无损伤，可用于活体细胞检测和抗 癌机理的研究。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 1/1页 2 1.一种具有抗癌活性及双光子生物显影功能的类顺铂配合物，其特征在于：有以。
3、下结 构式： 2.如权利要求1所述的类顺铂配合物的制备方法，以对硝基苯胺为起始原料，包括配 体和类顺铂配合物合成的化学过程以及萃取、分离、浓缩和提纯，其特征在于所述的化学过 程有以下六个步骤： (1)中间体M1-4-硝基-(4-乙氧基苯)苯胺的合成 对硝基苯胺与对碘苯乙醚于DMSO溶剂中在碳酸钾、L-脯氨酸和碘化亚铜存在条件下 及氮气保护下于85-115搅拌反应8-10小时，对硝基苯胺与碳酸钾、L-脯氨酸和碘化亚铜 的质量比依次为11.1-1.5、10.1-0.2和10.05-0.1； (2)中间体M2-4-(4-乙氧基苯基)(4-硝基苯基)氨基)苯甲醛的合成 中间体M1与对氟苯甲醛于DMSO。
4、溶剂中在碳酸钾和相转移催化剂存在条件下 于85-95搅拌反应70-75小时，中间体M1与碳酸钾和相转移催化剂的质量比依次为 10.5-0.9和10.05-0.09； (3)中间体M3-4-(4-(二乙基氨基)-(E)-苯乙烯基)-N-(4-乙氧基苯 基)-N-(4-硝基苯基)苯胺的合成 中间体M2与(对二乙胺基苄基)(三苯基)膦碘化物在叔丁醇钾存在条件下于研钵中 研磨反应10-20min，中间体M2与叔丁醇钾的质量比为10.5-0.6； (4)中间体M4-4-(4-(二乙基氨基)-(E)-苯乙烯基)-N-(4-乙氧基苯 基)-N-(4-氨基苯基)苯胺的合成 中间体M3投入乙醇中并加热回流后加P。
5、d/C催化剂搅拌均匀，然后滴加还原剂85水 合肼搅拌反应10-20分钟，中间体M3与Pd/C的质量比为10.15-0.25； (5)配体L的合成 中间体M4与2-吡啶甲醛在乙醇溶剂中回流反应2-4小时； (6)类顺铂配合物Pt(L)Cl 2 的合成 配体L与K 2 PtCl 4 在乙腈和水的混合溶剂中回流反应14-18小时，乙腈和水的体积混 合比为11。 权 利 要 求 书CN 102516313 A 1/8页 3 具有抗癌活性及双光子生物显影功能的类顺铂配合物及其 制备方法 一、 技术领域 0001 本发明涉及一种具有抗癌活性的化合物及其制备方法，具体地说是一种具有高的 抗癌活性，且具有双光。
6、子活体细胞显影功能的类顺铂配合物及其合成方法。 二、 背景技术 0002 由于双光子荧光具有激发能量低(近红外)、光损伤小、穿透性强等特点，使得双 光子荧光显微成像技术得到广泛应用。在生物学中对于细胞、基因等微观物质的研究通常 要借助显微镜来观察，但由于光线不够强或放大倍数有限等原因，有时仍不易清楚的观察， 如癌细胞的裂变、DNA的复制等。如果具有双光子吸收特性的物质进入活细胞，在作用部位 发荧光，显微镜下便能清楚的看到细胞内部的变化，且对细胞的光损伤小。 0003 2008年Anthony W.Parker小组报道了一种具有双光子激发荧光且光稳定性好的 二价铂配合物(Proc.Natl.Ac。
7、ad.Sci.U.S.A.，2008，105，16071-16076)，通过引入与生物分 子相结合的不同功能基团，调节其在可见区的蓝绿光到橙光之间的发光波段。由于双光子 吸收特性，一方面有效减少了对生物体的损害，另一方面在近红外区的光对生物体有良好 的穿透性和高度的空间选择性。因此该化合物在双光子细胞显影方面有很好的应用价值。 同年，麻省理工大学Stephen J.Lippard课题组报道了一种用于运输抗癌药物的化合物 (J.Am.Chem.Soc.2008，130，11467-11476)，化合物含有抗癌作用的顺铂部分和将化合物带 到细胞表面的叶酸衍生物长链部分。Pt的另一端通过酰胺键连接到。
8、单层碳纳米管上，作为 一个运输通道，使化合物通过内吞作用进入到癌细胞内部，释放具有抗癌作用的顺铂部分。 释放出顺铂后的有机基团在细胞内部，可以发出荧光，因此，该化合物既具有抗癌活性同时 具有生物细胞显影作用。但是显影基团不具有双光子吸收特性，对生物细胞损伤较大，而且 合成较为复杂，使其应用受到限制。 0004 申请人对既具有抗癌活性、又具有双光子生物细胞显影功能的配合物进行了国内 外范围内的检索，结果见下表： 0005 1、网检索结果：(2011/10/13) 0006 0007 说 明 书CN 102516313 A 2/8页 4 0008 2、中国期刊网检索结果： 0009 检索方式一： 。
9、0010 篇名-具有抗癌活性的类顺铂配合物双光子吸收材料：无相关文献。 0011 篇名-具有抗癌活性及双光子生物显影功能的类顺铂配合物及其制备方法无相 关文献。检索方式二： 0012 全文-具有抗癌活性的类顺铂配合物双光子吸收材料：无相关文献。 0013 全文-具有抗癌活性及双光子生物显影功能的类顺铂配合物及其制备方法无相 关文献。 0014 由此可见，既具有抗癌活性、又具有双光子生物细胞显影功能的配合物尚未见报 道。 三、 发明内容 0015 本发明提供的类顺铂配合物，旨在既具有抗癌活性、又能在分子水平上直观地研 究抗癌机理。所要解决的技术问题是赋于该配合物兼具抗癌活性和双光子细胞生物显影特。
10、 性。 0016 本发明类顺铂配合物的结构式为： 0017 说 明 书CN 102516313 A 3/8页 5 0018 本配合物的制备方法以对硝基苯胺为起始原料，包括配体和类顺铂配合物合成的 化学过程以及萃取、分离、浓缩和提纯等各物理过程，其特征是所述的化学过程有以下六个 步骤： 0019 1、4-硝基-(4-乙氧基苯)苯胺(中间体M1)的合成 0020 对硝基苯胺与对碘苯乙醚于二甲基亚砜(DMSO)溶剂中在碳酸钾、L-脯氨酸和 碘化亚铜存在条件下及氮气保护下于85-115搅拌反应8-10小时，冷却后用乙酸乙酯萃 取，萃取液经浓缩、硅胶层析柱提纯和脱溶(即真空蒸出溶剂，下同)后得到橙色结晶。
11、中间 体M1。以对硝基苯胺的质量计，与碳酸钾的质量为11.1-1.5，与L-脯氨酸的质量比为 10.1-0.2，与碘化亚铜的质量比为10.05-0.1。 0021 2、4-(4-乙氧基苯基)(4-硝基苯基)氨基)苯甲醛(中间体M2)的合成 0022 中间体M1与对氟苯甲醛于DMSO溶剂中在碳酸钾和相转移催化剂存在条件下于 85-95搅拌反应70-75小时，冷却后用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩、硅胶层析柱提纯和 脱溶后得到亮黄色固体中间体M2，以M1的质量计，与碳酸钾的质量比为10.5-0.9，与相 转移催化剂的质量比为10.05-0.09。 0023 3、4-(4-(二乙基氨基)-(E)-苯乙烯。
12、基)-N-(4-乙氧基苯 基)-N-(4-硝基苯基)苯胺(中间体M3)的合成 0024 中间体M2与(对二乙胺基苄基)(三苯基)膦碘化物在叔丁醇钾存在条件下于研 钵中研磨反应10-20min，用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩、硅胶层析柱提纯和脱溶后得到红 色油状产物中间体M3。以M2的质量计，与叔丁醇钾的质量比为10.5-0.6。 0025 所述的膦盐首先由对氟苯甲醛与N，N-二乙胺反应生成4-N，N-二乙基氨基苯甲 醛，然后该醛与硼氢化钠反应生成4-N，N-二乙基氨基苯甲醇，最后该醇与KI和三苯基膦反 应生成(对二乙胺基苄基)(三苯基)膦碘化物。 0026 4、4-(4-(二乙基氨基)-(E)-。
13、苯乙烯基)-N-(4-乙氧基苯 基)-N-(4-氨基苯基)苯胺(中间体M4)的合成 0027 中间体M3投入乙醇中并加热回流溶解后加催化剂钯碳(Pd/C)搅拌均匀，滴加还 原剂85水合肼搅拌反应10-20分钟，趁热抽滤，滤液经浓缩、硅胶层析柱提纯和脱溶后得 到黄色油状物即中间体M4。以M3的质量计，与Pd/C催化剂的质量比为10.15-0.25。 0028 5、配体L的合成 说 明 书CN 102516313 A 4/8页 6 0029 该反应是中间体M4中的氨基与2-吡啶甲醛中的醛基的缩合反应。就是中间体 M4与2-吡啶甲醛在乙醇溶剂中回流反应2-4小时，冷却后脱溶，用乙醇和水混合溶剂(V 。
14、乙 醇 V 水 11)重结晶，得到暗红色的配体L。 0030 6、类顺铂配合物Pt(L)Cl 2 的合成 0031 配体L与四氯铂酸钾(K 2 PtCl 4 )在乙腈和水(V 乙腈 V 水 11)混合溶剂中回 流反应14-18小时，得到棕黑色的悬浮液，脱溶后，残留物依次用乙醚、水和乙醇洗涤，得到 棕色粉末目标产物Pt(L)Cl 2 。 0032 本发明的特点： 0033 1、本发明所合成的类顺铂配合物Pt(L)Cl 2 的抗癌活性高，约是传统顺铂的2倍 (见附表)，有望开发成为一种抗癌新药。 0034 2、本发明合成的类顺铂配合物Pt(L)Cl 2 是一种具有细胞显影的双光子吸收材 料(见附图。
15、)。激发能量低、波长长，穿透性强、光损伤小、低毒等特点，因此，对细胞无损伤， 可用于活体细胞检测，具有明显的应用价值。 0035 3、本发明合成的类顺铂配合物Pt(L)Cl 2 兼具有抗癌活性和生物显影功能，两者 的结合可观察药物分子与癌细胞作用的情况，以便研究抗癌机理。 0036 4、以对硝基苯胺、对氟苯甲醛和水合肼等常见试剂为原料合成配体，原料易得，成 本低，合成简洁，产率高。通过配体与金属离子配位的立体特性，增加非线性光学效应基团 的密度，避免冗长的有机合成。 0037 本发明以三苯胺为中心核(core)，引入具有协同给电子效应的基团，通过席夫碱 反应，引入具有配位能力的吸电子基团，构筑。
16、D-A型化合物，将其作为配体，与铂盐反应 合成类顺铂配合物。所得配合物抗癌活性高，是传统顺铂药物的2倍，并具有双光子生物细 胞显影功能。两者的结合可以让生物学家清楚的观察分子进入细胞的情况，为研究抗癌机 理提供新方法，为新型药物设计提供新思路，推动生物学在分子水平上的研究进展，因此合 成此类配合物具有深远的科学意义和广泛的应用前景。 四、 附图说明 0038 图1是类顺铂配合物Pt(L)Cl 2 对MCF-7cells的生物显影测试结果图(MCF-7代 表乳腺癌细胞)。图中a表示单独类顺铂配合物双光子荧光显影；b表示类顺铂配合物双光 子荧光显影与细胞核染色剂Byto-9双光子显影对比图；c表示。
17、类顺铂配合物双光子荧光显 影与溶酶体染色剂双光子细胞显影对比图；d表示类顺铂配合物双光子荧光显影与线粒体 染色剂双光子细胞显影对比图。 五、 具体实施方式 0039 (一)配体L和目标产物Pt(L)Cl 2 的合成 0040 1、4-硝基-(4-乙氧基苯)苯胺(中间体M1)的合成 0041 说 明 书CN 102516313 A 5/8页 7 0042 称取2.48g(10mmol)对碘苯乙醚，1.97g(15mmol)对硝基苯胺，2.76g(20mmol)碳 酸钾，0.23gL-脯氨酸，溶解于30mLDMSO中，通氮气0.5h后，加入0.19g CuI，加热至100。 薄板层析跟踪反应进程，。
18、当反应9h后，停止反应，冷却，乙酸乙酯萃，合并有机相，浓缩，硅 胶层析柱分离提纯，乙酸乙酯和石油醚(V/V15)作为洗脱剂，得到橙色晶体中间体 M1。产率65。 1 H NMR(400MHz，d-DMSO)，(ppm)：8.18(s，1H)，8.06(d，J8.0Hz，2H)， 7.22(d，J8.0Hz，2H)，6.96(q，J8.0Hz，4H)，4.06(q，J6.8Hz，2H)，1.37(t，J 6.8Hz，3H). 0043 2、4-(4-乙氧基苯基)(4-硝基苯基)氨基)苯甲醛(中间体M2)的合成 0044 0045 称取2.60g(10mmol)4-硝基-(4-乙氧基苯)苯胺(中间。
19、体M1)，3.72g(30mmol) 对氟苯甲醛，2.0g(15mmol)碳酸钾，置于150mL容量瓶中。加入相转移催化剂Aliquat-336 0.20g，DMSO做溶剂，缓慢加热至90，反应72h，薄板层析跟踪反应进程，当原料点(中间 体M1)完全消失，停止反应，冷却至室温。乙酸乙酯萃取后真空干燥浓缩，得暗红色油状粗 产物，硅胶柱层析分离提纯，乙酸乙酯和石油醚(V/V16)作为洗脱剂，真空干燥得亮 黄色固体中间体M2，产率80。 1 H NMR(400MHz，d-DMSO)，(ppm)：9.90(s，1H)，8.18(d， J9.2Hz，2H)，7.85(d，J8.4Hz，2H)，7.25。
20、(d，J8.4Hz，2H)，7.22(d，J9.2Hz，2H)， 7.05(q，J7.2Hz，4H)，4.06(q，J7.2Hz，2H)，1.35(t，J7.2Hz，3H). 0046 3、二乙胺基苄基三苯基膦碘化物的制备 0047 (a)在500ml圆底烧瓶中加入25g(0.2mol)对氟苯甲醛，51.2g(0.7mol)二乙胺， 250mLDMSO，41.5g(0.3mol)碳酸钾，0.5mL Aliquat-336，95下搅拌回流72h，反应产物 冷却至室温，加入冰水中得到黄色沉淀，抽滤，洗涤，粗产物用乙醇重结晶的亮黄色纯产物 4-N，N-二乙基氨基苯甲醛，产率：90。 0048 (b)。
21、称取1.77g第一步纯产物置于圆底烧瓶中，加入适量甲醇，室温搅拌使其完全 溶解，称取0.57g硼氢化钠，少量分批的加入烧瓶中，薄板层析跟踪反应，至反应完全。用乙 酸乙酯萃取，收集有机相，浓缩，得纯产物4-N，N-二乙基氨基苯甲醇。 0049 (c)称取17.9g(0.1mol)4-N，N-二乙基氨基苯甲醇，16.6g(0.1mol)KI，加入到圆 底烧瓶中，加入少量水，至KI完全溶解。再加入26.2g(0.1mol)三苯基膦，9g(0.15mol)冰 醋酸，100mL氯仿以及适量的Aliquat-336，在80下回流48小时，冷却，蒸出部分溶剂氯 仿，加入适量的甲苯，使反映产物将在甲苯中析出，。
22、继续加甲苯是固体完全析出，抽滤，真空 干燥，得类白色膦盐。 0050 4、4-(4-(二乙基氨基)苯乙烯基)-N-(4-乙氧基苯基)-N-(4-硝基苯 基)苯胺(中间体M3)的合成 0051 说 明 书CN 102516313 A 6/8页 8 0052 称取4.36g(12mmol)4-(4-乙氧基苯基)(4-硝基苯基)氨基)苯甲醛(中 间体M2)，11.20g(20mmol)(对二乙胺基苄基)(三苯基膦)碘化物，2.50g(20mmol)叔丁醇 钾，置于中研钵，研磨15min，随着研磨的进行，反应物变为红棕色粘稠状物质。薄板层析跟 踪反应进程，待反应完全后，乙酸乙酯萃取有机相，真空浓缩，硅。
23、胶层析柱分离提纯，乙酸乙 酯和石油醚(V/V14)作为洗脱剂，真空干燥得油状红色产物中间体M3，产率75。 1 H NMR(400MHz，d-DMSO)，(ppm)：8.05(d，J9.2Hz，2H)，7.60(d，J8.4Hz，2H)，7.39(d， J9.2Hz，2H)，7.21(d，J8.8Hz，4H)，7.08(d，J16Hz，1H)，7.01(d，J8.4Hz，2H)， 6.92(d，J16Hz，1H)，6.70(q，J9.2Hz，4H)，4.04(q，J7.2Hz，2H)，3.35(q，J8.1Hz， 4H)，1.34(t，J7.2Hz，3H)，1.10(t，J8.1Hz，6H).。
24、 0053 5、4-(4-(二乙基氨基)苯乙烯基)-N-(4-乙氧基苯基)-N-(4-氨基苯 基)苯胺(中间体M4)的合成 0054 0055 称取2.00g(4mmol)中间体M3，加入适量乙醇，加热回流使其完全溶解，再加入 0.45g Pd/C催化剂，搅拌5min后，缓慢滴加7mL85的水合肼，反应15min后，薄板层析跟 踪反应进程。停止反应后，趁热抽滤，除去碳粉末，真空干燥浓缩得暗黄色粗产物，用硅胶 柱层析提纯，乙酸乙酯和石油醚(V/V16)作为洗脱剂，真空干燥得黄色油状产物中 间体M4，产率72。IR(KBr，cm -1 )selected bands：3458(m)，3372(s)。
25、，2976(s)，2919(w)， 1607(s)，1505(s)，1399(m)，1267(s)，1235(s)，1194(m)，1053(m)，822(m)，563(m)， 521(m). 1 H NMR(400MHz，d-DMSO)，(ppm)：7.34(d，J8.8Hz，2H)，7.26(d，J8.8Hz， 2H)，7.02(d，J8.8Hz，2H)，6.93(d，J8.8Hz，4H)，6.87(d，J8.4Hz，1H)，6.82(q，J 16Hz，2H)，6.78(d，J8.8Hz，2H)，6.67(d，J8.4Hz，2H)，6.60(d，J8.4Hz，2H)， 5.26(s，2H)。
26、，3.98(q，J7.2Hz，2H)，3.35(q，J7.2Hz，4H)，1.39(t，J7.2Hz，3H)， 1.16(t，J7.2Hz，6H).EI-MS：m/z：477. 0056 6、配体L的合成 0057 称取1.43g(3mmol)中间体M4于烧瓶中，加入乙醇使之完全溶解，再加入 0.32g(3mmol)2-吡啶甲醛，回流搅拌3h，TLC跟踪反应进程，反应完全冷却至室温，真空干 说 明 书CN 102516313 A 7/8页 9 燥除去溶剂乙醇，用乙醇和水的混合溶剂(V 乙醇 V 水 11)重结晶，得暗红色产物配 体L。产率：81。IR(KBr，cm -1 )selected b。
27、ands：3445(w)，2971(m)，2927(m)，1606(s)， 1500(s)，1239(s)，823(s)，540(w)，526(w). 1 H NMR(400MHz，d-DMSO)，(ppm)：8.70(d， J6.0Hz，1H)，8.64(s，1H)，8.13(d，J8.0Hz，1H)，7.93(t，J8.0Hz，1H)，7.50(t，J 6.0Hz，1H)，7.43(d，J8.4Hz，2H)，7.35(q，J8.4Hz，4H)，7.07(d，J8.4Hz，2H)， 7.00(q，J8.4Hz，4H)，6.90(q，J16Hz，2H)，6.64(d，J8.4Hz，2H)，4.。
28、02(q，J 7.2Hz，2H)，3.30(q，J7.2Hz，4H)，1.34(t，J7.2Hz，3H)，1.09(t，J7.2Hz，6H). 13 C NMR(400MHz，d-CHCl 3 )，(ppm)：156.3，153.7，151.6，146.7，146.3，145.2，138.5，135.2， 133.1，130.7，128.5，127.1，126.0，125.3，124.5，123.8，122.4，121.9，120.2，117.3， 112.6，111.5，69.4，44.6，15.8，14.2.EI-MS：m/z：566(M + )。 0058 7、类顺铂配合物Pt(L)Cl。
29、 2 的合成 0059 称取配体L 0.28g(0.5mmol)，K 2 PtCl 4 0.21g(0.5mmol)加至100mL的圆底烧瓶 中，再向其中加入50mL乙腈和水的混合溶剂，反应混合物回流反应16h，得到棕黑色的悬浮 液，减压蒸出溶剂，残留物用乙醚充分洗涤，再依次用适量的水和乙醇洗涤，最后得棕色粉 末状Pt(L)Cl 2 0.39g，产率为89。FT-IR(石蜡膜，cm -1 )selected bands： Pt-Cl 338， Pt-N 519. 1 H NMR(400MHz，d-DMSO)，(ppm)：9.34(d，J6.0Hz，2H)，8.24(d，J8.0Hz， 1H)，。
30、7.93(m，2H)，6.95(m，17H)，4.00(q，J7.2Hz，2H)，3.33(q，J7.2Hz，4H)，1.31(t，J 7.2Hz，3H)，1.07(t，J7.2Hz，6H). 13 C NMR(400MHz，d-CHCl 3 )，(ppm)：165.8，156.3， 151.6，146.7，146.3，145.2，138.5，135.2，133.1，130.7，128.5，127.1，126.0，125.3， 124.5，123.8，122.4，121.9，120.2，117.3，112.6，111.5，69.4，44.6，15.8，14.2.Elemental analys。
31、is calcd()for C 38 H 38 Cl 2 N 4 OPt：C，54.81，H，4.60，N，6.73，O，1.92.Found：C， 55.27，H，4.16，N，7.25，O，2.35.ESI-MS：m/z：cal：832.2，found：834。 0060 (二)抗肿瘤活性试验 0061 MTT全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3， 5-di-phenytetrazoliumromide，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴 盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 0062 MTT比色法，是一种检测细胞存活和。
32、生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的 琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细 胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm波长处(本申请用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接检测活细胞数量。在一定 细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子 的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 0063 体外细胞毒性实验(MTT)方法，细胞株为人宫颈癌细胞(HeLa)，人神经母细胞瘤 细胞(SH-SY5Y)，人胃癌细胞株(BG。
33、C823)分别生长在T-25培养瓶中，培养液为DMEM含有 胎牛血清(10)、青霉素(100g mL -1 )、和链霉素(100ug mL -1 )，在37，5CO 2 培养箱 中全湿度培养。实验时细胞接种在96孔培养板中，接种密度5.010 4 个/mL，每孔100uL。 细胞接种24h后加入100uL含有不同浓度的化合物(顺铂，配合物Pt(L)Cl 2 )每个浓度3 个复孔，浓度分别为16，8，4，2，1，0.5ug/mL，于给药分别为24h，48h后加MTT，4h后吸干孔内 溶液，加入150uLDMSO，振荡溶解10min，于570nm下测吸光值，顺铂(CDDP)作为对照组。 说 明 书。
34、CN 102516313 A 8/8页 10 0064 用改良寇式法：lgIC50Xm-IP-(3-Pm-Pn)/4(Xmlg最大剂量，Ilg(最 大剂量/相临剂量)，P：阳性反应率之和，Pm：最大阳性反应率，Pn：最小阳性反应率)算得 IC50值得单位是g/mL，然后换算为m/L。 0065 附表：Pt(L)Cl 2 和传统顺铂CDDP对不同细胞抗癌活性IC50(M)值 0066 0067 (BGC823d：人胃癌细胞株，SH-SY5Y：人神经母细胞瘤细胞，HeLa：人宫颈癌细胞) 说 明 书CN 102516313 A 10 1/1页 11 图1 说 明 书 附 图CN 102516313 A 11 。