一种羟基喜树碱戊二酸单酯的药物组合物技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及药物注射剂领域，特别涉及羟基喜树碱类药物的
注射剂，使用的药物是戊二酸单酯，包括其制备方法和抗肿瘤应用。药理实验表明羟基喜树
碱戊二酸单酯具有明显的抗肿瘤活性，用于结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌的治疗。
背景技术
羟基喜树碱是从喜树的皮、果实中提取得到的一类色氨酸—萜烯生物碱类抗癌药
物。羟基喜树碱对治疗晚期胃癌、肝癌、乳腺癌及膀胱癌等多种恶性肿瘤都具有显著疗效。
针对不同的肿瘤细胞其抗肿瘤的机制也不尽相同。羟基喜树碱的半衰期较短，毒性较小，表
观分布容积小，说明其可能主要分布于血浆，会迅速从体内排泄，因此不容易发挥长效抗肿
瘤作用。
羟基喜树碱具有广谱抗肿瘤作用，临床前研究发现其对于肝癌、肺癌等具有显著
的抑制作用。胡巍等对肝癌模型小鼠腹腔注射羟基喜树碱注射液，发现其能明显抑制肿瘤
生长，改善小鼠生活状态，且适当浓度的羟基喜树碱注射液对小鼠肝肾功能有一定保护作
用(胡巍,张尚锁,方芸.羟基喜树碱对H22肝癌模型小鼠药效学的研究[J].现代中药研究与
实践,2011(2):40-43.)。张超雾化用于治疗黑色素瘤肺转移癌小鼠，结果显示雾化给药能
显著降低肺癌转移结节数、肺湿重、肺癌面积等参数，病理组织学检查显示动物肺脏癌变组
织状况有所改善(张超,胡巍,方芸.雾化吸入羟基喜树碱对小鼠B16黑色素瘤实验性肺转移
的影响[J].中国中药杂志,2011,36(5):618-623.)。
研究显示，羟基喜树碱对于多种肿瘤细胞都表现出了诱导细胞凋亡或者抑制细胞
增殖的作用，从而达到了抗肿瘤的目的(王蓉,胡巍,方芸.羟基喜树碱的药学研究进展[J].
药学与临床研究,2015(2):156-159.)。周萍采用实时定量PCR法在mRNA水平上观察羟基喜
树碱处理的乳腺癌细胞(MCF-7)中TIMP-3表达的改变，结果显示，羟基喜树碱可诱导乳腺癌
细胞中TIMP-3表达增多(周萍,陈蓉.实时定量PCR检测羟基喜树碱对乳腺癌细胞TIMP-3表
达的影响[J].实用中医药杂志,2012,28(5):363-364.)。Fei B通过体内外的实验，研究了
羟基喜树碱对结肠癌细胞凋亡的影响及其机制，采用MTT法和TUNEL法测定细胞增殖与凋亡
的情况，并用Real-time PCR和Western blot方法检测基因的表达情况。结果表明，羟基喜
树碱通过活化caspase 3、7、8、9的活性，下调survivin、survivin-3B以及XIAP的表达，从而
达到显著抑制结肠癌SW1116和Colo 205细胞的增殖并诱导细胞凋亡的作用，该作用呈剂量
和时间依赖性(Fei B,Chi A L,Yuan W.Hydroxycamptothecin induces apoptosis and
inhibits tumor growth in colon cancer by the downregulation of survivin and
XIAP expression[J].World Journal of Surgical Oncology,2013,11(1):1-9.)。Chen P
的研究表明，羟基喜树碱可以通过抑制端粒酶的活性从而降低Tca8113细胞的克隆效率，抑
制Tca8113细胞增殖，该作用呈时间依赖性。当与平阳霉素联用时，具有更加显著的细胞毒
性(Chen P,Liu B,Hu M.The effect of hydroxycamptothecin and pingyangmycin on
human squamous cell carcinoma of the tongue.[J].Oncology Letters,2013,5(3):
947-952.)。许光明等研究羟基喜树碱在抑制HepG2细胞的生长的同时可以提高细胞DNA的
甲基化水平(许光明,贺香嫦,林丽美,等.10-羟基喜树碱对肝癌细胞HepG2DNA甲基化水平
的调节作用研究[J].中国药房,2014(45):4245-4247.)。陈琴华等研究表明10-HCPT对肝癌
细胞Hep G2有比较明显的抑制作用(陈琴华,余飞,李鹏,等.喜树碱及其衍生物对肝癌细胞
HepG2增殖抑制与凋亡的研究[J].实用药物与临床,2016(3).)。
喜树碱类药物是临床上治疗肿瘤的有效药物之一，但大部分该类药物因自身复杂
的大共轭结构使得其溶解性不好，对机体也有较大的副作用。羟基喜树碱具有广谱抗肿瘤
活性，但稳定性较差。考虑到羟基喜树碱存在的问题和不足，为了提高疗效，减轻副作用，本
实验中对羟基喜树碱的结构进行适当的修饰，通过在10位引入戊二酸基团，得到羟基喜树
碱偶合物，改善羟基喜树碱的水溶性，提高内酯环的稳定性。根据脂类化合物的特性，脂类
物质的脂溶性高，在组织和器官中的浓度更易提升，该偶合物应相对具有更好的使用效果。
本发明的目的是提供一种具有明显抗肿瘤活性且具有一定水溶性的对乳腺癌细
胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、Huh7有明显抑制作用，能增加肿瘤细胞的凋亡率的化合物及这种
化合物的制备方法和用途。本发明解决的问题是，(1)提高溶解性，(2)提高疗效，(3)进一步
制备得到注射剂，优选冻干粉针。
本发明具体提供了的化合物是羟基喜树碱戊二酸单酯，化学名为，10-戊二酸-4-
乙基-4，10-二羟基-1H-吡喃并[3’，4；6，7]吲嗪并[1，2b]喹啉-3，14-(4H，12H)-二酮酯。其
结构式为：
分子式为：C25H22N2O8，分子量478。
同时本发明提供了羟基喜树碱戊二酸单酯的制备方法，其特征在于：以羟基喜树
碱为原料，戊二酸酐等为酰化剂，在碱存在条件下，于溶剂中进行酰化反应制得，反应式为：
酰化反应的温度为50℃～70℃；羟基喜树碱与戊二酸酐用量摩尔比为1:1～5；羟
基喜树碱与4-二甲氨基吡啶用量摩尔比为1:1～3；所用溶剂为吡啶。
本发明所提供的羟基喜树碱戊二酸单酯具有抗肿瘤活性，可用于制备可用于乳腺
癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肺癌的治疗的药物。
本发明提供一种包含羟基喜树碱戊二酸单酯的药物组合物，其包含羟基喜树碱戊
二酸单酯，和药学上可接受的辅料。
所述的包含羟基喜树碱戊二酸单酯的药物组合物，其包含0.01－5％的羟基喜树
碱戊二酸单酯，和95％－99.99％的药学上可接受的辅料。
本发明提供一种包含羟基喜树碱戊二酸单酯的注射用组合物，其包含0.01－5％
的羟基喜树碱戊二酸单酯，和95％－99.99％的药学上可接受的辅料，所述的药学上可接受
的辅料任选地包含增溶剂。所述的药学上可接受的辅料还任选地包含pH调节剂。
所述注射用组合物优选为冻干粉针剂。
所述的pH调节剂为氢氧化钠，使得羟基喜树碱戊二酸单酯转变为钠盐形式，以制
备成冻干粉针剂。其中的转变为部分转变或全部转变。
本发明提供一种冻干粉针制剂，其特征在于，由0.01－5％的羟基喜树碱戊二酸单
酯及95％－99.99％的药学上可接受的辅料制备而成；其中，药学上可接受的辅料任选地包
含作为pH调节剂的氢氧化钠，其能使得羟基喜树碱戊二酸单酯转变为钠盐形式。
其中的转变为部分转变或全部转变。所述的部分转变为至少20％、30％、40％、
50％、60％或80％转变为钠盐形式。
为解决羟基喜树碱水溶性差的问题，本发明采用了前药的药物设计方法，10-羟基
喜树碱上的羟基与戊二酸酐的羧基反应，生成HCPT-PA，这样可以有效改善其水溶性，增加
其抗肿瘤活性。
具体实施方式：
实施例1羟基喜树碱戊二酸单酯的制备
将羟基喜树碱(400mg，1.098mmol)溶于无水吡啶(40ml)，溶解后加入4-二甲氨基
吡啶(250mg，2.049mmol)，戊二酸酐(500mg,4.386mmol)，60℃搅拌避光反应48h。反应过程
中用薄层层析法检测反应物的生成，展开剂是氯仿/甲醇＝94:6，产物不再增加后停止反
应。冷却至室温后，加入100ml甲苯稀释反应液，在60℃水浴下旋转蒸发仪蒸干溶剂。加入
40ml氯仿溶解蒸馏烧瓶中产物，将溶液倒入分液漏斗中，并用2％稀盐酸、饱和NaCl溶液洗
涤有机相，重复一次，抽滤后，旋转蒸发仪浓缩干燥样品。
实施例2羟基喜树碱戊二酸单酯对MCF-7细胞增值凋亡的影响
采用终浓度为0、10、50、100、150、200μM的羟基喜树碱及同样终浓度的羟基喜树碱
戊二酸单酯分别处理对数生长期MCF-7细胞，MTT法检测各浓度的增殖抑制率(见表一)，
Annexin-V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率(见表二)。从表中可以得出，羟基喜树
碱及羟基喜树碱戊二酸单酯可以抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖并诱导其凋亡，羟基喜树碱
戊二酸单酯具有比羟基喜树碱更好的作用效果。
表一羟基喜树碱及羟基喜树碱戊二酸单酯对MCF-7细胞的抑制率(n＝5)
注：与对照组1比较，*P<0.05，#P<0.01。
表二羟基喜树碱及羟基喜树碱戊二酸单酯对MCF-7细胞凋亡的影响
注：n＝5，与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01。
实施例3羟基喜树碱戊二酸单酯对肝癌细胞凋亡的影响
体外培养人肝癌细胞HepG2和Huh7及人正常肝细胞L02，每种细胞分别采用六孔板
接种，按照0uM、10uM、50uM、100uM、150uM、200uM的浓度梯度加入羟基喜树碱戊二酸单酯。继
续培养后加MTT试剂，用酶标仪测定吸光值，求出抑制率(见表三)。最后使用流式细胞仪测
定细胞的凋亡率(见表四)。
根据MTT法的结果，肝癌细胞抑制率随羟基喜树碱戊二酸单酯浓度增加而明显上
升。羟基喜树碱戊二酸单酯浓度从10uM到200uM，人正常肝细胞L02的抑制率分别从(5.92±
2.01)％增加到(20.70±2.42)％，HepG2和Huh7细胞的抑制率分别从(7.65±2.51)％增加
到(45.75±2.04)％，(8.869±2.53)％增加到(39.22±1.71)％。流式细胞仪测定的结果
中，L02、HepG2、Huh7三种细胞的凋亡率分别从4.22％增加到25.61％，5.66％增加到
43.51％，4.92％增加到32.22％。
表三羟基喜树碱戊二酸单酯对三种细胞的抑制率(n＝5)
注：与对照组1比较，*P<0.05，#P<0.01。
表四羟基喜树碱戊二酸单酯对三种细胞凋亡的影响(n＝5)
注：与对照组1比较，*P<0.05，#P<0.01
实施例4羟基喜树碱戊二酸单酯与羟基喜树碱的溶解度数据对比
标准曲线的制备分别取5mg的羟基喜树碱及羟基喜树碱戊二酸单酯置于不同50mL
容量瓶中，加无水甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.1mg/mL的对照品贮备液，分别
移取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL，置于10mL容量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，得质量浓
度为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0ug/mL的化合物系列标准溶液，羟基喜树碱在375nm处测
其标准溶液吸收值，化合物紫外最大吸收峰380nm处测量其标准溶液吸收值，分别制作出化
合物的标准曲线。得出羟基喜树碱的标准曲线的回归方程Y(OD)＝0.0651X+0.0016(R2＝
0.9998)，其线性范围在1.2～38.4ug/mL,羟基喜树碱戊二酸单酯的标准曲线的回归方程Y
(OD)＝0.0692X-0.0043(R2＝0.9997)，其线性范围在1.0～32.0ug/mL。
化合物溶解度测定分别取5mg的羟基喜树碱及羟基喜树碱戊二酸单酯于带塞锥形
瓶中，加入50mLH2O制备为过饱和溶液，25℃水浴避光搅拌24h，用0.45uM的滤膜过滤后精密
吸取适量的于10mL容量瓶中，加无水甲醇定容至10mL，测量溶液的吸光度，并由标准曲线测
得溶液中化合物浓度可以得知在25℃化合物溶解度。测定结果得出羟基喜树碱的溶解度是
(4.64±0.24)ug，羟基喜树碱戊二酸单酯解度是(26.17±0.16)ug，说明经过戊二酸酐修饰
后的羟基喜树碱在水中的溶解度增加。
实施例5不同类型二酸单酯的实验数据比较
同实施例1的方法，本发明还制备了不同类型的二酸单酯(N＝3、4、7，n表示二酸碳
原子数；分别为羟基喜树碱丙二酸单酯(N＝3)，羟基喜树碱丁二酸单酯(N＝4)，羟基喜树碱
庚二酸单酯(N＝7))并与羟基喜树碱戊二酸单酯(N＝5)进行比较。综合两项数据来看，羟基
喜树碱戊二酸单酯(N＝5)是最佳的选择。参见表五。
表五不同类型二酸单酯溶解度和MCF-7细胞抑制率(n＝5)