体内染色化合物及其用于鉴别发育不良组织的方法 本发明涉及新的可以在人体内局部应用的生物染色化合物。
另一方面，本发明涉及用这类新化合物在体内鉴别可疑的发育不良组织，即异常组织的方法。
另一方面和更进一步的方面，本发明涉及新化合物及其用于体内诊断的方法，该方法特别适于检测可疑的发育不良的口腔组织，尤其是癌症和癌症前期的组织。
通过下文对本发明的详细描述和附图，各种实施方案及操作对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图简述
图1是方法流程图，描述了合成本发明新化合物的方法。背景技术
大多数上皮组织病变是由外伤引起的。然而，有些病变是发育异常的肿瘤，其中的一些可能是良性的，但另一些可能是癌或者癌症前期的肿瘤。此外，许多发育不良的病变很微小，容易被临床医师常规的目视检查所遗漏，特别是那些在体腔内，如口腔内的病变。
已知一种识别和指示可疑的发育不良组织的体内诊断检测法。该筛选检测法用选择性染色癌症和癌症前期组织的甲苯胺蓝0(托洛氯铵)作体内染色剂，该法在Mashberg的美国专利4,321,251和Tucci等人的美国专利5,372,801中有大致描述。用Mashberg的方法，一旦鉴别出可疑地发育异常的病变，即可以取常规的活体样品进行组织学检验，以确定病变是否为恶性或者癌症前期的。进行这种检测的试剂盒含有预先混合的染料和数量及浓度适宜的清洗液。试剂盒由日拉公司(Zila，Inc.)取得许可，在若干个国家均可通过商业途径获得，商标是ORASCREEN和ORATEST。发明简述
本人现已发现可作为体内生物染色剂、用于选择性染色和指示发育不良组织的新化合物。这些化合物具有如下结构式：其中X是氢，甲基或Y；Y是-NH-R或氢；R是甲基或示例性地，这些化合物包括(I)(II)(III)(IV)(V)和(VI)制备方法的简要说明
本发明化合物的合成过程类似于(除以下注明之外)美国专利418,055中描述的制备甲苯胺蓝0(“TB0”)的过程，该专利于1889年11月30日被授予Dandliker等人。Dandliker合成是三步氧化的一系列反应：(1)氧化N，N-二甲基-对-亚苯基二胺，如用重铬酸钾氧化，以形成2-氨基-5-二甲氨基苯硫代硫酸；(2)用邻-甲苯胺与硫代硫酸缩合，以形成相应的吲哒胺-硫代硫酸；(3)吲哒胺-硫代硫酸的闭环反应，如在络合剂的存在下，在沸腾温度加热30分钟，以生成甲苯胺蓝0。然后冷却反应混合物，盐析出闭环的反应络合物。可以通过重复进行再溶解和再沉淀完成络合物的纯化。
本发明化合物的制备方法不同于Dandliker合成，体现在络合剂在第三步氧化之前加入，优选地在第一步氧化期间加入，以及用高压液相色谱(HPLC)将本发明的新产物从沉淀复合体中分离出来。产物用于检测上皮癌的简要说明
除了用新化合物中的每一种代替甲苯胺蓝0之外，按照Mashberg的方法使用本发明的新化合物，以选择性染色发育不良的上皮组织。因此，本发明也预期到一种在人体内检测发育不良之组织的方法，其包括将含有上述新产物之一或其混合的组合物用于人上皮组织的步骤。制备本发明产物的生产过程的详细描述
图1是描述本发明新化合物制备方法的流程图
用于合成的起始原料10是市售高纯度的N，N-二甲基-对-亚苯基二胺。一次反应混合物的形成
在酸、硫酸铝和试剂13如氯化锌(确信试剂13能够络合中间体，并在后面的制备阶段中用于络合反应产物组分)的存在下，优选在低于10℃，特别优选在低于5℃的温度下，起始原料10的水溶液通过与适宜的氧化剂12，如重铬酸钾12反应，被氧化成11。然后加入硫代硫酸离子源14，如硫代硫酸钠，以形成含一次反应混合物15，其含有第一个中间体2-氨基-5-二甲氨基苯基硫代硫酸。二次反应混合物的形成
优选在不高于10℃的温度下，首次反应混合物15进一步与加入的氧化剂16如重铬酸钾，以及与邻甲苯胺17反应，在缩合反应步骤18中形成第二个中间体，二次反应混合物19中的缩合产物吲达胺硫代硫酸。三次反应混合物的形成
优选地通过加入合适的氧化剂22如重铬酸钾，在不高于10℃的温度下，二次反应混合物19被进一步氧化成21。随后加入硫酸铜、氯化锌络合剂、酸，并加热至100℃以使吲达胺环有效封闭，形成三次反应混合物24中的反应终产物。此时从三次反应混合物中分离并纯化反应产物。三次反应产物的分离及纯化
例如，在本发明方法的优选实施方案中，通过用合适的络合剂25如氯化锌，与24络合，从三次反应混合物中沉淀出反应产物，形成复合的氯化锌双盐。从液相中过滤出沉淀物26，用氯化钠溶液27洗涤。将清洗过的滤饼重新溶于严格定量的水29中(如用水过多，则影响反应产物分离；如用水过少，则①反应产物不能全部溶解，减少了产量，②降低了产物纯度)，形成反应产物的溶液30。再次过滤31以去除不溶的固体32a，弃不溶固体。在滤液32中加入氯化锌，然后加入体积/浓度严格控制的氯化钠溶液33(如用氯化钠过少，不能盐析出全部反应产物，降低了产量；如用氯化钠过多，杂质会反应产物一并析出，降低产物的纯度)，再次沉淀出氯化锌双盐。
通过过滤从混合物中分离出双盐产物，产生滤饼34，如虚线35所示。可以多次再溶解、过滤、再沉淀和再分离滤饼。以获得理想纯度和产量的双盐络合反应产物。然后将最终纯化的滤饼络合产物34溶于水，用HPLC分离出本发明的新化合物，叙述如下。
实施例
提供下列实施例以说明本发明，实施例能够使本领域技术人员制备本发明的新化合物，并用这些新化合物进行新的诊断实践，这些内容共同构成本发明的各种实施例。实施例还向本领域技术人员揭示了目前已知的实现本发明的各种实施例的最好方式。实施例仅是说明性的，并不限制本发明的范围。本发明的保护范围以权利要求书为限。
实施例1
制备方法
本实施例描述了制备一批染色络合物的确切过程以及用HPLC从络合产物中分离本发明新化合物的方法。原料溶液的制备设备/供给：
A.Ohaus IP15KS 天平
B.AnD HV150KAI 天平
C.Fairbanks H90-5150 天平
D.OHAUS WB25/1-20W 天平
E.Cole Parmer(51201-30)和Thermolyne(S25535)加热搅拌器
F.取样器材，如钢匙、鼓式采样器(drum samples)等
G.Erlyenmeyer烧瓶、烧杯、玻璃瓶及其它适用的玻璃器皿
H.产品溶液标签安全性：
根据MSDS指南，操作化学物品时，应着防护装备，如手套、防护镜、实验服和防护面具。原料溶液的制备过程：
盐酸溶液：1364.2g(±5.5g)盐酸加1364.2g(±5.5g)USP纯水，搅拌至溶液澄清。
十六水硫酸铝溶液：1779.1g(±7.0g)十六水硫酸铝加2548.9g(±10.0g)USP纯水，搅拌至溶液澄清。
氯化锌溶液：7384.6g(±30.0g)氯化锌加2786.7g(±11.0g)USP纯水，搅拌至溶液澄清。
重铬酸钾溶液：2101.9g(±8.0g)重铬酸钾加25203.8g(±100g)USP纯水，搅拌至溶液澄清。
五水硫代硫酸钠溶液：1526.6g(±6.0g)五水硫代硫酸钠加2043.6g(±8.0g)USP纯水，搅拌至溶液澄清。
五水硫酸铜溶液：509.7g(±2.0g)五水硫酸铜加1613.1g(±6.0g)USP纯水，搅拌至溶液澄清。
硫酸溶液：600.0g(±2.0g)硫酸加600.0g(±2.0g)USP纯水，搅拌至溶液澄清。
氯化钠溶液：70.4kg(±250g)氯化钠加234.4kg(±850g)USP纯水，搅拌至溶液澄清。
合成合成设备和供给：
LFE控制板(3000)
20加仑套层玻璃内衬带盖纯化罐(E71224)
2个100加仑套层玻璃内衬带盖纯化罐(P1，PT-001)(P2，L-13621)
FTS循环冷却器(RC96C032)和500加仑低温储存罐(500CST)
3个带转轴和叶轮的Caframo混合器(BDC-1850)(R1，18500961)(P1，18501148)(P2，18501173)
Lightning混合器(L1U08)(201550)
3个热交换器(Gardner Machinery)(R1，01960763)(P1，01960764)(P2，08950727)
3个12KW套层液体循环器(Watlow，BLC726C3S 20)
3个循环泵(Sta-Rite，JBHD-62S，C48J2EC15)
Masterflex数字蠕动泵(A94002806)
Masterflex蠕动泵(L95003320)
Cole Parmer蠕动泵(B96002074)
Neutsche滤器(70-2038，43421-1)
2个布氏滤器(Z11，624-6，Z10，441-8)
Siemens真空泵(F2BV2)
60加仑套层玻璃内衬带盖收集罐(86854，E164-1186)
空气压缩机(DF412-2)(9502312538)
流量控制器(3-5500)(69705069190)
6个批量控制器(3-5600)(#1，69705069191，#2，69705069199，#3，69705069194，#4，69705058829，#5，69705058805′#6，69705069195)
6个流量传感器(#1，69704295165′#2，69704024995，#3′69704024994，#4.69704025027，#5.69612178606，#6，69703120990)
4个隔膜泵(M1)
4个电流抑制器(A301H)(#2，15557，#3，15561，#4，15558，#5，15559)
4个空气调节器(CFR10)
4个电磁阀(与空气调节器一并使用)
4个低流量传感器(FS-500)
3个电磁阀(EASM5V16W20)
空气过滤器/调节器(T1R)PTFE/F06R113AC
滤膜，聚丙烯(7211-1)
滤膜，Whatman级 52
PharMed管(-18，-82，-90)
pH计；Hanna 9321(1303675) & Orion 620(001911)
分光光度计20(3MU7202070)
Fisher Scientific真空炉(9502-033)
VWR 1370 FM鼓风炉(1370FM)
尘/雾防毒面具(Dust/Mist R6spirator)
Thomas Wiley实验室研磨机(3375-E10)
Patterson-Kelley搅拌器(Blendmaster，C416578)
OMS TS4KD 天平
OHAUS IP15KS 天平
Mettler AG 104 天平
AnD HV150KA1 天平
Fairbanks H90-5150 天平
OHAUS AS123 打印机
OHAUS AS142 打印机
AD-8121 多功能打印机
Citizen iDP 3540 点阵打印机
Hewlett Packard 高压液相色谱仪(1050)
超声清洁器(8892-DTH，QCC9601 005C)
K型热电偶温度记录器(KTx，6292753，6355146)
Erlenmeyer烧瓶(8L，6L，4L，1L)
烧杯(8L，6L，500ml，250ml)
大玻璃瓶(4L，10L，50L)
HDPE鼓形圆桶(55加仑，100加仑)
容量瓶(100ml)
塑料漏斗
Pastuer移液管及球形管和容量移液管(10ml，50ml)及球形管
风箱(25ml，50ml)
称量纸
刮刀
包装材料(容器、盖、标签)原料溶液
合成：步骤1.
2-氨基-5-二甲胺基苯基硫代硫酸的合成：·检验USP纯水系统的完整性，在反应器中加入称重的USP级纯水(28,000g±100.0g)，以190±10RPM速度搅拌。·加入N，N-二甲基-1，4-亚苯基二胺(5.128mol，720.0g±3.0g)， 原料应以粉剂加入(无块状物)。搅拌10分钟(±5分钟)。·加入盐酸(6N，1136.9g±5.0g)。搅拌15分钟(±5分钟)。·用塑料取样装置取反应混合物样品约10ml，检测pH。在25℃±5℃，pH 须为2.8-3.8。·加入十六水硫酸铝溶液(4328.0g±21.0g)。搅拌10分钟(±5分钟)， 速度为275±10RPM。·加入氯化锌溶液(3641.5g±18.0g)。冷却至4℃±1℃。·一旦温度(PV1)至4±1℃，加入重铬酸钾溶液(6532.4g±32.0g)， 作用20分钟以上(±5分钟)，加入完成后搅拌20分钟(±5分钟)。·维持温度至少约10℃以下，加入五水硫代硫酸钠溶液(3570.2g±18.0 g)。在10℃搅拌该溶液30分钟(±5分钟)。·改变设定度至60℃。当温度(PV1)达到60℃±3℃时，可以搅拌反应混 合物5分钟(±3分钟)，改变LFE控制器设定度至10.0。·一旦温度达到13.0℃±2.0℃，检测pH。在25℃±5℃，pH须为3.1-4.1。
合成：步骤2.
硫代硫酸吲达胺的合成：·称取邻甲苯胺(604.4g±2.5g)并在冰浴中冷却至18℃±3℃。将盐 酸(6N，1230.7g±5.0g)缓缓加入邻甲苯胺，从冰浴中取出邻甲苯 胺盐酸，使溶液冷却至38℃±3℃。将该溶液加入反应混合物中，搅拌5 分钟(±3分钟)。·加入重铬酸钾溶液(6532.4g±32.0g)作用20分钟(±5分钟)以上。 加入完成后搅拌10分钟(±5分钟)。·改变控制器的设定度(SP1)至60℃。一旦温度达到60℃±3℃时，搅拌 反应混合物25分钟(±5分钟)。将会形成由绿色吲达胺组成的沉淀物。
合成：步骤3.
氯化锌双盐的合成：·设定LFE控制器的设定度至7.0。一旦反应混合物的温度达到10.0℃± 3℃，加入重铬酸钾溶液(6532.4g±32.0g)作用20分钟(±5分钟) 以上。加入完成后搅拌20分钟。·加入重铬酸钾溶液(5225.9g±26.0g)作用20分钟(±5分钟)以上。 加入完成后搅拌20分钟(±5分钟)。·加入氯化锌溶液(3641.5g±18.0g)。350±10RPM，搅拌20分钟(± 5分钟)。·加入五水硫酸铜(2122.8g±10.0g)。搅拌15分钟(±5分钟)。·改变控制器设定度(SP1)至100.0。一旦反应混合物的温度达到67.0 ℃±3℃，开始添加硫酸溶液，通过加入等分试样调节至pH 2.9±0.3 (500ml，250，125ml等)。每次添加和检验pH后，搅拌5至10分 钟。·一旦反应混合物的温度达到100.0℃±3℃，搅拌混合物35±5分钟。·改变控制器设定度(SP1)至35.0。当反应混合物温度达到70.0℃±3℃ 时，改变控制器的设定度(SP1)至2.5，在4小时内将温度冷却至2.5 ℃，在2.5℃±2.0℃保持4-18小时。
纯化：步骤1·将反应混合物通过合适的滤膜进行过滤(Whatman级52)。·反应器清空后，称取24.0kg±150.0g 30％NaCl溶液，并加入24.0kg ±150.0g USP水。关闭反应器底阀，将15％NaCl溶液加入反应器。轻 轻搅拌溶液。过滤完成时，在滤器中加入NaCl溶液以冲洗滤饼。·检查100加仑套层玻璃内衬纯化罐#1的状况，确保罐清洁并配有高密 度聚乙烯(HDPE)盖、Caframo搅拌器、搅拌轴、搅拌叶轮和插入塑料 热电偶套管中的热电偶探针。检查底阀的关闭和出口封闭的情况。·称取190.0kg±1.0kg USP水，置于高密度聚乙烯(HDPE)容器内，将 水移至纯化罐1中。以350 RPM转速搅拌混合物。一旦NaCl冲洗滤饼 进行完毕，边搅拌边将滤饼加入纯化罐1中。·搅拌混合物2-4小时。·设定纯化罐1 LFE控制器至75.0(SP1)。·当混合物温度(PV1)达到75.0℃±3℃时，改变控制器设定度至40.0。·在40℃、350 RPM搅拌混合物12-36小时。·取样约50ml(通过底阀)，用1.0ml移液管量取1.0ml样品，在容 量100ml的烧瓶中稀释至100ml。然后用10.0ml移液管量取10.0ml 该溶液，在容量100ml烧瓶中稀释至100ml。用spectronic 20+测定 样品的光吸收，样品的光吸收应≥0.220。
纯化：步骤2·将混合物通过滤器中的滤膜进行过滤。将滤液收集到配衡(Tared)的HDPE 加盖容器中。·100加仑玻璃内衬套层纯化罐2配备盖、搅拌器、搅拌轴、已插入塑料 热电偶的套管中的叶轮和热电偶探针。·利用下述公式，称取与上述溶液等体积的30％NaCl溶液，置于洁净的HDPE 容器中。·M1(溶液体积)×116.91g(NaCl溶液重量)/100.0ml(NaCl溶液体积) ＝g(NaCl溶液重量)·样品≈10ml滤液，检测pH。pH应为3.0-4.0。将滤液转移至纯化罐 2,350 RPM搅拌该溶液。·加入氯化锌溶液(1636.3g±6.5g)·将NaCl溶液(称重)转移至纯化罐2中。·设置纯化罐2 LFE控制器至75.0(SP1)。·当混合物温度(PV1)达到75.0℃±3℃时，改变控制器设定度至5.0。·6小时内冷却至5℃，于5℃±4.0℃保持4-24小时。
加工：i.过滤·在滤器中，将混合物通过称重的过滤介质(Whatman级52)进行过滤。 称取12kg±50g 30％氯化钠溶液并用12kg±50g USP水稀释。通过 将溶液直接加入布氏漏斗，用15％氯化钠溶液冲洗滤饼。过滤完毕后， 小心移去含有产物的滤纸。ii.干燥·将纯化的络合反应产物置于炉中，50.0℃±3.0℃干燥5±1小时。·从鼓风炉中取出络合反应产物并置于真空炉中。于45.0℃±3.0℃，28” Hg±2”Hg干燥10±2小时。iii.研磨·在Thomas Wiley实验室研磨机中安装0.5mm筛。输送槽接一个洁净容 器。研磨腔阀门务必关闭并闭锁。·关闭漏斗底部的滑动门，移开漏斗盖，加入干燥的络合产物。重盖上漏 斗盖。开动磨粉机，轻轻打开滑动门。以足够缓慢的速度将产物加入研 磨腔，以不使研磨机减速或阻塞。·研磨完成后，从输送槽小心取下容器。v.混合·将产物转至Patterson-Kelly实验室混合容器中，闭盖。定时15分钟 ±5分钟。
用HPLC分离的过程
本实施例描述了从上述经干燥、研磨和混合而制得的络合产物中，分离本发明新化合物的HPLC过程。A.仪器与设备 1.HPLC层析过程
a.HP1100 HPLC色谱系统
b.HP1100二极管阵列(Diode-array)检测器
c.HP1100四元(Quaternary)HPLC泵 2.馏分的收集和纯化
a.ISCO Foxy Jr.，10管道分步收集器 b.Bǚchi，model R-124旋转蒸发器 c.Sep-pak筒(cartridge)，C18，Varian3.质谱分析 a.电子碰撞：质谱(EI-MS)
1.质谱仪：VG分析ZAB 2-SE
2.源温：200℃
3.电压：70eV
4.探针样品：固体探针
5.探针温度：280℃ b.液相色谱/质谱(LC-MS)
1.HP1100真空抽气二元泵
2.溶剂A：水∶ACN(88∶12)v/v含0.1％TEA
3.溶剂B：水∶ACN(1∶1)v/v含0.1％TEA
4.梯度：在18分钟内，将溶剂B的浓度由0％提高至30％；
27分钟后提高至100％，维持3分钟
5.流速：1.5ml/分钟
6.柱：Water Symmetry C18柱(4.6mm×250mm，5μm)
7.柱温度：40℃
8.检测器：可变波长UV，290nm
9.质谱仪：VG Bio-Q三倍四极质谱仪
10.操作模式：正电子喷雾电离(+ESI)模式
11.源温：80℃ c.高速原子轰击(FAB-MS)
1.质谱仪：VG Analytical ZAB 2-SE
2.样品注入：铯离子枪
3.数据系统：带PDP 11/73的VH Analytical 11-250J d.电子喷雾质谱(ESI-MS)
1.质谱仪：VG Biotech Bio-Q四极分析仪
2.操作模式：负离子直接解离
3.注入量：50-75μl
4.洗脱剂：含0.1％FA的50％ACN水溶液
5.流速：10U μl/分钟 e.电子喷雾质谱MS/MS(ESI-MS/MS)
1.质谱仪：VG Quattro II Bio-Q三倍四极分析仪
2.轰击气：氩气
3.样品等分试样：50-75μl
4.洗脱剂：50％ACN水溶液，含0.1％TFA
5.流速：10μl/分钟 f.高溶解质谱(HR-MS)
1.质谱仪：VG Analytical ZAB 2-SE
2.样品注入：铯离子枪
3.数据系统：带有PDP 11/73的VH Analytical 11-250J4.核磁共振色谱(NMR) a.400MHz Varian Inova NMR5.X-衍射单晶分析 a.Nonius CAD4,586型，自动单晶衍射器 b.X-衍射铜管，聚焦良好(λ＝1.5418) c.随机定位照相装置，Polaroid，57-3型 d.快速数据采集软件
e.MOLEN数据翻译软件B.化学品、试剂和标准品 1.化学品和试剂
a.乙腈(ACN)，HPLC级
b.甲醇(MeOH)，HPLC级
c.氯仿(CHCI3)，HPLC级
d.冰醋酸(GAA)，ACS级
e.盐酸(HCI)，ACS级
f.Milli-Q水
g.三乙胺(TEA)，HJPLC级
h.乙酸铵，AR级
i.固体氢氧化钠(NaOH)，试剂级
j.氮气，零级
k.氘化甲醇(d4-MeOH)
l.氘化二甲基亚砜(d6-DMSO)
m.重水(D2O)
n.氘化盐酸(DCI)
o.四苯基硼酸钠，试剂级
初始准备HPLC系统2
用于化合物的馏分收集
初始馏分收集
稀释液-制备0.1M乙酸溶液，用NaOH调pH至6.1±0.1
流动相A-88∶12 稀释液∶ACN
流动相B-50∶50 稀释液∶ACN
样品制备：用水稀释经干燥、混合的络合反应物，制备浓度为15mg/ml的溶液。将30-40ml溶液放入10g C18 SPE筒，用约20ml稀释液洗涤，然后用约10ml水洗涤。用约10ml在MeOH中的0.01N HCI洗脱。旋转蒸发洁净的样品至其干燥，样品重新溶解于稀释液中。
色谱系统：带有柱加热装置的AP 1100 HPLC系统备有7μm，30.0cm×7.8mm的C18柱，和合适的可在290nm检测的紫外检测器及二极管阵列(Diode-array)，设定流速5.0ml/分钟，柱温20℃。用下列梯度洗脱。
％移动相
时间(分) A B
0 80 20
15 60 40
15.1 0 100
25 0 100
25.1 80 20
过程：将900μl样品溶液注入色谱系统，用多管道馏分收集器收集感兴趣的峰。一旦收集到所有的馏分，旋转蒸发每一馏分以去除大部分乙腈，然后在C18 SPE筒中进行浓缩，用水洗涤，用约10ml在MeOH中的0.01N HCI洗脱，旋转蒸发洗脱液至干，留待进一步纯化。
终末馏分收集
流动相A-88∶12 0.1％ TEA∶ACN
流动相B-50∶50 0.1％ TEA∶ACN
样品制备：从初始馏分收集物中制备蒸干馏分的溶液，用流动相A洗脱。
色谱系统：带有柱加热装置的HP 1100 HPLC系统备有7μm，30.0cm×7.8mm C18柱，和合适的可在290nm检测的紫外检测器及二极管阵列(Diode-array)，设定流速设为5.0ml/分钟，柱温30℃。用下列梯度洗脱。
％移动相
时间(分) A B
0 73 27
8 70.6 29.4
8.1 45 55
9 45 55
16 25.5 74.5
16.1 73 27
过程：将200μl样品溶液注入色谱体系，用多管道馏分收集器收集感兴趣的峰。一旦收集到所有的馏分，旋转蒸发每一馏分以去除大部分乙腈，然后在C18 SPE筒中进行浓缩，用水洗涤，用约10ml在MeOH中的0.01N HCI洗脱，在干燥的氮气流中干燥馏分用于鉴定。
化合物IV的特征分离
化合物IV用部分修改的(semi-reparative)HPLC进行分离。收集馏分，大部分乙腈被旋转蒸发去除，用C18 SPE筒进一步浓缩馏分，用水洗涤，用约5ml在MeOH中的0.01N HCI洗脱，在干燥的氮气流中干燥馏分。部分物质重新溶于流动相并注入HPLC系统以确定镏分纯度。注入的化合物IV的纯度为95％，8.2mg用于NMR检测。质谱分析
经研磨、混合的络合反应物的初步LC-MS质谱数据表明，化合物IV的分子量约75.3m/z。从LC-MS收集馏分，进行进一步的HR-MS的研究表明，化合物IV的质量是375.1655m/z，分子式是C22H23N4S1。用正ESI-MS/MS检测化合物IV 375m/z母离子的子体。碎片模式显示从化合物IV分子离子中主要失去16amu和44amu，产生化合物IV之结构。该化合物及其N-和N，N-二甲基衍生物，化合物V和VI是由母体化合物(TBO)与过量的起始物质邻二甲苯的二级反应形成的。
化合物I的特征分离
化合物I用部分修改的HPLC进行分离。收集馏分，大部分乙腈被旋转蒸发去除，用C18 SPE筒进一步浓缩馏分，用水洗涤，用约5ml在MeOH中的0.01N HCI洗脱，在干燥的氮气流中干燥馏分。部分物质重新溶于流动相并注入HPLC系统以确定馏分纯度。注入的化合物I的纯度为95％，18.9mg用于NMR检测。质谱分析
经干燥、混合的络合反应物初步的LC-MS质谱数据表明，化合物I的分子量约284.1m/z。从LC-MS收集镏分，进一步进行HR-MS研究表明，化合物I的分子量是284.1223m/z，分子式是C16H18N3S1。用正ESI-MS/MS检测化合物I的284m/z母离子的子体。结构和碎片模式表明，从分子离子中主要失去16amu、30amu和59amu，产生了化合物I的结构。化合物I及其N-和N，N-二甲基衍生物，化合物II和II是由一个甲基基团自由基从另一个脱甲基分子中清除(scavenging)脱离到相应母体TBO异构体上形成的。
用上述分离鉴定化合物VI和I的方法，进行化合物II、III、V和VI的分离和特征鉴定。
实施例2
临床检测方案临床检测溶液的制备
本实施例举例说明实施例1的每个产物在鉴别口腔组织发育异常中的应用。
将化合物I、悬钩子香味剂(IFF Raspberry IC563457)、三水乙酸钠缓冲液试剂和H2O2(30％ USP)防腐剂(见美国专利5,372,801)溶于纯水(USP)、冰乙酸和SD 18乙醇以制备检测液，其具有表A所示的组分：
表A
组分 重量％
化合物I 1.00
香味剂 .20
缓冲剂 2.45
防腐剂 .41
乙酸 4.61
乙醇 7.48
水 83.85
100.00
制备1wt.％的乙酸/纯水预清洗检测液(Pre-rinse)和后清洗检测液(Post-rinse)、安息香酸钠防腐剂和悬钩子香味剂。临床方案
患者戴围兜以保护衣服，因预见有痰，故为患者提供10-oz.口杯一个。口杯能够在感染废物容器中处理，或者杯内容物可直接倾入水槽排水沟中央，防止污染水槽。环境表面或可能被污染的物品应覆盖或从试验区移开。
进行口腔癌的目视检查，不使用任何可能引起软组织切口或伤口的器械。在预染色的软组织和牙齿表面做记号。
患者用约15ml预清洗液洗漱口腔约20秒并咳出，以去除多余唾液，提供稳定的口腔环境。用额外的预清洗液重复该步骤。
患者再用水冲洗及漱口约20秒，咳出。
患者再用30ml检测液冲洗及漱口1分钟，咳出。
患者再用15ml后清洗液冲洗口腔约20秒，咳出。重复该步骤。
患者再用水冲洗及漱口20秒，咳出。重复此步骤。
然后用适宜的软组织检查技术进行口腔观察，如有必要，包括进行退缩、平衡光照和放大检查。记录保持蓝色染色的可疑病变的位置、大小、形态、颜色和表面特征。
为减少假阳性，病人于10-14日后返回，重复进行上述方案。这个期间为第一次检查时出现的溃疡、外伤或刺激性病因的治愈留有时间。第一次检查的可疑部位在第二次检查后仍为阳性染色的，认为是癌变或癌症前期组织的迹象，做活体组织切片检查以确定此结论。
早期红细胞成形的病变染色呈蓝色，常为点彩状或斑状。但舌背上不规则乳状裂缝保持该染色是正常的，非阳性显示。其它保持蓝染色但不认为阳性的区域包括牙斑、每枚牙齿的牙龈缘、因染料从舌背上留存的染色剂转移造成软腭的弥散染色和易鉴别的溃疡性损伤等。在所有的病例中，对于高度可疑、但本检测未呈阳性染色的病变，必须进行活体组织切片检查。
实施例3-7
除了用化合物II，III，IV，V和VI代替化合物I之外，重复上述方案。获得类似的结果。
对本发明的描述足以使本领域技术人员理解和实施该发明，还鉴定出本发明目前最佳的实施方式。本人的权利要求如下。