本发明涉及一种制备叶酸的新方法。 Robert B.Angier et al.（JACS，70（1948），25）叙述了使用不含卤素化合物制备叶酸的方法，即通过使对一氨基苯甲酰基-L-谷氨酸二乙酯与2-羟基丙二醛反应，分离出对-（2，3-二羟基-2-烯-亚丙基氨基）-苯甲酸二乙酯，并使该中间体再与三氨基嘧啶酮反应而制得。在制备过程中，亚胺作为中间体分离出来，叶酸的收率仅为12.6%。
在O：Isler，G Brubacher，S.Ghisla，B.Krautler，Vitamine 11;G.Thieme Verlag Stuttgart（1988）中叙述了其它制法。
在这些方法中，叶酸的收率普遍较低。
本发明的目的是提供一种收率明显高于已知方法的叶酸制法。
令人惊奇地发现，以通式Ⅰ结构的二亚胺为原料，可以得到相当高的叶酸收率，同时可以大大避免付产物的出现：
式中R表示氢或低碳烷，Y表示OH，卤素，磷酸酯（phosphate），二磷酸酯（diphosphate），三磷酸酯（triposphate）或-O-COR′，其中R1代表低碳烷基或苯基。
在本发明领域内“低碳烷基”表示1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等等。优选为直链烷基例如甲基和乙基。
在发明领域内“卤素”一词主要表示氯，溴或碘。优选溴。
式Ⅰ二亚胺中R优选为氢，Y优选为OH。
从B.Etstert et al.（Chem.Ber.88（1955），939）中得知，二亚胺是由2-羟基丙二醛与芳香胺例如苯胺，对一氨基苯甲酸或对-氨基苯甲酸酯反应而制得。
上述式Ⅰ二亚胺是一类新化合物，并且也是本发明的目的产物。
按照本发明方法包括在亚硫酸盐，或在水中能形成亚硫酸盐的无机化合物存在下，在pH值为3-8，温度约为0-100℃的条件下，上述式Ⅰ二亚胺与三氨基嘧啶酮反应。
例如化合物Na2SO3，K2SO3，NaHSO3，Na2S2O5或SO2等，可用作亚硫酸盐或在水中能形成亚磷酸盐的无机化合物。也可使用三氨基嘧啶酮亚硫酸酯。
式Ⅰ的二亚胺向式Ⅱ的叶酸或叶酸烷基酯的转化是按下列反应路线进行的：
式Ⅰ二亚胺向式Ⅱ叶酸的转化过程中，上述亚硫酸盐是必不可少的。如果没有它们的存在，将有利于付产物地生成。
优选使至少约1当量的三氨基嘧啶酮在0.3-3当量的亚硫酸钠存在下，于pH值为5-7，温度为5-40℃的条件下，与式Ⅰ的二亚胺反应。更为优选的是约1当量的亚硫酸钠存在下，三氨基嘧啶酮与式Ⅰ的二亚胺的反应于约10℃进行。该反应可在水溶液或可与水混溶的惰性有机溶剂例如乙腈、二甲基甲酰胺、二噁烷、甲醇、四氢呋喃等溶剂中进行。优选水为溶剂。当使用其它溶剂时，它们应与水混合，并且水含量应大于30%。另外，反应应在反应物浓度为约0.05-1mol/l时进行。优选为0.1-0.5mol/l。
在本发明中作为原料的式Ⅰ二亚胺可用已知的方法制备，例如可用式Ⅲ2-取代丙二醛对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸或式Ⅳ对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸酯在酸性条件下反应制得：
式中Y如式Ⅰ所定义;
式中R如式Ⅰ所定义。每当量的式Ⅲ2-取代丙二醛可使用至少约2当量的对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸或式Ⅳ对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸酯。反应在水性介质中进行，并任意添加惰性水混溶性的有机溶剂例如乙腈，二甲基甲酰胺，二恶烷，甲醇，四氢呋喃等。
特别优选2-羟基丙二醛与对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸反应，并且反应在pH值低于4，温度范围在约0-60℃条件下进行。
替代上述式Ⅲ2-取代丙二醛，也可使用2-取代丙二醛四烷基缩醛或式Ⅴ2-取代丙二醛半缩醛：
式中R如上所定义。
在酸性水解条件下，会由式Ⅴ化合物就地生成式Ⅲ2-取代的丙二醛，然后由式Ⅲ2-取代丙二醛生成式Ⅰ二亚胺。
采用一种新方法特别有利，其中式Ⅴ化合物在离子交换剂存在下发生酸性水解。在本发明范围内优选的离子交换剂有例如DOWEX 50W。
在本发明方法中用作原料的式Ⅰ二亚胺在制成后可以分离出来，并且用于本发明方法中。然而，它们也可以就地制成，因此反应可采用一釜法进行。
当R为低碳烷基的式Ⅰ二亚胺用作原料时，在叶酸分离出来之前，所得叶酸烷基酯能以已知的方法水解。
经过分离或由滤液得到叶酸后，对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸可用合适的溶剂例如丁醇，乙酸甲酯等或相应的溶剂混合物萃取并回收。
使用本发明方法，叶酸的收率可高达理论量的约84%。
以下实施例是本发明方法特别优选的实施方案，但并非用来限制本发明。
实施例1
作为式Ⅰ二亚胺的（S）-2-[4-[3-[4-[（S）-1，3-二羧基-丙基-氨基甲酰基]苯基亚氨基]-2-羟基-丙烯基氨基]-苯甲酰-氨基]-戊烷-1，5-二酸的制备，以及二亚胺向叶酸的转化
将3.6g（20mmol）1，1，3，3-四甲氧基-2-丙醇和40ml 1N HCl在氮气保护下，放入装有温度计和搅拌的五口瓶中，并且该混合物在50℃搅拌5分钟。然后，加入10.65（40mmol）对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸，并在50℃搅拌该混合物1小时。加入约200ml水后，让该二亚胺置于室温结晶24小时，过滤并用水洗涤沉淀。在水注真空中于60℃干燥后得到含水量4%的（S）-2-[4-[3-[4-[（S）-1，3-二羧基丙基氨基甲酰基]-苯基亚氨基]-2-羟基-丙烯基氨基]苯甲酰基氨基]-戊烷-1，5-二酸。收率为理论量的83%;熔点为172-178℃。
20ml水和2.52g亚硫酸钠在氮气保护下加入6.1g含水量为4%的（S）-2-[4-[3-[4-[（S）-1，3-二羧基丙基氨基甲酰基]-苯基亚氨基]-2-羟基-丙烯基氨基]苯甲酰基氨基]-戊烷-1，5-二酸中。在搅拌下用2M碳酸钠溶液调整混合物pH值到6.0。搅拌下于室温慢慢将2.39g（10mmol）三氨基嘧啶酮硫酸酯加入悬浮液中。定量加入2M碳酸钠溶液使pH值保持在6.0。4小时后反应结束。测定红-棕色混合物中叶酸含量。为了这一目的，用220ml水将反应混合物准确稀释至250ml，并且从其中等分移出以便用HPLC（高压液相色谱）测定叶酸含量。以所用二亚胺为基准，叶酸的收率为理论量的69%。
实施例2
在水性介质中通过对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸，2-羟基丙二醛和三氨基嘧啶酮的反应制备叶酸（一釜法）
在氮气保护下，将5.32g（20mmol）对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸和20ml（20mmol）0.1N HCl加入装有温度计和搅拌的100ml五口瓶中。加入0.88g（10mmol）2-羟基丙二醛，并用3ml水洗涤。该悬浮液于室温下搅拌1小时。然后加入4.25ml 2M碳酸钠溶液并搅拌约20分钟。加入2.52g（20mmol）亚硫酸钠并将混合物加热至38℃。在搅拌下，于pH值为6.0，1小时内向悬浮液中滴加2.39g（10mmol）三氨基嘧啶酮。定量加入7.6ml 2M碳酸钠溶液，使pH值保持在6.0。4小时后反应完成。如实施例1所述方法，测定红-棕混合物中叶酸含量。以所用2-羟基丙二醛为基准，叶酸收率为理论量的68%。
为将叶酸从该溶液中分离出来，用乙酸将pH值调到3.0。叶酸沉淀，并滤出。得到3.08g叶酸粗品，其中纯L-叶酸含量为91%。收率为理论量的63.5%。
通过用乙酸乙酯在pH为3.0时彻底萃取的方法，从滤液中回收未反应的对一氨基苯甲酰基-L-谷氨酸。得到3.23g纯对一氨基苯甲酰基-L-谷氨酸含量为90%的对氨基苯甲酰基-L-谷氨酸粗品。纯对一氨基苯甲酰基-L-谷氨酸的含量用HPLC测定。
实施例3
在加有有机溶剂的水性介质中通过对一氨基苯甲酰基-L-谷氨酸，2-羟基丙二醛和三氨基嘧啶酮反应制备叶酸
在氮气保护下，将5.32g（mmol）对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸，12.5ml 0.2N HCl，12.5ml乙腈和0.88g（10mmol）2-羟基丙二醛在装有搅拌和温度计的五口瓶中充分混合，并将混合物于室温放置24小时。然后将2.52g（20mmol）亚硫酸钠溶液加入混合物中，并且将混合物加热至38℃。在搅拌下，于pH值为6.0，将2.3g（10mmol）三氨基嘧啶酮硫酸酯慢慢地加入该混合物中。定量加入2M碳酸钠使pH值保持在6.0。6小时后反应结束。按实施例1的方法测定红-棕混合物中叶酸的含量。由HPLC分析值得知叶酸的收率为理论量的73%。
实施例4
在添加有机溶剂的水性介质中通过对-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸，2-羟基丙二醛和三氨基嘧啶酮反应制备叶酸。
在氮气保护下，在装有温度计和搅拌的五口瓶中，加入5.32g（20mmol）对氨基苯甲酰基-L-谷氨酸，12.5ml 0.2N HCl，12.5ml乙腈和0.88g（10mmol）2-羟基丙二醛，并充分混合，将混合物在室温下放置24小时。然后，加入1.26g（10mmol）亚硫酸钠和9ml 2M碳酸钠溶液，将该混合物于10℃搅拌1小时。在搅拌下于10℃，pH值为6.0慢慢向混合物中加入2.3g（10mmol）三氨基嘧啶酮硫酸酯。定量加入2M碳酸钠溶液使pH值保持在6.0。6小时后反应结束。按实施例1的方法测定红-棕混合物中叶酸含量。由HPLC的分析值得知叶酸的收率为理论量的84%。
实施例5
在水中通过三氨基嘧啶酮和（S）-2-[4-[3-[4-[（S）-1，3-二羧基-丙基氨基甲酰基]-苯基亚氨基]-2-羟基-丙烯基氨基]-一苯甲酰基氨基]-戊烷-1，5-二酸反应制备叶酸
在氮气保护下，将2.23g（10mmol）三氨基嘧啶酮亚硫酸酯，1.26g（10mmol）亚硫酸钠和30ml水加入装有温度计的五口瓶中。然后，在搅拌下于38℃，pH值为6.0慢慢加入6.1g（S）-2-[4-[3-[4-[（S）-1，3-二羧基-丙基氨基甲酰基]-戊基亚氨基]-2-羟基-丙烯基氨基]-戊烷-1，5-二酸（由实施例1得到的二亚胺）。定量加入10ml 2M碳酸钠溶液使pH值保持在6.0。6小时后反应结束。按实施例1的方法测定红-棕混合物中叶酸含量。由HPLC分析值得知叶酸收率为理论量的64%。
实施例6
在离子交换剂存在下通过2-羟基丙二醛四烷基-缩醛酸性水解制备2-羟基丙二醛
将34.2g（190mmol）2-羟基丙二醛-四烷基-缩醛于600ml水中形成的溶液，于室温下通入一玻璃管（260×25mm）中。在玻璃管中装有130g DOWEX50W。溶液的流速为2.5ml/分钟。
在氮气保护下于0℃收集洗脱液，并且于约20mbr，在转式汽化器中将其浓缩至50g。将该悬浮液于约0℃放置18小时。将粗产品过滤并用10ml水洗涤。在水注真空中于40℃干燥4小时后，得到12.04g 2-羟基丙二醛。熔点157/8℃（分解）。含量98%（碘量滴定）。从滤液中又得1.36g2-羟基丙二醛。含量为97%（碘量滴定）。
总收率：13.4g 2-羟基丙二醛为理论量的78%。