基于2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑衍生物的pH荧光探针及其制备方法和应用技术领域
本发明涉及一系列荧光探针，特别涉及基于2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑衍生物的
pH荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，生命健康、环境安全、食品卫生等问题越来越多的受到
关注和重视。pH是生理学、环境学、食品科学等领域的重要参数。适当的pH对生命体的正常
生理活动起着至关重要的作用，同时，特征pH也是环境与食品安全与否的关键指标之一。因
此，对pH的精确快速检测具有十分重要的意义。
荧光光谱法(也称荧光探针法)由于其简单、快速、实时、灵敏度高、选择性好等优
良特点，已经成为一种重要的pH检测方法。通过荧光探针法检测pH的关键在于荧光探针的
设计与合成。由于被测体系背景荧光的干扰，同类荧光探针中，淬灭型响应的荧光探针性能
通常不及增强型荧光响应探针；而由于自参比作用的存在，具有比率型荧光响应性能的探
针通常优于淬灭型和增强型荧光探针，其响应信号不会受到探针自身浓度的影响，并且通
常具有更高的信号放大倍数和更好的检测限。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种具有多种发射波长、大斯托克斯位
移、高荧光量子产率，可在水溶液和固体状态下对pH进行荧光比率型识别的2-(2’-羟基苯
基)苯并噻唑(HBT)衍生物，制备方法以及其在溶液样品pH检测、食品样品挥发性酸碱气体
识别，细胞内pH值成像及检测中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
基于2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑衍生物的pH荧光探针，其特征在于，包含有选自式
(Ⅰ)或式(Ⅱ)的结构式：
在式(Ⅰ)的结构式，R基团为吡啶基、噻吩基、喹啉基、呋喃基、嘧啶杂环芳香基团
基、羟基、甲基、甲氧基、羧基或磺酸基；
在式(Ⅱ)的结构式，R基团为吡啶基、噻吩基、喹啉基、呋喃基、嘧啶杂环芳香基团
基、羟基、甲基、甲氧基、羧基或磺酸基。
在式(Ⅰ)的结构式中，R基团直接与2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑母体相连。
在式(Ⅱ)的结构式中，R基团通过苯环与2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑母体相连。
一种基于2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑衍生物的pH荧光探针的制备方法，包括以下
步骤：
(a)包含有式(Ⅰ)的结构式的pH荧光探针：
在含有R基团的取代水杨醛中加入无水乙醇和氯仿的混合溶液，至含有R基团的取
代水杨醛完全溶解，再加入邻氨基苯硫酚和双氧水，加热至80-90℃，回流反应6-12h，分离
纯化，即得；
(b)包含有式(Ⅱ)的结构式的pH荧光探针：
(1)将5-溴水杨醛和含有R基团的取代苯硼酸加入至钠条重蒸过的四氢呋喃和
2mol/L碳酸钾水溶液的混合体系中，至5-溴水杨醛和含有R基团的取代苯硼酸完全溶解，在
氮气保护的条件下，加入四三苯基磷钯催化剂，加热搅拌条件下回流12-24h，分离纯化，得
到中间产物IV；
(2)在中间产物IV中加入无水乙醇和氯仿的混合溶液，至中间产物IV完全溶解，再
加入邻氨基苯硫酚和双氧水，加热至80-90℃，回流反应6-12h，分离纯化，即得。
步骤(a)和(b)-(2)中，无水乙醇和氯仿的混合溶液中无水乙醇和氯仿的体积比为
1:0.5-1.5。
步骤(a)中，含有R基团的取代水杨醛、邻氨基苯硫酚和双氧水的摩尔比为1:1.5-
2:10-20。
步骤(a)和(b)-(2)中，分离纯化的方法为：将反应产物经减压蒸馏除去溶剂后，再
用石油醚-乙酸乙酯体系进行柱层析提纯。
步骤(b)-(1)中，分离纯化的方法为：将反应产物用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，收
集有机相，经减压蒸馏除去溶剂后，再用石油醚-乙酸乙酯体系进行柱层析提纯。
步骤(b)-(1)中，5-溴水杨醛、含有R基团的取代苯硼酸和四三苯基磷钯的摩尔比
为1:1-2:0.04-0.06。
步骤(b)-(1)中钠条重蒸过的四氢呋喃和2mol/L碳酸钾水溶液的混合体系中四氢
呋喃和碳酸钾水溶液的体积比为1:1。
步骤(b)-(1)中，加热温度为80-100℃。
步骤(b)-(2)中，中间产物IV、邻氨基苯硫酚和双氧水的摩尔比为1:1.5-2:10-20。
一种基于2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑衍生物的pH荧光探针在检测pH方面的应用。
所述的基于2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑衍生物的pH荧光探针，包含有选自式(Ⅰ)或
式(Ⅱ)的结构式：
在式(Ⅰ)的结构式，R基团为吡啶基、噻吩基、喹啉基、呋喃基、嘧啶杂环芳香基团
基、羟基、甲基、甲氧基、羧基或磺酸基；
在式(Ⅱ)的结构式，R基团为吡啶基、噻吩基、喹啉基、呋喃基、嘧啶杂环芳香基团
基、羟基、甲基、甲氧基、羧基或磺酸基。
其合成路线如下：
与现有的pH荧光探针相比，本发明合成的探针具有以下优点和效果：
(1)比率型荧光响应，两个荧光通道的波长相差较远，检测时互不干扰，容易通过
肉眼观察到荧光信号化；
(2)斯托克斯位移大，可以有效避免激发光源对检测的影响；
(3)对pH的响应灵敏度高，其滴定终点可控制在弱酸到弱碱性范围之内，非常适于
对生命样品和食品样品中微小pH变化的检测；
(4)抗干扰能力强，对酸碱的响应不受多数常见金属离子和生命样品中的氨基酸、
葡萄糖等的影响；
(5)合成简单，成本低廉，具有良好的实用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1的探针随pH值变化的荧光发射光谱图。
图2为本发明实施例1的探针随pH值变化，512nm和458nm处荧光的荧光发射强度的
比率变化图。
图3为本发明实施例1的探针随pH值在紫外灯下的荧光照片。
图4为本发明实施例2的探针随pH值变化的荧光发射光谱图。
图5为本发明实施例3的探针随pH值变化的荧光发射光谱图。
图6为本发明实施例4的探针随pH值变化的荧光发射光谱图。
图7为本发明实施例4的探针随pH值变化，551nm和484nm处荧光的荧光发射强度的
比率变化图。
图8为本发明实施例1的探针在固体状态下的荧光激发光谱和发射光谱。
图9为本发明实施例1的探针对pH值响应过程中受生命体内一些氨基酸、金属离子
等物质的影响情况。
图10为本发明实施例1的探针与海拉细胞在不同pH值下共同孵育30min的激光共
聚焦成像图。
图11为本发明实施例1的探针经HCl或NH3蒸汽熏蒸后在紫外灯下的荧光照片。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
2-(2’-羟基-5’-羧基苯基)苯并噻唑的制备
将0.5g(3mmol)5-羧基水杨醛加入50mL无水乙醇和氯仿的混合溶液(体积比1:1)，
完全溶解后，加入0.63g(5mmol)邻氨基苯硫酚和3mL 30％的双氧水，加热至85℃，回流反应
8h。
反应完成后，减压旋蒸除去无水乙醇和氯仿，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂，通过
柱色谱分离，得到产物。通过核磁共振对产物进行表征：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：(TMS,
ppm)3.88(s,1H),7.20(t,1H),7.46(t,1H),7.56(t,1H),7.97(m,1H),8.15(m,1H),8.92(d,
1H).HRMS:[M-H]-，C14H8NO3S-理论值：270.0225，实测值：270.0230。
实施例2
2-(2’-羟基-5’-甲氧基苯基)苯并噻唑的制备
将0.46g(3mmol)5-甲氧基水杨醛加入50mL无水乙醇和氯仿的混合溶液(体积比1:
1)，完全溶解后，加入0.63g(5mmol)邻氨基苯硫酚和3mL30％的双氧水，加热至85℃，回流反
应8h。
反应完成后，减压旋蒸除去无水乙醇和氯仿，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂，通过
柱色谱分离，得到产物。通过核磁共振和高分辨质谱对产物进行表征：1H NMR(400MHz,
DMSO-d6)：(TMS,ppm)3.81(s,3H),7.04(m,2H),7.46(t,1H),7.53(t,1H),7.73(m,1H),8.07
(m,1H),8.14(d,1H),11.05(s,1H)。HRMS:[M+H]+，C14H12NO2S+理论值：258.0589，实测值：
258.0587。
实施例3
2-(2’-羟基-5’-甲基苯基)苯并噻唑的制备
将0.41g(3mmol)5-甲基水杨醛加入50mL无水乙醇和氯仿的混合溶液(体积比1:
1)，完全溶解后，加入0.63g(5mmol)邻氨基苯硫酚和3mL30％的双氧水，加热至85℃，回流反
应8h。
反应完成后，减压旋蒸除去无水乙醇和氯仿，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂，通过
柱色谱分离，得到产物。通过核磁共振和高分辨质谱对产物进行表征：1H NMR(400MHz,
DMSO-d6)：(TMS,ppm)2.35(s,3H),7.00(d,1H),7.23(d,1H),7.45(t,1H),7.55(t,1H),7.98
(s,1H),8.06(d,1H),8.14(d,1H),11.39(s,1H).HRMS:[M+H]+，C14H12NOS+理论值：242.0640，
实测值：242.0633。
实施例4
2-(5-(4-羧基苯基)-2-羟基苯基)苯并噻唑的制备
(1)将0.6g(3mmol)5-溴水杨醛和0.5g(3mmol)对羧基苯硼酸加入至50mL钠条重蒸
过的四氢呋喃和2mol/L碳酸钾水溶液中的混合体系中(体积比1:1)，至5-溴水杨醛和含有R
基团的取代苯硼酸完全溶解，在氮气保护的条件下，加入0.14g(0.12mmol)四三苯基磷钯催
化剂，加热至90℃，搅拌条件下反应24h。用100mL二氯甲烷萃取反应产物，收集有机相。减压
旋蒸除去二氯甲烷，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂，通过柱色谱分离，得到中间产物4-羧基
苯基水杨醛。
(2)将0.73g(3mmol)4-羧基苯基水杨醛加入50mL无水乙醇和氯仿的混合溶液中
(体积比1:1)，完全溶解后，加入0.63g(5mmol)邻氨基苯硫酚和3mL 30％的双氧水，加热至
85℃，回流反应8h。反应完成后，减压旋蒸除去无水乙醇和氯仿，以石油醚-乙酸乙酯为展开
剂，通过柱色谱分离，得到产物。通过核磁共振和高分辨质谱对产物进行表征：1H NMR
(400MHz,DMSO-d6)：(TMS,ppm)7,38(s,1H),7.46(t,1H),7.55(t,1H),7.84(m,3H),8.05(d,
2H),8.10(d,1H),8.16(d,1H),8.60(s,1H),12.01(s,1H),12.97(s,1H).HRMS:[M-H]-，
C20H12NO3S-理论值：346.0533，实测值：346.0538。
实施例5
将实施例1的2-(2’-羟基-5’-羧基苯基)苯并噻唑(探针)稀释于10mmol/L的PBS缓
冲溶液(pH 7.4)中，配制成探针浓度为10μmol/L的溶液。在溶液中加入1mmol/L盐酸或
1mmol/L氢氧化钠调节溶液的pH值，记录其荧光光谱变化(图1)。从图1可以看出，在低pH值
条件下，溶液在512nm有强烈荧光发射，随着pH升高，该发射峰逐渐降低并消失，同时，458nm
处出现新的荧光发射峰，并随着pH的升高逐渐增强。以458nm和512nm的荧光发射强度的比
值对pH作图，可得到该探针的pH滴定曲线，其滴定终点位于pH6附近(图2)。在紫外灯下，随
着pH的升高，溶液荧光从绿色逐渐变为蓝色(图3)。
实施例6
将实施例2的2-(2’-羟基-5’-甲氧基苯基)苯并噻唑(探针)稀释于10mmol/L的PBS
缓冲溶液中，pH分别为7和12，配置成探针浓度为10μmol/L的溶液(图4)。如图4所示，在pH7
的条件下，溶液荧光非常弱，荧光光谱峰强度非常低；在pH12的条件下，溶液荧光明显增强，
荧光光谱峰强度较高。
实施例7
将实施例3的2-(2’-羟基-5’-甲基苯基)苯并噻唑(探针)稀释于10mmol/L的PBS缓
冲溶液中，pH分别为7和12，配置成探针浓度为10μmol/L的溶液(图5)。如图5所示，在pH7的
条件下，溶液表现出黄色荧光，荧光光谱最大发射峰出现在535nm，强度较低；在pH12的条件
下，溶液表现出绿色荧光，荧光光谱最大发射峰出现在476nm，强度较高。
实施例8
将实施例4的2-(5-(4-羧基苯基)-2-羟基苯基)苯并噻唑(探针)稀释于10mmol/L
的PBS缓冲溶液(pH 7.4)中，配制成探针浓度为10μmol/L的溶液。在溶液中加入1mmol/L盐
酸或1mmol/L氢氧化钠调节溶液的pH值，记录其荧光光谱变化(图6)。从图6可以看出，在低
pH值条件下，溶液在551nm有强烈荧光发射，随着pH升高，该发射峰逐渐降低并消失，同时，
484nm处出现新的荧光发射峰，并随着pH的升高逐渐增强。以484nm和551nm的荧光发射强度
的比值对pH作图，可得到该探针的pH滴定曲线，其滴定终点位于pH7.5附近(图7)。
实施例9
测量实施例1的2-(2’-羟基-5’-羧基苯基)苯并噻唑的固体激发和发射光谱，得到
其斯托克斯位移为128nm(图8)。
实施例10
将实施例1的探针分别稀释于pH 5和pH 7 PBS的缓冲溶液中，配制成探针浓度为
10μmol/L的溶液。分别考察该探针对pH的响应受到常见的金属离子Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、
Ba2+、Al3+以及生命体中一些氨基酸等物质的干扰的情况：在溶液中分别加入各金属离子和
氨基酸，其中，氨基酸浓度配制为2g/L，金属离子浓度配制为0.1mmol/L(图9)。图9结果表
明，在上述物质存在时，探针在pH 5和pH 7时的荧光比率信号几乎没有变化，也就是探针的
滴定终点和响应能力不受这些干扰物质存在的影响。证明本探针对pH的检测具有良好的抗
干扰能力。
实施例11
将实施例1中的探针稀释于10mmol/L的pH 7.4的PBS缓冲溶液中，配制成探针浓度
为10μmol/L的溶液。用贴壁培养24h后的海拉细胞与该溶液在37℃、5％CO2的培养箱中共同
孵育30min。在激光共聚焦显微镜下，固定激发波长355nm，观察发射波长为371-471nm和
469-566nm两个通道下的荧光信号。随后，通过加入尼日利亚菌素共同培养，改变细胞内pH
值，继续观测上述荧光的变化(图10)。如图10所示，在pH 7.4时，371-471nm荧光通道信号强
烈，而469-566nm荧光通道信号几乎观察不到；随着pH的降低，371-471nm荧光通道信号逐渐
减弱，而469nm-566nm荧光通道信号逐渐增强，呈现出比率变化。
实施例12
将实施例1中的探针稀释于四氢呋喃中，得到浓度为10-3mol/L的荧光探针分子/四
氢呋喃溶液，再将其滴在滤纸上，得到检测试纸。分别用HCl和NH3蒸汽对滤纸熏蒸10s，在
365nm紫外灯光照下的观察荧光颜色和强度(图11)。如图11所示，经过HCl蒸汽熏蒸过的试
纸呈现明亮的绿色荧光，而经过NH3蒸汽熏蒸过的试纸呈现明亮的蓝色荧光。