一种可用于活细胞内丙二醛成像的荧光探针及其制备方法技术领域
本发明涉及生物荧光分析技术领域所用的荧光染料，具体涉及一种可用于活细胞内丙二
醛成像的荧光探针及其制备方法。
背景技术
荧光探针具有时空分辨率高、操作简便及对生命过程干扰小等优点，是研究生命科学、
临床医疗诊断及荧光免疫分析的主要技术手段。在细胞生物学的研究方面，荧光光谱常用于
跟踪细胞内特定成分(靶标)的位置及变化等情况，从而揭示生物靶标的特定生理/病理功能。
目前已经有相当多的针对某种特定生物靶标的商品化荧光探针，如可用于细胞核成像的染料
Hoechst 33342等。由于细胞内的生物靶标很多，因此针对特定靶标的荧光探针的研究是目前
的热门领域。
在生命体的生长发育及疾病发生方面，氧化应激(oxidative stress)扮演了一个相当重要
的角色。氧化应激是指氧自由基过量生成而导致细胞内抗氧化防御系统受损，致使氧自由基
及相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性的病理状态。丙二醛(Malondialdehyde,
MDA)作为氧化应激的一个重要生物标志物(biomarker)，是细胞内脂类化合物的氧化产物，
其表达水平与多种疾病的发生有着密切关系，据报道包括白血病、糖尿病、肿瘤等多种疾病
的发生都伴随着丙二醛含量的升高，因此，对细胞内丙二醛的检测，对于研究与氧化应激有
关的生物及生理作用、揭示相关疾病的致病机制及提供相应的诊疗方法等方面有着非常重要
的意义。
目前有着多种针对丙二醛的检测方法，临床上使用最广的是2-硫代巴比妥酸法，该方法
是对2-硫代巴比妥酸与丙二醛在强酸高温环境下缩合生成的产物进行紫外检测，优点是检出
限低、灵敏度高，缺点是操作繁琐、特异性差、重复性差(参见Anal.Biochem.1979,95,351-358
及Free Radical Biol.Med.1990,9,515–540)。为克服这种检测方法的缺点，已有多种检测方
法被开发出来，包括液相色谱法、电泳法、拉曼光谱法、质谱法等，这些方法的缺陷都在于
检测样品的繁琐前处理，这些前处理过程往往需要强酸性或/和加热的反应条件，因此检测的
对象基本都是体液如尿液、血清等，不能用于生理条件下的在活细胞内的成像。
发明内容
本发明的目的在于克服当前只能用体外检测方法检测丙二醛的缺陷，提供一种可用于活
细胞内丙二醛成像的荧光探针。本发明的目的还在于提供该荧光探针的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种可用于活细胞内丙二醛成像的荧光探针，其结构通式为：
通式中：X为NH、CONH、NHCO、O、S、SO2、SO2NH或NHSO2；
R1为(CH2)nR5、(CH2)mOR6或(CHR7CH2O)pR6，R2为(CH2)nR5或(CH2)mOR6；
R3、R4均为H、Cl、Br、I、NO2、CN、CONHNH2或COOR7；
R1、R2中：n、m、p均为0-18中的整数，R5为H或COOR6，R6为H或C1-18烷基(碳
原子数为1-18的烷基)；
R3、R4中：R7为H、C1-18烷基或M，M为金属离子如Na+、K+等。
优选的，通式中：X为NH，R1为CH2CH2CH3，R2为H，R3为CONHNH2或H，R4为
NO2、CONHNH2或H。
所述的可用于活细胞内丙二醛成像的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：以氨基取代
的苯甲酸甲酯衍生物为起始原料，通过Buchwald-Hartwig反应与溴代的1,8-萘二甲酰亚胺偶
联生成酯类中间物，再与水合肼缩合得到荧光探针。
所述的可用于活细胞内丙二醛成像的荧光探针在检测丙二醛中的应用：所述的荧光探针
在生理环境下能有效检测到丙二醛，并在活细胞内成功实现了内源性及外源性丙二醛的生物
成像。
本发明以苯甲酰肼(含取代的苯甲酰肼)为探针与丙二醛的作用部分，以1,8-萘二甲酰
亚胺为荧光报道基团，通过一定的连接基团(如亚氨基)将这两个部位连接得到可用于活细
胞内丙二醛成像的荧光探针。
本发明对于现有技术具有如下优点和效果：
1、本发明首次实现了活细胞内的丙二醛生物成像，目前尚无类似报道。
2、本发明所优选的荧光探针MDAP-1，其斯托克斯位移可达到～180nm，从而完全避免
了小的斯托克斯位移所导致染料的自吸收严重、激发光的散色干扰及由此带来的检测灵敏度
下降等缺点，有利于发挥染料的生物应用。
3、本发明的荧光探针具有在生理环境下(pH＝7.4)定量检测丙二醛的能力，定量检测区
间为2-200μM，最低检出限低至0.6μM，具有较高的灵敏度。
4、本发明的荧光探针MDAP-1荧光响应强，响应时间短，在和1mM的丙二醛作用中，
于5分钟内荧光增强60倍，10分钟内增强110倍，30分钟内达到150倍，这种大的荧光增
强及荧光快速响应，对于反应活性高且在细胞内快速降解的丙二醛的检测而言，是十分有利
的。
5、本发明的荧光探针MDAP-1显示了优良的选择性。MDAP-1对各种金属离子、各种
氧化活性产物及多种活性羰基化合物都几乎无荧光响应。
6、本发明的荧光探针可用于内源性及外源性丙二醛在活细胞内的成像。在双氧水所诱导
的细胞氧化应激过程中，MDAP-1的荧光伴随着双氧水浓度的增高也发生不同程度的增强，
揭示了细胞内丙二醛的含量伴随着氧化应激过程的加强而升高的生物过程。并且，在加入等
量的抗氧化剂---抗坏血酸及双氧水后，荧光没有变化，这也从侧面证实了抗坏血酸的抗氧化
能力，说明了抗坏血酸的药物功能。在外源性丙二醛的细胞成像方面，MDAP-1的荧光伴随
着外加的丙二醛浓度的增大而呈现出逐渐增强的现象。
附图说明
图1是探针MDAP-1、MDAP-2、MDAP-3(10μM)与MDA(1mM)的荧光倍增对比
图。
图2是MDAP-1(10μM)与MDA的荧光滴定曲线图，MDA浓度由下至上依次为0、2、
5、10、20、50、100、200、400、600、800、1000μM。
图3是MDAP-1与MDA浓度的荧光响应关系图，内插图显示在MDA浓度区间为0-200
μM时，荧光强度与MDA浓度呈线性关系。
图4是MDAP-1(10μM)与MDA(1mM)作用的荧光强度-时间关系图。
图5是金属离子、ROS及RCS对MDAP-1的荧光响应图，图中，1：MDAP-1，2：Mg2+，
3：Cd2+，4：Ca2+，5：Mn2+，6：Zn2+，7：Hg2+，8：Fe2+，9：Cu2+，10：H2O2，11：ClO-；
12：O2-，13：1O2，14：·OH，15：丙酮，16：乙醛，17：戊二醛，18：乙酰丙酮，19：甲醛，
20：乙二醛，21：丙酮醛，22：丙二醛；黑色柱状和带斜线的柱状代表检测物浓度分别为0.1
及1mM的荧光强度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但不应理解为对本发明的限制，在不背
离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明
的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
可用于活细胞内丙二醛成像的荧光探针MDAP-1、MDAP-2、MDAP-3的合成路线如下
反应式所示：
①采用Buchwald-Harwig氨基偶联法合成中间物(3a、3b、3c)
A.化合物3a的合成
称量300毫克6-溴-2-丙基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮(化合物1，2.0mmol)(化
合物1的合成见J.Org.Chem.2013,78,3980-3988)加入到50毫升两口烧瓶中，再依次加
入370毫克5-氨基-2-硝基苯甲酸甲酯(化合物2a，1.89mmol)(化合物2a的合成见
Tetrahedron.Lett.2005,46,7477-7481)、42毫克Pd2(dba)3(0.046mmol)及66毫克(±)-2,2'-
双-(二苯膦基)-1,1'-联萘(BINAP)，搅拌混合后脱气，用注射器加入18毫升新鲜蒸馏的甲
苯，加热至沸，在回流条件下反应过夜，冷却至室温。减压除去溶剂后上色谱柱，淋洗剂
为乙酸乙酯/石油醚(4:1，v/v)，得橙色粉末目标产物。收率：53.2％。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ10.03(s,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.54(d,J＝8.0Hz,
1H),8.43(d,J＝8.0Hz,1H),8.14(d,J＝12.0Hz,1H),7.86(t,J1＝J2＝8.0Hz,1H),7.77(d,J＝
8.0Hz,1H),7.48(m,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),4.01(t,J1＝J2＝8.0Hz,2H),3.85(s,3H),1.65
(m,2H),0.93(t,J1＝J2＝8.0Hz,3H).13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ166.57,163.85,163.21,
148.98,143.41,138.47,132.62,131.71,131.13,129.61,129.46,127.50,126.91,124.97,122.79,
118.30,116.73,116.07,103.92,53.55,41.45,21.26,11.75.HRMS–ESI(m/z):[M+H+]calcd.for
C23H20N3O6,434.1352；found,434.1388.
B.化合物3b的合成
化合物3b的合成方法类同化合物3a，将370毫克5-氨基-2-硝基苯甲酸甲酯(化合物2a，
1.89mmol)换成285毫克4-氨基苯甲酸甲酯(化合物2b，1.89mmol)，其余步骤同化合物
3a的合成。收率：45.6％。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ9.64(s,1H),8.73(d,J＝8.0Hz,1H),8.51(d,J＝8.0Hz,
1H),8.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,2H),7.83(t,J1＝J2＝8.0Hz,1H),7.60(d,J＝
8.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,2H).3.99(t,J1＝J2＝8.0Hz,2H).3.84(s,3H),1.65(m,2H),0.92
(t,J1＝J2＝8.0Hz,3H).13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ165.77,163.50,162.76,146.15,145.16,
132.66,131.08,130.83,129.16,129.15,125.66,123.09,122.73,122.11,118.80,113.69,111.63,
51.82,40.93,20.87,11.36.HRMS–ESI(m/z):[M+H+]calcd.for C23H21N2O4,389.1501；found,
389.1490.
C.化合物3c的合成
化合物3c的合成方法类同化合物3a，将370毫克5-氨基-2-硝基苯甲酸甲酯(化合物2a，
1.89mmol)换成285毫克3-氨基苯甲酸甲酯(化合物2c，1.89mmol)，其余步骤同化合物
3a的合成。收率：63.5％。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ9.54(s,1H),8.80(d,J＝8.0Hz,1H),8.52(d,J＝8.0Hz,
1H),8.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.96(s,2H),7.83(t,J1＝J2＝8.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.0Hz,1H),
7.69(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(t,J1＝J2＝8.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),4.00(t,J1＝J2＝8.0
Hz,2H).3.87(s,3H),1.64(m,2H),0.92(t,J1＝J2＝8.0Hz,3H).13CNMR(DMSO-d6,101MHz)
δ165.91,163.54,162.73,146.79,141.19,133.09,131.00,130.86,129.90,129.30,128.88,125.98,
125.30,123.99,122.10,122.01,122.00,112.06,108.46,52.25,40.85,20.88,11.35.HRMS–ESI
(m/z):[M+H+]calcd.for C23H21N2O4,389.1501；found,389.1490.
②荧光探针MDAP-1、MDAP-2、MDAP-3的合成
A.MDAP-1的合成
将110毫克化合物3a(0.26mmol)溶于8毫升甲醇，加入0.4毫升水合肼(8.25mmol)，
加热搅拌回流过夜，冷却后减压蒸去溶剂，油状粗品经色谱柱(淋洗剂为乙酸乙酯/甲醇，10:1)
分离得到橙色目标产物MDAP-1。收率：55.0％。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ10.03(s,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.54(d,J＝8.0Hz,
1H),8.43(d,J＝8.0Hz,1H),8.14(d,J＝12.0Hz,1H),7.86(t,J1＝J2＝8.0Hz,1H),7.77(d,J＝
8.0Hz,1H),7.48(m,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),4.01(t,J1＝J2＝8.0Hz,2H).3.85(s,3H),1.65
(m,2H),0.93(t,J1＝J2＝8.0Hz,3H).13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ166.57,163.85,163.21,
148.98,143.41,138.47,132.62,131.71,131.13,129.61,129.46,127.50,126.91,124.97,122.79,
118.30,116.73,116.07,103.92,53.55,41.45,21.26,11.75.HRMS–ESI(m/z):[M+H+]calcd.for
C23H20N3O6,434.1352；found,434.1388.
B.MDAP-2的合成
MDAP-2的合成方法类同MDAP-1，将110毫克化合物3a(0.26mmol)换成100毫克
化合物3b(0.26mmol)，其余步骤同MDAP-1的合成，得到深黄色目标产物MDAP-2。收率：
37.4％。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ9.73(s,1H),9.55(s,1H),8.78(d,J＝12Hz,1H),8.51(d,J
＝12Hz,1H),8.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,2H),7.82(t,J1＝J2＝8.0Hz,1H),7.48
(d,J＝8.0Hz,1H),7.43(d,J＝8.0Hz),4.52(brs,2H),3.99(t,J1＝J2＝8Hz,2H),1.64(m,2H),
0.92(t,J1＝J2＝8.0Hz,3H).13CNMR(DMSO-d6,101MHz)δ165.43,163.54,162.76,146.21,
143.64,132.98,131.03,129.28,129.15,128.40,127.47,125.37,122.41,122.02,119.99,112.49,
109.81,40.88,20.88,11.36.HRMS–ESI(m/z):[M+H+]calcd.for C22H21N4O3,389.1614；found,
389.1603.
C.MDAP-3的合成方法类同MDAP-1，将110毫克化合物3a(0.26mmol)换成100毫
克化合物3c(0.26mml)，其余步骤同MDAP-1的合成，得到橙色目标产物MDAP-3。收率：
42.8％。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ9.86(s,1H),9.46(s,1H),8.78(d,J＝8.0Hz,1H),8.46(d,J
＝8.0Hz,1H),8.25(d,J＝8.0Hz,1H),7.86(s,1H),7.77(t,J1＝J2＝8.0Hz,1H),7.61(m,1H),
7.52(m,2H),7.30(d,J＝8.0Hz,1H),4.57(brs,2H),3.96(t,J1＝J2＝8.0Hz,2H),1.62(m,2H),
0.91(t,J1＝J2＝8.0Hz,3H).13C NMR(DMSO-d6,101MHz)δ165.58,163.59,162.78,147.16,
140.68,134.55,133.23,129.56,129.26,128.85,125.20,124.61,122.10,121.88,121.71,120.66,
111.50,108.23,40.85,20.87,11.33.HRMS–ESI(m/z):[M+H+]calcd.for C22H21N4O3,389.1614；
found,389.1604.
实施例2 荧光探针MDAP-1、MDAP-2、MDAP-3与丙二醛(MDA)的荧光响应
用DMSO配制荧光探针MDAP-1、MDAP-2及MDAP-3的储备液(100mM)，取少量加
入EP管中，用PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)稀释，加入一定量的MDA溶液，再用DMSO及
PBS稀释至探针终浓度为10μM、MDA的终浓度为1mM(此时溶剂构成：DMSO:PBS＝1:9，
体积比，pH 7.4)。将EP管在37℃下温育四小时后测量其荧光响应情况。取最大激发波长为
370nm，三个化合物的发射波长都在550-553nm左右，斯托克斯位移都在180nm左右，这个
斯托克斯位移相对于普通的荧光探针而言是相当大的，能有效避开激发光对发射的干扰，对
于细胞成像是十分有利的；三个探针的荧光强度相对于与MDA反应前，分别增强了174、50
及140倍(见图1)。由于MDAP-1的荧光响应最为理想，因此选择该探针做进一步的研究。
实施例3 荧光探针MDAP-1与丙二醛(MDA)的量的相互关系
取MDAP-1的DMSO储备液少量于EP管中，用PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)稀释，加入
一定量的MDA溶液，再用PBS及DMSO稀释至探针终浓度为10μM，MDA的终浓度分别为0、
2、5、10、20、50、100、200、400、600、800、1000μM。在37℃温育4小时，检测溶液的
荧光强度(激发波长：370nm；发射波长：553nm。MDAP-1-MDA滴定的荧光图见图2；其
荧光强度与MDA的关系图见图3。溶剂构成：DMSO:PBS＝1:9，体积比，pH 7.4)。结果显
示，MDAP-1的荧光强度随浓度的增大而增高，且在0-200μM的浓度范围内，荧光强度与MDA
的浓度呈现出线性关系，最低检测限经计算为0.6μM。
实施例4 荧光探针MDAP-1与丙二醛(MDA)的荧光-时间相互关系
取MDAP-1的DMSO储备液少量于EP管中，用PBS缓冲液(10mM，pH7.4)稀释，
加入一定量的MDA溶液，再用PBS及DMSO稀释至探针终浓度为10μM、MDA的终浓度
为1mM。在37℃温育，取不同时间点的溶液检测其荧光响应情况(激发波长：370nm；发
射波长：553nm。溶剂构成：DMSO:PBS＝1:9，体积比，pH 7.4)。MDAP-1对MDA的荧光
响应很快，在5分钟时荧光增强60倍、10分钟时荧光增强110倍、30分钟达到约150倍(见
图4)。由于MDA在细胞内活性高、易于降解，MDAP-1对MDA良好的响应速度对于MDA
在细胞内的成像是有利的。
实施例5 荧光探针MDAP-1对MDA的荧光响应的选择性
本实施例的考察对象分为三个层面。
首先考察的MDAP-1对离子的荧光响应情况，将Mg2+、Cd2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Hg2+、
Fe2+和Cu2+分别加入MADP-1溶液中(离子终浓度分别为0.1及1mM；MDAP-1终浓度为
10μM；溶剂构成：DMSO:PBS＝1:9，体积比，pH 7.4)，在370nm激发下检测553nm的荧
光发射情况，结果见图5，和未加离子的探针MDAP-1相比较，加离子后探针MDAP-1荧光
无明显变化。
由于MDA是氧化应激的产物，而氧化应激也会产生活性氧簇(Reactive Oxidative Stress,
ROS)，因此考察了ROS对探针的干扰情况，将H2O2、ClO-、O2-、1O2及·OH分别加入到MDAP-1
溶液中(ROS终浓度分别为0.1及1mM；MDAP-1终浓度为10μM；溶剂构成：DMSO:PBS
＝1:9，体积比，pH 7.4)，在370nm激发下检测553nm的荧光发射情况，结果见图5，同样
加入ROS后探针MDAP-1荧光无显著改变。
最后考察了与MDA结构较为接近的活性羰基化合物(Reactive carbonyl species,RCS)，
将1mM的丙酮、乙醛、戊二醛、乙酰丙酮、甲醛、乙二醛及丙酮醛加入到MDAP-1溶液中
(RCS终浓度分别为0.1及1mM；MDAP-1终浓度为10μM；溶剂构成：DMSO:PBS＝1:9，
体积比，pH 7.4)，在370nm激发下检测553nm的荧光发射情况，结果见图5，同样加入RCS
后探针MDAP-1荧光无显著改变。以上结果表明MDAP-1的对MDA的优良选择性。
实施例6 荧光探针MDAP-1的细胞毒性
将不同浓度的MDAP-1(0、1、5、10μM)加入到已孵育好的Hela细胞内，继续孵育
24小时，应用MTT法检测细胞的增殖情况。测试结果表明，MDAP-1在0-10μM的浓度下
未显示出明显的细胞毒性。
实施例7 细胞内外源性及内源性MDA的成像
①外源性MDA的细胞成像
在孵育好的Hela细胞培养基内加入5μM的MDAP-1，温育30分钟后分别加入不同浓
度的丙二醛(0、0.1、0.2、0.5mM)继续温育30分钟，加入PBS缓冲液(pH 7.4)震荡洗
涤3次(每次5分钟)，再加入细胞培养基，在激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞形态。使用
激发光源为400nm。收集500-650nm的成像图片。结果显示，MDAP-1可使Hela细胞带有
微弱的荧光，在0.1mM的MDA作用下，荧光强度增强约0.2倍；在0.2mM的MDA作用下，
荧光强度增强约1.0倍；而在0.5mM的MDA作用下，荧光强度增强约2.7倍。上述结果表
明MDAP-1可用于外源性MDA的细胞成像。
②内源性MDA的细胞成像
由于MDA是细胞氧化应激的产物，因此内源性MDA的产生可通过双氧水诱导细胞的
氧化应激来实现。在本实验中，HeLa细胞先与5μM的MDAP-1孵育30分钟，使用激发光
源为400nm，在0时刻分别加入0.1及0.5mM的双氧水，每隔30秒钟收集500-650nm的荧
光强度。在30秒时刻荧光强度即已达到平台，以后的时间内(总检测时间为6分钟)荧光强
度无显著改变。在0.1mM的双氧水作用下，荧光强度和未加入双氧水的相比较增长了2％，
而0.5mM的双氧水则增长了20％。
为了证明MDA的发生的确是由于氧化应激产生的，一种抗氧剂---抗坏血酸(0.5mM)
和双氧水(0.5mM)被同时加入到5μM的MDAP-1作用过的HeLa细胞中，操作过程同上，
在整个观测时间内未见到荧光的变化。上述结果说明MDAP-1可用于由双氧水诱发的内源性
MDA的细胞成像。