《苯丁抑制素乙二醇壳聚糖及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苯丁抑制素乙二醇壳聚糖及其制备方法.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104013969 A (43)申请公布日 2014.09.03 C N 1 0 4 0 1 3 9 6 9 A (21)申请号 201410260315.X (22)申请日 2014.06.11 A61K 47/36(2006.01) C08B 37/08(2006.01) A61K 38/06(2006.01) A61K 38/07(2006.01) A61K 38/08(2006.01) (71)申请人吉林大学 地址 130012 吉林省长春市前进大街2699 号 (72)发明人张勇 陈妍 孔维 (74)专利代理机构长春吉大专利代理有限责任 公司 22201 代。
2、理人王恩远 (54) 发明名称 苯丁抑制素乙二醇壳聚糖及其制备方法 (57) 摘要 本发明属于药用辅料的技术领域，公开了一 种具有氨基肽酶抑制活性的乙二醇壳聚糖及其制 备方法，是将苯丁抑制素与乙二醇壳聚糖在催化 条件下发生反应生成苯丁抑制素乙二醇壳聚糖。 苯丁抑制素乙二醇壳聚糖结构式中RCH 3 CO-或 H，320n20；m/(m+n)0.20.8。该化合物 的物化指标：浅黄色至白色粉末状固体，溶于水， 分子量为80250KD。在乙二醇壳聚糖分子糖链 上引入苯丁抑制素后，该化合物对氨基肽酶具有 明显的抑制活性。苯丁抑制素乙二醇壳聚糖可以 抑制氨基肽酶对小肽蛋白的降解，可用作制药过 程中的多功。
3、能辅料组分。 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书6页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104013969 A CN 104013969 A 1/2页 2 1.一种苯丁抑制素乙二醇壳聚糖，结构为： 其中，RCH 3 CO-或H；320n20；m/m+n0.20.8。 2.根据权利要求1所述的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖，其特征在于，所述的苯丁抑制素 乙二醇壳聚糖，为浅黄色至白色粉末状固体，分子量为80250KD。 3.一种权利要求1的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖的制备方法，其步骤如下： 1)将乙。
4、二醇壳聚糖溶于水中，加入苯丁抑制素，乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素的质量比 为112.51，pH调至5.06.8，得到步骤1)溶液； 2)在步骤1)溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基 琥珀酰亚胺，或加入它们的pH值与步骤1)溶液相同的水溶液；加水至1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐最终浓度为0.10.4M，N-羟基琥珀酰亚胺的最终浓度为 0.0050.02M，得到步骤2)溶液；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐用量按 质量计是乙二醇壳聚糖的1.97.7倍； 3)将步骤2)溶液避光，室温搅拌反应324小时，得到步骤3)溶液； 4)将步骤3。
5、)溶液转移到截留分子量为800014000道尔顿的透析袋中，以0.05M盐 酸为透析液透析，而后以去离子水为透析液透析，得到步骤4)溶液； 5)将透析袋中的步骤4)溶液冷冻干燥，得到苯丁抑制素乙二醇壳聚糖。 4.根据权利要求3所述的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述的 透析，条件为：避光搅拌，4，盐酸和去离子水各透析3648小时，每4小时更换一次透析 液。 5.根据权利要求3或4所述的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述 的冷冻干燥，是将透析袋中的步骤4)溶液转移至烧杯或分装到西林瓶中，-80预冻12小 时，再-60条件下真空冷冻干燥1236小时。 6.一种权利要。
6、求1的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖的用途，苯丁抑制素乙二醇壳聚糖用作 权 利 要 求 书CN 104013969 A 2/2页 3 对氨基肽酶具有抑制活性的药用辅料。 权 利 要 求 书CN 104013969 A 1/6页 4 苯丁抑制素乙二醇壳聚糖及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种苯丁抑制素接枝的乙二醇壳聚糖衍生物，属于药用辅料的技术领 域。 背景技术 0002 近年来，越来越多的具有生物活性的蛋白多肽类药物被发现，因其在生理功能上 的高效性及专一性而广泛用于治疗各种疾病。但由于其在体内易被降解，且生物半衰期短， 使其应用受到了限制，所以，开发蛋白多肽类药物给药系统是一个研究热点。。
7、目前，该研究 主要集中在两方面：一是对肽类药物本身进行改良、修饰、包埋等，以改变其理化性质；二 是改变药物吸收环境，如使用酶抑制剂、吸收促进剂等。 0003 乙二醇壳聚糖是由壳聚糖6位羟基被乙二醇取代所得的水溶性阳离子碱性多糖。 乙二醇壳聚糖具有诸多优点，如优良的生物降解性、生物相容性和促进药物吸收的功能，而 且由于乙二醇基和氨基的存在，该材料可以溶于酸性、中性和碱性水溶液中，在食品工业和 制药行业等领域广泛应用。氨基肽酶广泛存在于肠壁吸收细胞表面，是蛋白肽类药物肠道 内降解的主要来源之一，而乙二醇壳聚糖本身并不具备氨基肽酶酶抑制功能。苯丁抑制素 作为氨基肽酶抑制剂机理明确，活性高。然而苯丁抑。
8、制素难溶于水，在生理环境pH条件下 (如肠道)容易发生沉淀，因此难以充分发挥其作用。 0004 本发明通过化学修饰制备出苯丁抑制素乙二醇壳聚糖，以胸腺五肽、胸腺四肽和 胸腺三肽等药物为氨基肽酶底物模型，对苯丁抑制素乙二醇壳聚糖进行了酶抑制活性研 究，绘制了模型药物的浓度时间曲线，效果良好，均未见报道。 发明内容 0005 本发明的目的是研究开发一种具有氨基肽酶抑制活性的乙二醇壳聚糖衍生物，可 用作制药过程中的多功能辅料组分。 0006 本发明的另外一个目的是提供上述乙二醇壳聚糖衍生物-苯丁抑制素乙二醇 壳聚糖的制备方法。 0007 本发明的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖的结构为： 0008 说 明 书。
9、CN 104013969 A 2/6页 5 0009 其中，RCH 3 CO-或H；320n20；m/(m+n)0.20.8。 0010 在乙二醇壳聚糖分子上引入苯丁抑制素后，该化合物对氨基肽酶具有明显的抑制 活性。该化合物的物化指标：浅黄色至白色粉末状固体，溶于酸性、中性和碱性水溶液，分子 量为80250KD。 0011 一种苯丁抑制素乙二醇壳聚糖化合物的制备方法，其步骤如下： 0012 1)将乙二醇壳聚糖溶于水中，加入苯丁抑制素，乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素的质 量比为112.51，pH调至5.06.8，得到步骤1)溶液； 0013 2)在步骤1)溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳。
10、二亚胺盐酸盐和N-羟 基琥珀酰亚胺，或加入它们的pH值与步骤1)溶液相同的水溶液；加水至1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐最终浓度为0.10.4M，N-羟基琥珀酰亚胺的最终浓度为 0.0050.02M，得到步骤2)溶液；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐用量按 质量计是乙二醇壳聚糖的1.97.7倍； 0014 3)将步骤2)溶液避光，室温搅拌反应324小时，得到步骤3)溶液； 0015 4)将步骤3)溶液转移到截留分子量为800014000道尔顿的透析袋中，以0.05M 盐酸为透析液透析，而后以去离子水为透析液透析，得到步骤4)溶液； 0016 5)将透析袋中的步。
11、骤4)溶液冷冻干燥，得到苯丁抑制素乙二醇壳聚糖。 0017 所述的透析，条件为：避光搅拌，4，盐酸和去离子水各透析3648小时，每4小 时更换一次透析液。 0018 所述的冷冻干燥，可以将透析袋中的步骤4)溶液转移至干净烧杯或分装到干净 西林瓶中，-80预冻12小时，再-60条件下真空冷冻干燥1236小时。 0019 在上述的各步骤中，只要在所给的工艺条件范围内，比如：溶液的pH值范围、溶 液的摩尔浓度范围、室温搅拌反应的时间范围、透析袋的截留分子量范围等，均可实施本发 明，并且所得产物均对氨基肽酶具有良好的抑制活性。 说 明 书CN 104013969 A 3/6页 6 0020 本发明还请。
12、求保护苯丁抑制素乙二醇壳聚糖作为对氨基肽酶具有抑制活性的药 用辅料在制药行业中应用。 0021 本发明将苯丁抑制素接枝到乙二醇壳聚糖分子链上，得到苯丁抑制素乙二醇壳聚 糖。这一设计一方面可以给予生物材料乙二醇壳聚糖酶抑制功能，另一方面可以显著改善 苯丁抑制素的水溶性，并利用乙二醇壳聚糖的生物粘附作用帮助苯丁抑制素在局部微环境 (如肠吸收细胞表面)发挥酶抑制作用，从而在苯丁抑制素用量较低的情况下就可以保护 蛋白肽类药物免受降解。 0022 本发明将苯丁抑制素引入到乙二醇壳聚糖分子上制备出的新型乙二醇壳聚糖衍 生物(苯丁抑制素乙二醇壳聚糖)对氨基肽酶具有良好的抑制活性，可用作制药过程中的 功能性辅。
13、料。 附图说明 0023 图1为本发明的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖的结构式图。 0024 图2为现有的乙二醇壳聚糖的红外光谱图。 0025 图3为本发明制备的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖的红外光谱图。 0026 图4为乙二醇壳聚糖和本发明的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖的紫外吸收光谱图。 0027 图5为乙二醇壳聚糖和本发明的苯丁抑制素乙二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺 五肽的抑制作用图。 0028 图6为乙二醇壳聚糖和本发明苯丁抑制素乙二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺四 肽的抑制作用图。 0029 图7为乙二醇壳聚糖和本发明苯丁抑制素乙二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺三 肽的抑制作用图。 具体实施方式 0030 实施例1。
14、： 0031 称取1g乙二醇壳聚糖加入烧杯中，加入90ml去离子水，用5M盐酸调节pH值为 6.0，加入苯丁抑制素0.08g，混合均匀，加入适量去离子水使总液体体积达到100ml。称取 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1.917g，称取N-羟基琥珀酰亚胺0.058g， 一同加入到前述溶液中，避光室温搅拌12小时。反应结束后，反应液转移至截留分子量为 10000道尔顿的透析袋中进行透析，4条件下，以0.05M HCl为透析介质在5L透析液中透 析，每4小时换透析液一次，持续透析48小时，以去离子水为透析介质在5L透析液中透析， 每4小时换透析液一次，持续透析48小时。转移透析液到。
15、烧杯中，-80预冻12小时，-60 冷冻干燥24小时,得到合成产物苯丁抑制素乙二醇壳聚糖。所得合成产物在-20条件下 密封避光干燥保存。 0032 实施例2： 0033 称取1g乙二醇壳聚糖加入烧杯中，加入45ml去离子水，用5M盐酸调节pH值为 6.0，加入苯丁抑制素0.3g，混合均匀。分别称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐1.917g和N-羟基琥珀酰亚胺0.058g加入烧杯中，加入45ml去离子水，用5M盐酸调 节pH值为6.0，而后合并该溶液到前述含有乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素的溶液中，加入适 说 明 书CN 104013969 A 4/6页 7 量去离子水使总液体体积。
16、达到100ml，使避光室温搅拌12小时。反应结束后，反应液转移至 截留分子量为10000道尔顿的透析袋中进行透析，4条件下，以0.05M HCl为透析介质在 5L透析液中透析，每4小时换透析液一次，持续透析48小时，以去离子水为透析介质在5L 透析液中透析，每4小时换透析液一次，持续透析48小时。转移透析液到烧杯中，-80预 冻12小时，-60冷冻干燥24小时,得到合成产物苯丁抑制素乙二醇壳聚糖。所得合成产 物在-20条件下密封避光干燥保存。 0034 分析图2和图3两幅红外光谱可见，乙二醇壳聚糖红外图谱中1664cm-1处为酰胺 键羰CO基伸缩振动峰，1600cm-1处为氨基N-H变形振动峰。
17、，2871cm-1处为C-H伸缩振 动峰，3374cm-1处为乙二醇壳聚糖分子中O-H伸缩振动峰和N-H伸缩振动峰，1062cm-1处 为C-OH产生的振动峰；产物中1066cm-1处为C-OH振动峰，1633cm-1处为酰胺键羰CO 基伸缩振动峰和苯环骨架振动峰的叠加，峰强相对于1066cm-1处的C-OH振动峰明显增强， 1525cm-1处为苯环骨架振动峰，可推知苯丁抑制素主要在乙二醇壳聚糖的氨基上发生酰化 反应。 0035 图4为以去离子水为溶剂，将乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖制成浓度 为1mg/ml的溶液，测得的紫外吸收光谱图。其中，1为乙二醇壳聚糖的紫外吸收光谱图，2 为苯丁。
18、抑制素乙二醇壳聚糖的紫外吸收光谱图。从图4中可以看出，将苯丁抑制素连接到 乙二醇壳聚糖分子上，由于苯环生色团的影响，乙二醇壳聚糖衍生物在240280nm之间出 现了特征性的五个吸收峰，其中最大峰强位于254nm处。 0036 实施例3： 0037 称取1g乙二醇壳聚糖加入烧杯中，加入45ml去离子水，用5M盐酸调节pH值为 6.0，加入苯丁抑制素1g，混合均匀。分别称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐7.668g和N-羟基琥珀酰亚胺0.232g加入烧杯中，加入45ml去离子水，用5M盐酸调 节pH值为6.0，而后合并该溶液到前述含有乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素的溶液中，加入适 量。
19、去离子水使总液体体积达到100ml，使避光室温搅拌12小时。反应结束后，反应液转移至 截留分子量为10000道尔顿的透析袋中进行透析，4条件下，以0.05M HCl为透析介质在 5L透析液中透析，每4小时换透析液一次，持续透析48小时，以去离子水为透析介质在5L 透析液中透析，每4小时换透析液一次，持续透析48小时。转移透析液到烧杯中，-80预 冻12小时，-60冷冻干燥24小时既得合成产物苯丁抑制素乙二醇壳聚糖。所得合成产物 在-20条件下密封避光干燥保存。 0038 实施例4本发明实施例2所得产物对氨基肽酶降解胸腺五肽的抑制影响。 0039 清除率的测定和计算：以克-林二氏磷酸盐缓冲液为溶。
20、剂，配置不同质量分数的 乙二醇壳聚糖溶液和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖溶液。加入胸腺小肽(本实施例为胸腺五 肽)，使胸腺小肽的浓度为0.1mM，混合均匀，然后加入氨基肽酶(EC3.4.11.2)，使氨基肽酶 浓度为0.01U/ml。样品混合均匀，置于37恒温水浴中，分别在加入氨基肽酶后的2，6，12， 20，30，40，50，60min取样并终止反应，高效液相色谱法测定胸腺小肽的残留浓度。绘制胸腺 小肽残留浓度时间曲线，计算各个时间点所对应的曲线下面积和胸腺小肽总降解量，计算 清除率： 0040 MCL 清除 *AUC 0041 其中M为胸腺小肽降解量，AUC为各时间点药物浓度时间曲线下面积，CL 。
21、清除 即 说 明 书CN 104013969 A 5/6页 8 为清除率。 0042 结果见表1。 0043 表1 0044 0045 作为比较，表1也给出乙二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺五肽的抑制影响。 0046 实施例5：本发明实施例2所得产物对氨基肽酶降解胸腺四肽的抑制影响。 0047 清除率的测定和计算：在本实施例中胸腺小肽为胸腺四肽，其余同实施例4。 0048 结果见表2。 0049 表2 0050 0051 作为比较，表2也给出乙二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺四肽的抑制影响。 0052 实施例6：本发明实施例2所得产物对氨基肽酶降解胸腺三肽的抑制影响。 0053 清除率的测定和计算：在。
22、本实施例中胸腺小肽为胸腺三肽，其余同实施例4。 0054 结果见表3。 0055 表3 0056 0057 作为比较，表3也给出乙二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺三肽的抑制影响。 0058 实施例7本发明实施例2所得产物的氨基肽酶抑制实验 0059 氨基肽酶抑制实验方法：以克-林二氏磷酸盐缓冲液为溶剂，配置不同质量分数 的乙二醇壳聚糖溶液和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖溶液。加入胸腺小肽(本实施例中分别为 胸腺五肽、胸腺四肽和胸腺三肽)，使胸腺小肽的浓度为0.1mM，混合均匀，然后加入氨基肽 酶(EC3.4.11.2)，使氨基肽酶浓度为0.01U/ml。样品混合均匀，置于37恒温水浴中，分 别在加入氨基肽。
23、酶后的2，6，12，20，30，40，50，60min取样并终止反应，高效液相色谱法测 定胸腺小肽的残留浓度。胸腺五肽组，乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖浓度均为 2mg/ml；胸腺四肽组，乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖浓度均为1mg/ml；胸腺三 肽组，乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖浓度均为1mg/ml。所有对照组不含乙二醇 壳聚糖和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖。以胸腺小肽0min时的浓度为100，计算胸腺小肽在 各个时间点的残留百分比例。绘制的胸腺五肽，胸腺四肽和胸腺三肽的残留浓度时间曲线 说 明 书CN 104013969 A 6/6页 9 如图5，图6和图7。 0060 图5。
24、为乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺五肽的抑 制作用曲线。从图5中可知，乙二醇壳聚糖本身并没有抑制氨基肽酶降解胸腺五肽的作用， 各个时间点和胸腺五肽对照组没有显著性差异。而苯丁抑制素乙二醇壳聚糖在所有时间点 均显著高于对照组，并且30min时的残留浓度约为起始时的43，因此表明苯丁抑制素乙 二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺五肽具有显著地抑制作用。 0061 图6为乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺四肽的抑 制作用曲线。从图中可知，乙二醇壳聚糖本身并没有抑制氨基肽酶降解胸腺四肽的作用，反 而呈现出一定的促进作用。而苯丁抑制素乙二醇壳聚糖在所有时间点均显著高于对。
25、照组， 并且20min时的残留浓度约为起始时的24，因此表明苯丁抑制素乙二醇壳聚糖对氨基肽 酶降解胸腺四肽具有显著地抑制作用。 0062 图7为乙二醇壳聚糖和苯丁抑制素乙二醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺三肽的抑 制作用曲线。从图中可知，乙二醇壳聚糖本身并没有抑制氨基肽酶降解胸腺三肽的作用，各 个时间点和胸腺三肽对照组没有显著性差异。而苯丁抑制素乙二醇壳聚糖在所有时间点均 显著高于对照组，并且40min时的残留浓度约为起始时的38，因此表明苯丁抑制素乙二 醇壳聚糖对氨基肽酶降解胸腺三肽具有显著地抑制作用。 0063 综合上述的本发明产物对氨基肽酶降解胸腺小肽的抑制影响和氨基肽酶抑制实 验，可以说明：苯丁抑制素乙二醇壳聚糖作为对氨基肽酶具有抑制活性的药用辅料在制药 行业中应用。 0064 本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行 修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。 说 明 书CN 104013969 A 1/4页 10 图1 图2 说 明 书 附 图CN 104013969 A 10 2/4页 11 图3 图4 说 明 书 附 图CN 104013969 A 11 3/4页 12 图5 图6 说 明 书 附 图CN 104013969 A 12 4/4页 13 图7 说 明 书 附 图CN 104013969 A 13 。