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1、(10)申请公布号 CN 104120100 A (43)申请公布日 2014.10.29 C N 1 0 4 1 2 0 1 0 0 A (21)申请号 201410331131.8 (22)申请日 2014.07.11 CGMCC No.8576 2013.12.13 C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) B09C 1/10(2006.01) C12R 1/11(2006.01) (71)申请人湖南省农业科学院 地址 410125 湖南省长沙市芙蓉区马坡岭远 大二路892号 申请人湖南农业大学 (72)发明人柏连阳 刘敏 罗坤 曾爱平 周小毛 罗峰 刘。
2、祥英 胡利锋 刘开林 (74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人王文君 (54) 发明名称 一株内生巨大芽孢杆菌及其在修复二氯喹啉 酸药害中的应用 (57) 摘要 本发明涉及一株巨大芽孢杆菌及其在修复烟 草二氯喹啉酸药害中的应用。所述巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)Q3保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保 藏编号为：CGMCC No.8576。本发明的巨大芽孢杆 菌Q3能够有效降解低二氯喹啉酸的浓度，可应用 于受二氯喹啉酸污染的水体及土壤，以及用于缓 解烟草生产上的二氯喹啉酸药害。 (83)生物保藏信息 (51。
3、)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104120100 A CN 104120100 A 1/1页 2 1.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium.)Q3，保藏编号为：CGMCC No.8576。 2.含有权利要求1所述巨大芽孢杆菌Q3的菌剂。 3.一种制备权利要求2所述菌剂的方法，其特征在于，在LB培养基中发酵巨大芽孢杆 菌Q3，将得到的发酵液制备成液体制剂或固体制剂。 4.根据权利要求3所述的方法，所述发酵条件。
4、为：发酵温度为30，转速为180r/min， 发酵时间为3天。 5.权利要求1所述巨大芽孢杆菌Q3在降解二氯喹啉酸中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌Q3用于降解水体或者 土壤中的二氯喹啉酸。 7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌Q3在修复烟草二氯喹 啉酸药害中的应用。 8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，将所述巨大芽孢杆菌Q3制备成菌剂， 接种于水体、土壤或基肥中。 9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述巨大芽孢杆菌Q3制备成液体制剂， 每毫升制剂含有10 9 10 12 个芽孢，每1公斤液体制剂用600-800倍清。
5、水混匀，烟草移栽后 进行灌根处理。 10.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，将所述巨大芽孢杆菌Q3制备成固体 粉剂，每克粉剂含有10 12 10 14 个芽孢，在烟草移栽前，按1.52.0公斤固体制剂/亩剂 量与基肥混匀，施至田间土壤。 权 利 要 求 书CN 104120100 A 1/6页 3 一株内生巨大芽孢杆菌及其在修复二氯喹啉酸药害中的应 用 技术领域 0001 本发明属于农药污染微生物修复领域，具体地说，涉及一株内生巨大芽孢杆菌及 其在修复二氯喹啉酸药害中的应用。 背景技术 0002 二氯喹啉酸(quinclorac)，化学名称：3，7-二氯-8-喹啉羧酸，是德国巴斯夫公司。
6、 开发的芽前、芽后新型水田除草剂，因其具有用量少、持效期长、对稗草特效等优点而被广 泛应用于农业生产，主要用于稻田防稗草。其结构式如下： 0003 0004 二氯喹啉酸呈弱酸性，在酸性土壤中降解缓慢，易给后茬敏感作物造成严重危害， 特别是在水稻与烟草轮作区，土壤中残留的二氯喹啉酸在很低浓度下(0.001mg/kg)就可 以对茄科、葫芦科、伞形科等作物生长产生危害，严重影响作物的产量和质量。 0005 土壤中二氯喹啉酸降解的主要途径有光降解和微生物降解，而光降解因为太阳光 在土壤中的穿透深度问题受到很大程度的限制。研究证明，微生物降解是环境中残留农药 降解的重要因素。目前，国内关于二氯喹啉酸微生。
7、物降解的报道较少。董俊宇等(农药学学 报，2013，15(3):316-322)于2013年从土壤中富集分离到一株二氯喹啉酸降解菌Q3，经鉴 定为产碱菌属，可以将初始浓度为100mg/L的二氯喹啉酸在7d内降解70；范俊等(中国 生物防治学报，2013，29(3)：431-436)于2013年分离到一株二氯喹啉酸高效降解菌QC06， 经鉴定为泛菌属， 该菌可以在7d内将初始浓度为50mg/L的二氯喹啉酸降解95以上。徐 淑霞等(安全与环境学报，2012，2：45-49)于2012年分离得到一株二氯喹啉酸的高效降解 菌(HN36)，该菌属于博德特氏菌属，48h内能将400mg/L的二氯喹啉酸降解。
8、96。吕镇梅等 (应用生态学报，2004，15(4)：605-609)在2004年分离得到一株二氯喹啉酸的高效降解菌 (WZ1)，经鉴定其属于洋葱假单胞菌属，11d内能将1000mg/L的二氯喹啉酸降解90。以上 分离的降解菌均是从土壤中富集分离得到，而目前国内尚无关于二氯喹啉酸内生降解菌的 报道。相对于土壤中的菌株，内生菌具有能同时在土壤及植株内部定殖生活，且较少受到外 界环境干扰的优势，且内生菌可以通过产生生长素、铁载体等来促进植物的生长。 发明内容 0006 本发明提供了一株内生二氯喹啉酸降解菌株，以期解决因二氯喹啉酸的残留引起 的烟草大面积药害，并且为生物修复污染土壤或水体提供依据。 。
9、0007 本发明所提供的从药害烟草根系分离的二氯喹啉酸降解菌，经鉴定为巨大芽孢杆 说 明 书CN 104120100 A 2/6页 4 菌(Bacillus megaterium.)，编号Q3，于2013年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.8576。 0008 本发明菌株对二氯喹啉酸具有较好的降解能力，根据菌株形态学特征、生理生 化特征(Biolog微平板)、16S rDNA序列同源性分析，将菌株Q3鉴定为巨大芽孢杆菌 (Bacillus 。
10、megaterium.)。 0009 本发明还提供一种含有所述巨大芽孢杆菌Q3的菌剂。 0010 所述菌剂的制备方法为：LB培养基接种菌种，180r/min，30发酵培养3天。根据 不同的应用方面制备成液体制剂或固体制剂。 0011 本发明同时提供了上述巨大芽孢杆菌Q3在降解二氯喹啉酸中的 应用。 0012 经试验证实，本发明所述巨大芽孢杆菌Q3对二氯喹啉酸具有较好的降解能力，能 够应用于多种环境下二氯喹啉酸的降解。 0013 具体而言，上述应用包括但不局限于对水体或土壤中二氯喹啉酸的降解，以及在 修复烟草二氯喹啉酸药害中的应用。 0014 本发明菌株可应用于受二氯喹啉酸污染的水体及土壤的修复。
11、，以及用于修复烟草 上的二氯喹啉酸药害。 0015 在上述应用中，可将所述巨大芽孢杆菌Q3制备成菌剂，接种于水体、土壤或基肥 中。所述菌剂的制备方法如上所述，具体的应用形式及方法不限，本领域技术人员可以自行 选择。 0016 为了更好地获得应用效果，本发明进一步给出了理想的应用形式与方法。如对于 巨大芽孢杆菌Q3在修复烟草二氯喹啉酸药害中的应用，可优选采用如下技术方案：将所述 巨大芽孢杆菌Q3制备成液体制剂，每毫升制剂含有10 9 10 12 个芽孢，每1公斤液体制剂 用600-800倍清水混匀，烟草移栽后进行灌根处理。 0017 对于巨大芽孢杆菌Q3降解土壤中的二氯喹啉酸，可优选采用如下技术。
12、方案：将所 述巨大芽孢杆菌Q3制备成固体粉剂，每克制剂含有10 12 10 14 个芽孢，在烟草移栽前，按 1.52.0公斤固体制剂/亩剂量与基肥混匀，施至田间土壤。 0018 本发明所述巨大芽孢杆菌Q3用于水中二氯喹啉酸降解的具体方法可参照本领域 的常规技术手段，本发明对此不作特别限定。 0019 本发明的有益效果：本发明所述的降解菌Q3为植物内生巨大芽孢杆菌，弥补了国 内外对内生巨大芽孢杆菌降解二氯喹啉酸的空白。且本发明所述的降解菌Q3不仅具有降 解二氯喹啉酸的功能，还能有效防治二氯喹啉酸对烟草造成药害，减少生产损失，提高烟草 的产量和质量。 附图说明 0020 图1菌株Q3的菌落形态； 。
13、0021 图2菌株Q3的扫描电镜照片； 0022 图3菌株Q3的系统发育树； 0023 图4菌株Q3防治烟草药害盆栽照片，其中：A为菌株Q3处理，B为对照； 0024 图5菌株Q3防治烟草药害田间照片，其中：A为菌株Q3处理11天后，B为11天的 说 明 书CN 104120100 A 3/6页 5 对照，C菌株Q3处理22天后，D为22天的对照。 具体实施方式 0025 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 0026 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常。
14、规手段。 0027 实施例1菌株的分离与鉴定 0028 本发明采用平板划线法从受二氯喹啉酸药害烟草根系分离得到一株对二氯喹啉 酸有较好降解效果的内生降解菌Q3，Q3菌落形态及扫描电镜照片如图1、图2所示。 0029 1、培养基： 0030 无机盐培养基：硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g，碳酸钙 0.5g，1000ml去离子水，pH7.0，高压蒸汽灭菌121，30min。 0031 LB培养基：牛肉膏10g，蛋白胨5g，氯化钠10g(固体培养基加琼脂15g)，1000mL去 离子水，pH7.0，高压蒸汽灭菌121，30min。 0032 2、内生降解菌分离纯化 0033。
15、 取受二氯喹啉酸药害烟草根系，用自来水冲洗干净根系土壤后，用75酒精漂洗 3-5min，无菌水冲洗3-4次，0.1HgCl 2 漂洗3-5min，无菌水冲洗3-4次。取最后一次无菌 水冲洗液0.5ml涂LB平 板，培养48h，观察是否有菌落产生，验证表面消毒是否彻底。0.5g 样品转入无菌研钵，加入10ml无菌水研磨，取50l涂含有二氯喹啉酸的无机盐平板，28 培养箱中培养，能在无机盐培养基上形成典型菌落的标记为二氯喹啉酸降解菌，共分离得 到6株降解菌。经多次转接纯化后，采用高效液相色谱分别测定降解菌对二氯喹啉酸的降 解效果，取降解效果最好的Q3菌株进行后续研究。 0034 二氯喹啉酸的提取及。
16、液相色谱检测条件：取1ml降解液至2ml离心管中，加入 0.25ml氯仿-正丁醇混合液(体积比4:1)脱蛋白，充分振荡30min后12000rpm离心5min， 取上层水相过0.22m水相滤膜后用液相色谱检测。液相色谱条件：采用Athana C 18 柱， 流动相为甲醇：0.2乙酸水溶液(体积比60:40)，柱温30，流速0.8ml/min，检测波长 240nm，进样量20L。外标法按峰面积定量测定样品中二氯喹啉酸的含量，按照公式二氯喹 啉酸降解率()(空白组二氯喹啉酸浓度-降解菌处理组二氯喹啉酸浓度)/空白组二 氯喹啉酸浓度100求出其降解率。 0035 3、菌株Q3的鉴定 0036 Q3形。
17、态特征：Q3菌落在LB培养基上呈淡黄色，圆形，表面光滑，不透明。扫描电镜 下菌体呈短杆状，单个或呈短链排列，1.21.52.04.0微米(见图2)。 0037 Biolog鉴定：采用Biolog Gen III微孔板对供试细菌进行鉴定，4-6h培养鉴定 结果SIM值0.75是可以接受的结果；16-24h培养后读取结果时，SIM值0.5是可以接 受的结果。经18h培养，经仪器自动扫描读数并查询细菌数据库，以SIM值0.5为标准， 将Q3鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其SIM值为0.673，PROB值为0.977， DIST值为5.774。 0038 分子鉴定：采用。
18、试剂盒提取降解菌DNA，所用扩增引物由华大基因公司合成： 0039 上游引物为5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3； 说 明 书CN 104120100 A 4/6页 6 0040 下游引物为5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。 0041 扩增反应体系为：10Buffer(Mg 2+ )4l，dNTPs3l，引物各1l，菌体DNA2l， Taq DNA聚合酶1l，加去离子水至50l。 0042 PCR反应条件：945min，9430s，5540s，7260s；40个循环；最后于72保 存10min。 0043 PCR产物采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的片段回。
19、收，回收产物测序工 作由华大基因公司完成。测序结果进入GenBank数据库进行比对。将Q3的16S rDNA序 列共2377bp登陆到GenBank进行比对并构建系统发育树(参见图3)，与巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)(N1564-A29)的同源性为100，与Biolog鉴定的结果吻合，因此 将该降解菌Q3鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。 0044 实施例2降解菌Q3的降解特性研究 0045 培养基pH对降解菌Q3生长及降解率的影响：配制好无机盐培养基(加入微量蔗 糖及酵母粉作为附加碳源)分别分装于三角瓶中，每瓶装入50ml培养基，调节培。
20、养基pH值 分别为5、6、7、8、9(每个处理3个重复)，灭菌处理后加入二氯喹啉酸，使每个锥形瓶中二氯 喹啉酸的浓度为20mg/L，再以5(体积分数)的接种量接入活化好的降解菌Q3菌液，放 入30、180rmin -1 的恒温摇床中振荡培养。7d后取样测定其OD 600 值以及降解率。 0046 培养温度对降解菌Q3生长及降解率的影响：配制好无机盐培养基(加入微量蔗糖 及酵母粉作为附加碳源)分别分装于三角瓶中，pH调节为8，灭菌处理后加入二氯喹啉酸， 使每个锥形瓶中二氯喹啉酸的浓度为20mg/L，以5(体积分数)的接种量接入活化好的 降解菌Q3菌液，分别放置于15、20、25、30、35、40。
21、(每个处理3个重复)的恒 温摇床中黑暗振荡培养。7d后取样测定其OD 600 值以及降解率。 0047 接种量对降解菌Q3生长及降解率的影响：配制好无机盐培养基(加入微量蔗糖及 酵母粉作为附加碳源)分别分装于三角瓶中，pH调节为8，灭菌处理后加入二氯喹啉酸，使 每个锥形瓶中二氯喹啉酸的浓度为20mg/L，分别以2、4、6、8、10接种量(体积分 数)接入活化好的Q3菌液(每个处理3个重复)，置于30、180rmin -1 的恒温摇床中振 荡培养。7d后取样测定其OD 600 值以及降解率。 0048 二氯喹啉酸初始浓度对降解菌Q3生长及降解率的影响：配制好无机盐培养基(加 入微量蔗糖及酵母粉作。
22、为附加碳源)分别分装于三角瓶中，pH调节为8，灭菌处理后加入 二氯喹啉酸，使每个锥形瓶中二氯喹啉酸的浓度分别为5、10、20、40、80mg/L，以6(体积 分数)的接种量接入活化好的降解菌Q3菌液，置于30、180rmin -1 的恒温摇床中振荡培 养。7d后取样测定其OD 600 值以及降解率。 0049 培养时间对降解菌Q3生长及降解率的影响：配制好无机盐培养基(加入微量蔗糖 及酵母粉作为附加碳源)分别分装于三角瓶中，pH调节为8，灭菌处理后加入二氯喹啉酸， 使每个锥形瓶中二氯喹啉酸的浓度为20mg/L，以6(体积分数)的接种量接入活化好的 降解菌Q3菌液，置于30、180rmin -1。
23、 的恒温摇床中振荡培养。分别在接种后1d、2d、3d、 4d、5d、6d、7d取样测定其OD 600 值以及降解率。 0050 实验结果显示，二氯喹啉酸内生降解菌Q3在培养温度为30、pH8、接种量 6、二氯喹啉酸初始质量浓度为20mg/L的条件下表现出了最佳的降解效果，其对二氯喹 啉酸的降解率在7d时达到了90以上。 说 明 书CN 104120100 A 5/6页 7 0051 实施例3菌株Q3对烟草药害的防治效果 0052 以K326为供试烟草。将保存的Q3菌株转接到灭菌的液体LB培养基中，于30、 180r/min恒温摇床黑暗振荡培养过夜。 0053 取前茬水稻田使用二氯喹啉酸剂量为推。
24、荐剂量的土壤，风干粉碎后装入径18cm， 高20cm的盆钵，每盆装土3kg。在烟苗移栽前7d 用Q3发酵液(Q3经过夜培养发酵，OD 600 0.63，以每株10ml发酵液兑水200ml稀释后均匀施入盆钵。)进行土壤处理。分别设置 空白对照组(采用无二氯喹啉酸残留土壤栽培，无药害)、药害对照组(二氯喹啉酸残留土 壤，不加降解菌处理)以及处理组(Q3发酵液每株10ml兑水稀释后土壤处理)，每处理设置 3重复，分别在移栽后50d、65d调查各处理的叶长、叶宽(自上而下完全舒展的第四片叶) 以及株高，计算叶长、叶宽、株高抑制率，数据采用Microsoft Excel2003软件处理。 0054 叶长。
25、抑制率()(空白对照叶长-药害叶长)/空白对照叶长 0055 叶宽抑制率()(空白对照叶宽-药害叶宽)/空白对照叶宽 0056 株高抑制率()(空白对照株高-药害株高)/空白对照株高 0057 表1 Q3对烟草二氯喹啉酸药害的修复效果 0058 0059 参见表1，菌株Q3可以明显地减轻二氯喹啉酸对烟草的药害。在移栽后30d， 药害对照组(Quinclorac but no Q3)的叶长、叶宽及株高均受到明显的抑制，其值分别 为空白对照的83.18、64.75、67.67，而菌株Q3生物修复组(Quinclorac+Q3)的叶 长、叶宽及株高则恢复到了空白对照的89.49、92.14及93.6。
26、4。在移栽后45d，药 害对照组(Quinclorac but no Q3)的叶长、叶宽及株高被进一步抑制，仅为空白对照的 79.25,40.09and74.51，而菌株Q3生物修复组(Quinclorac+Q3)的叶长、叶宽及株 高则恢复到了空白对照的93.40、91.70及92.29，显示了 对烟草二氯喹啉酸药害的 良好恢复效果，参见图4。 0060 实施例4菌株Q3微生态菌剂的制备 0061 活化菌株Q3，接种至液体LB培养基，180r/min，30恒温箱培养24h。 0062 其中根据不同的应用方面制备不同的剂型： 0063 (1)液体制剂：用500mL三角瓶装100ml LB培养基，。
27、常规灭菌，冷却后再超净工 作台上，用无菌水直接洗下斜面菌体接种入发酵三角瓶中，摇瓶培养30，180r/min，培 养24h。马上转入发酵罐发酵，细菌发酵罐培养基的配制、灭菌，冷却后接种与发酵，30， 180r/min，培养48h中止发酵，发酵菌液达到每毫升菌液含有10 9 10 12 个芽孢。采用塑料 说 明 书CN 104120100 A 6/6页 8 瓶或者塑料袋包装发酵液。 0064 (2)固体粉剂：参照细菌摇瓶培养基的配制，用500mL三角瓶装100ml LB培养基， 常规灭菌，冷却后再超净工作台上，用无菌水直接洗下斜面菌体接种入发酵三角瓶中，摇瓶 培养30，200r/min，培养24。
28、h。马上转入发酵罐发酵，细菌发酵罐培养基的配制、灭菌，冷 却后接种与发酵，30，180r/min，培养48h中止发酵，离心发酵液，得到菌体，向其中加入 木炭粉吸附菌体，菌体个数每克制剂含有10 12 10 14 个芽孢，再用塑料袋进行密封包装。 0065 实施例5微生态降解菌剂对烟草药害的防治效果 0066 采用微生态降解菌剂(液体制剂)在烟草移栽时灌根。每1公斤降解菌剂用 600-800倍清水混匀，烟草移栽后进行灌根处理。在烟草团棵期，再进行施药1次。该施药 方式的作用和特征为降解烟草根际周围的二氯喹啉酸，减少烟草对二氯喹啉酸的吸收，缓 解二氯喹啉酸对药害，提高烟草产量，其产量达到无药害田的。
29、90以上，而药害田仅是无药 害田的3040，参见图5。 0067 采用微生态降解菌剂(固体制剂)与烟草基肥混合施用。在烟草移栽前，按1.5 公斤降解菌剂/亩剂量与烟草基肥混匀，施至田间。该 施药方式的作用和特征为降解烟草 根际周围的二氯喹啉酸，减少烟草对二氯喹啉酸的吸收，缓解二氯喹啉酸对药害，提高烟草 产量，其产量达到无药害田的90以上，而药害田仅是无药害田的3040。试验证明， 说明所述菌剂能够很好地防治二氯喹啉酸对烟草的药害。 0068 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。 说 明 书CN 104120100 A 1/1页 9 0001 序 列 表CN 104120100 A 1/2页 10 图1 图2 图3 图4 说 明 书 附 图CN 104120100 A 10 2/2页 11 图5 说 明 书 附 图CN 104120100 A 11 。