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1、(10)申请公布号 CN 103962053 A (43)申请公布日 2014.08.06 C N 1 0 3 9 6 2 0 5 3 A (21)申请号 201410196712.5 (22)申请日 2014.04.24 B01F 17/30(2006.01) B01F 17/34(2006.01) (71)申请人江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号 (72)发明人陈海英 (54) 发明名称 一种卵黄高磷蛋白-脂肪酸乳化剂及其制备 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种卵黄高磷蛋白-脂肪酸乳 化剂及其制备方法。本发明乳化剂制备工艺为： 首先，卵黄高磷蛋白溶解在缓冲液。
2、中，搅拌直至其 完全溶解，充分水化。接着，往脂肪酸与N-羟基丁 二酰亚胺混合体系中加入二环己基碳二亚胺(脱 水剂)培养过夜。过滤后将上清液再溶解于乙酸 乙酯中，用NaCl溶液冲洗后过滤，干燥。随后，卵 黄高磷蛋白与脂肪酸酯在碱性环境下进行酰化反 应。最后通过透析，离心去除杂质，取上清液干燥 得最终产品。本发明方法利用脂肪酸酯化后再与 卵黄高磷蛋白酰化技术制备高效乳化剂，工艺设 计科学合理、所需的设备简单、操作安全、所得乳 化剂乳化活性高，稳定性好，适合工业化大规模生 产。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 。
3、权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103962053 A CN 103962053 A 1/1页 2 1.一种卵黄高磷蛋白-脂肪酸乳化剂及其制备方法，包括以下步骤： (1)卵黄高磷蛋白溶液的制备：称取卵黄高磷蛋白，加入到0.01mol/L，pH4.08.0缓 冲溶液中，温度控制在2590，搅拌0.052h，经充分溶解、水化后即可得到0.1 20(w/v)的卵黄高磷蛋白原液，其中，最佳的卵黄高磷蛋白浓度为110(w/v)； (2)脂肪酸酯化：称取脂肪酸和N-羟基丁二酰亚胺，按照1118的比例混合溶 解在四氢呋喃中，在搅拌的条件下按1118的比例缓慢加入二环己基碳二亚。
4、胺(脱 水剂)，在室温下(25)培养过夜，过滤去除二环己脲后干燥，再溶解于乙酸乙酯中(最终 浓度为120)，用浓度为525NaCl溶液冲洗后过滤，干燥得脂肪酸酯； (3)卵黄高磷蛋白与脂肪酸酯的酰化：在搅拌条件下将上述(1)中蛋白溶液缓慢加入 (2)中脂肪酸酯溶液中混合，调节体系的pH到8.010.0并维持直到反应结束，反应时间 为4h10h，最终往体系中加入50150mmol甘氨酸溶液终止反应； (4)产物的分离：将(3)中所得产物在去离子水中透析，时间为12h42h，间隔4h 6h换次水，然后在10100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH5.58.5)中继续透析，时间为12h 42h，间隔4h。
5、6h换次缓冲液，离心去除沉淀物，取上清液干燥，得最终产物。 2.根据权利要求1所述的方法，其中卵黄高磷蛋白来源是：禽蛋蛋黄，鱼卵等。 3.根据权利要求1中所述方法，其中脂肪酸采用：饱和脂肪酸为月桂酸、肉豆蔻酸、 十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、二十二烷酸、二十四烷酸、蜡酸；不饱和脂肪 酸为月桂稀酸、肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、油酸、蓖麻油酸、反油酸、亚油酸、-亚麻酸、花生 四烯酸、二十稀酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸，所用的脂肪酸可以单独或组合使 用。 4.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(1)、(2)、(3)、(4)中，所述的搅拌方式 可以是：机械搅拌、磁力搅拌、涡旋搅拌。
6、、滚筒搅拌、震荡搅拌等。 5.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(1)中，所述的加热方式可以是：摇床加 热、烘箱加热、电磁炉加热、电炉加热、微波加热、电热套加热等。 6.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(2)和(4)中，所述的干燥方式可以是： 冷冻干燥、真空干燥、热风干燥、喷雾干燥、微波辐射干燥。 7.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(4)中，所述的离心的转速为3000 12000rpm。 8.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤(4)中，所述的透析的截留量为8000 30000Da。 权 利 要 求 书CN 103962053 A 1/3页 3 一种卵黄高磷蛋白 - 脂肪酸。
7、乳化剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及乳化剂领域，具体涉及一种卵黄高磷蛋白-脂肪酸乳化剂及其制备方 法。 背景技术 0002 鸡蛋蛋黄可以形成并稳定乳化液，在乳化液工业化生产中具有广泛的应用，是蛋 黄酱、沙拉调味品、奶油、冰淇淋、面霜等产品的主要原料。卵黄高磷蛋白(Phosvitin，简 称Pv)，自然界中磷酸化程度最高的糖蛋白，占蛋黄蛋白质含量的11，是鸡蛋蛋黄优良乳 化功效的主要成分之一。Pv含有220个氨基酸，其中135个是磷酸酰化丝氨酸，在蛋白中 心以单一的排列方式存在并形成极强的亲水核心区域，赋予Pv大量的负电荷(电荷量约 为-179)。蛋白内部静电排斥力的存在，使得蛋白。
8、在水溶液中呈现出细长的结构。同时，C 末端和N末端含有相对较多的疏水性氨基酸，中心部分含有较少量的疏水侧链，使得Pv具 有部分疏水性。此外，Pv含有6.5碳水化合物，平均每分子Pv含6个己糖，5个葡萄糖胺， 2个唾液酸，都以N-乙酰化衍生物的形式存在，呈现出三角分枝类似触角的结构。正是这独 特的分子组成与结构，赋予Pv优良的乳化特性，使得Pv具备作为纯天然生物表面活性剂的 应用潜能。特别的是，Pv还具备优良的金属离子螯合能力、热稳定性、抗氧化性、抑菌能力 等，在食品、医药、化妆品、化工等领域具有广泛的应用前景。随着Pv大规模提取工艺的改 进，原料来源(鸡蛋)经济方便，开发成本低廉，使得Pv成为。
9、蛋白质研究领域瞩目的新星。 0003 对Pv自身结构组成与乳化特性关系的分析不难发现，Pv的N-末端和C末端在 油水界面的吸附能力是决定其乳化特性的关键。对Pv氨基酸组成分析发现，富集在Pv的 N-末端和C末端的疏水性氨基酸数量较少(15个左右)，形成的疏水性尾巴短小，限制了其 在油水界面层的吸附效率及吸附程度，进而限制了Pv的乳化活性。为Pv引入疏水性尾巴， 就可以从根本上进一步改善其乳化特性。 0004 本发明提供了一种快速、便捷，同时乳化效果更优的制备卵黄高磷蛋白-脂肪酸 乳化剂的方法。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种卵黄高磷蛋白-脂肪酸乳化剂及其制备方法。通过在卵 黄高磷蛋。
10、白的末端共价结合上脂肪酸，增加卵黄高磷蛋白的疏水特性，提高蛋白的分子灵 活性，进而对其乳化活性及乳化稳定性起到根本上的改善作用，进一步拓宽了卵黄高磷蛋 白在各领域的应用范围。 0006 本发明的技术方案：一种卵黄高磷蛋白-脂肪酸乳化剂及其制备方法，是将脂肪 酸酯化后与蛋白质酰化，分离纯化后得到最终卵黄高磷蛋白-脂肪酸乳化剂。 0007 所述的脂肪酸酯化后与蛋白质酰化的制备方法是：(1)卵黄高磷蛋白在一定温度 条件下溶解在缓冲液中，充分溶解水化后形成卵黄高磷蛋白溶液。(2)脂肪酸和N-羟基丁 二酰亚胺混合后，在脱水剂存在条件下反应，过滤除杂后溶解在乙酸乙酯中，并用NaCl溶 说 明 书CN 10。
11、3962053 A 2/3页 4 液冲洗，干燥后得脂肪酸酯。(3)在搅拌条件下将蛋白质溶液缓慢加入到脂肪酸酯中，控制 体系的pH值直至反应结束，添加甘氨酸溶液终止反应。(4)分别在去离子水和磷酸盐缓冲 液中透析，离心去除沉淀物，取上清液干燥，得最终产物。 0008 主要反应工艺条件： 0009 (1)制备卵黄高磷蛋白溶液：称取卵黄高磷蛋白，加入到0.01mol/L，pH4.08.0 缓冲溶液中，温度控制在2590，搅拌0.052h，经充分溶解后即可得到0.120 的卵黄高磷蛋白原液。其中，最佳的卵黄高磷蛋白浓度为110。 0010 (2)脂肪酸酯化：称取脂肪酸和N-羟基丁二酰亚胺，按照1118。
12、的比例混 合溶解在四氢呋喃中，在搅拌的条件下按1118的比例缓慢加入二环己基碳二亚 胺(脱水剂)，在室温下(25)培养过夜。过滤去除二环己脲后干燥，再溶解于乙酸乙酯 中(最终浓度为120)，用浓度为525NaCl溶液冲洗后过滤，干燥得脂肪酸酯。 0011 (3)卵黄高磷蛋白与脂肪酸酯的酰化：在搅拌条件下将上述(1)中蛋白溶液缓慢 加入(2)中脂肪酸酯中混合，调节体系的pH到8.010.0并维持直到反应结束，反应时间 为4h10h。最终往体系中加入50150mmol甘氨酸溶液终止反应。 0012 (4)产物的分离：将(3)中所得产物在去离子水中透析，时间为12h42h，间隔 4h6h换次水。接着。
13、在10100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH5.58.5)中继续透析，时间 为12h42h，间隔4h6h换次缓冲液。离心去除沉淀物，取上清液干燥，得最终产物。 0013 本发明具有以下有益效果 0014 本发明从酰化反应原理的角度出发，蛋白质分子的亲核基团(如氨基)与脂肪酸 酯亲电子基团(如羰基)相互反应，从而为蛋白质引入了长碳链亲油基团，使得蛋白成为具 有双极性基团的高分子表面活性剂。酰化后蛋白质分子表面负电荷增多，多肽链伸展及空 间结构发生较大改变，导致分子柔韧性提高，进而增强蛋白质持水性及持油性，改善乳化性 及起泡性。另一方面，从卵黄高磷蛋白微观分子组成及结构角度出发，针对其分子组成结构 。
14、的缺陷，在其末端引入疏水性尾巴，有效的增强其疏水特性，加强了卵黄高磷蛋白在油水界 面层的有效吸附，最终表现出优良的乳化活性和乳化稳定性，同时还改善了卵黄高磷蛋白 的起泡特性。为满足食品、化工、制药、能源等不同加工体系需求提供了更全面更系统的选 择。本发明中提供的卵黄高磷蛋白-脂肪酸乳化剂制备方法不要任何特殊昂贵的仪器设 备，产物的得率高，完全符合工业化大规模生产的要求。 0015 说明书附图： 0016 图1卵黄高磷蛋白-脂肪酸乳化剂制备工艺流程示意图 具体实施方式 0017 实施例1 0018 (1)卵黄高磷蛋白原液的配制：称取卵黄高磷蛋白，加入到0.01mol/L，pH7.0磷酸 盐缓冲溶。
15、液中，在30下搅拌2h，经充分溶解后即可得到浓度为5的卵黄高磷蛋白原液。 0019 (2)称取硬脂酸和N-羟基丁二酰亚胺，按照12的比例混合溶解在四氢呋喃 中，在磁力搅拌的条件下按12的比例缓慢加入二环己基碳二亚胺(脱水剂)，在室温 下(25)培养过夜。过滤去除二环己脲后真空干燥，再溶解于乙酸乙酯中(最终浓度为 5)，用浓度为10NaCl溶液冲洗后过滤，真空干燥得硬脂酸酯。 说 明 书CN 103962053 A 3/3页 5 0020 (3)在磁力搅拌条件下将卵黄高磷蛋白溶液缓慢加入硬脂酸酯中混合，调节体系 的pH到8.5并维持直到反应结束，反应时间为4h。最终往体系中加入55mmol甘氨酸。
16、溶液 终止反应。 0021 (4)所得产物在去离子水中透析，时间为24h，间隔6h换次水。然后在50mmol/L磷 酸盐缓冲液(pH6.5)中继续透析，时间为12h，间隔4h换次缓冲液。离心(转速为8000rpm) 去除沉淀物，取上清液冷冻干燥，得最终产物。 0022 实施例2 0023 乳化活性的测定 0024 将实施例1所得卵黄高磷蛋白-硬脂酸乳化剂按0.5的浓度分散于0.01mol/L， pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，按照油水比例为13加入菜籽油，在室温条件下用分散均质 机以高速剪切均质1min，制备乳浊液。立即从乳浊液的底部吸取50l，迅速分散于5ml， 0.1的十二烷基硫酸钠溶液中，。
17、于500nm波长下测定吸光度A0。乳化活性计算公式：EAI (4.606A0稀释度)/C(1-)104，C是蛋白质浓度，是乳浊液中油含量， 0.25。 0025 乳化稳定性的测定 0026 将制备的乳浊液静置30min后从底部吸取50l，迅速分散于5ml，0.1的十二 烷基硫酸钠溶液中，于500nm波长下测定吸光度A30。乳化稳定性计算公式：ES30A30/ A0100，ES30表示乳浊液制备后放置30min的稳定性。 0027 0028 由此说明，本发明卵黄高磷蛋白-硬脂酸乳化剂的乳化活性和乳化稳定性高。 说 明 书CN 103962053 A 1/1页 6 说 明 书 附 图CN 103962053 A 。