红芪多糖3的分离物及其用途.pdf

本发明提供了红芪多糖3的4个分离物及其制备方法和药物制剂，并对其理化性质（包括分子量及分布、构象、组成、多糖含量、蛋白质含量）、化学结构及抗衰老作用做了研究。药理实验发现，本发明提供的红芪多糖3及红芪多糖3的4个分离物对D-gal致衰老小鼠有显著的抗衰老作用，对实验性2型糖尿病大鼠有很好的降血糖、降血脂作用，同时，红芪多糖3及红芪多糖3的4个分离物具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗辐射及提高免疫力作用。

权利要求书结构如式Ⅰ所示的化合物，名称为红芪多糖3‑A：

其中，n=1~14。
结构如式Ⅱ所示的化合物，名称为红芪多糖3‑B：

其中，n=1~85。
结构如式Ⅲ所示的化合物，名称为红芪多糖3‑C：

其中，n=1~93。
结构如式Ⅳ所示的化合物，名称为红芪多糖3‑D：

其中，n=1~120。
权利要求1‑4所述的红芪多糖3‑A, 红芪多糖3‑B, 红芪多糖3‑C, 红芪多糖3‑D的分离制备方法，其特征在于：红芪多糖3经脱蛋白、脱色素后，过Sephadex凝胶柱，先用蒸馏水洗脱，再用含0～2M不同浓度NaCl的NaAc‑HAc缓冲盐洗脱，得到红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D 4个组分。
权利要求1‑4所述的红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C和红芪多糖3‑D的任一种或任两种以上的组合在制备抗衰老药物、降血糖药物、降血脂药物、提高机体免疫力药物、抗辐射药物、抗氧化药物、抗肿瘤药物、抗凝血药物中的应用。
红芪多糖3在制备抗衰老药物、提高机体免疫力药物、抗辐射药物、抗氧化药物、抗肿瘤药物、抗凝血药物中的应用。
一种药物制剂，包括权利要求1‑4所述的红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C或红芪多糖3‑D的任一种或任两种以上的组合，或红芪多糖3，以及药学上可接受的辅料。
根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于：所述制剂的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂。

说明书红芪多糖3的分离物及其用途
技术领域
本发明涉及红芪多糖3的分离物及其用途，属于天然药物化学技术领域。
背景技术
红芪(Radix Hedysari)系豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪( Hedysarum polybotrys Hand. ‑Mazz)的根. 为甘肃特产名贵药材，中医将其作为传统中药，在临床上其具有强心，降糖，利尿，抗病毒，抗衰老等功效。红芪多糖作为其主要活性成分之一,其中HPS‑3部分具有较明显的降血糖及体外抗氧化等作用。
目前国内外对红芪的化学成分已有了较详细的报道，而对于红芪多糖研究，还只是停留在一级结构及一些药理作用的研究。1997年兰州大学的刘方明从红芪中提取分离出一种均多糖‑葡聚糖，并对其结构进行研究；李世刚等通过葡聚糖凝胶柱层析分离纯化得到3个HPS组分，仅用气相色谱法分析了3个HPS组分的单糖组成，并对HPS体外抗肿瘤活性及构效关系进行研究； 2009年马守军等对甘谷红芪酸性多糖的纯化及结构进行了初探。马丹等通过分步醇沉法和凝胶柱色谱获得HPS‑3纯品,气相色谱法测定其组成。多糖作为生物高分子化合物，药理活性，与其理化性质密切相关，因此，了解其理化性质显得尤为重要。
近年来国内学者相继报道了六味地黄多糖、仙人掌茎粗多糖、北五味子多糖、肉苁蓉多糖、南沙参多糖、滑菇多糖、黄芪多糖和莲子多糖等中药多糖具有抗衰老作用。但关于红芪多糖抗衰老、抗辐射效果的研究，国内、外尚未见报道。而对于多糖降血糖、提高免疫力报道也甚少，本实验首次探讨了红芪多糖抗衰老、降血糖和及降血脂的可能作用机制，为中药延缓衰老和降糖研究开辟新的领域，并对红芪多糖抗辐射和提高免疫力进行了研究。
发明内容
本发明在于提供了红芪多糖3的四个分离组分，并对其药物价值做了分析。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
红芪多糖3的分离物，经如下步骤制得：
红芪多糖3经脱蛋白、脱色素后，过Sephadex凝胶柱，先用蒸馏水洗脱，再用含0～2M不同浓度NaCl的NaAc‑HAc缓冲盐洗脱，得到红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D 4个组分。
具体地，经如下步骤制得：
（1）红芪多糖3经Sevag法脱蛋白，双氧水脱色，将脱色后的红芪多糖3溶液浓缩至一定体积，用终浓度为50%～90%乙醇沉淀1～3次，冷冻干燥；脱色后的红芪多糖3用水溶解后，过DEAE‑cellulose 52柱色谱，分别用含0～2M不同浓度NaCl的NaAc‑HAc缓冲盐洗脱，洗脱溶液的PH值保持4～7，苯酚‑硫酸法示踪，得到4个组分；
其中，0～2M不同浓度NaCl的NaAc‑HAc缓冲盐为：
0~0.1M：用于洗脱红芪多糖3‑A；
0.05~0.5M：用于洗脱红芪多糖3‑B；
0.1~1.0M：用于洗脱红芪多糖3‑C；
0.2~2.0M：用于洗脱红芪多糖3‑D。
（2）以上4个组分分别反复过Sephadex G‑100、Sephadex G‑75凝胶柱，用蒸馏水洗脱，得到红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D 4个组分。
步骤（1）中所述红芪多糖3‑A为球形构象，重均分子量Mw为3～20KDa ，均方根旋转半径Rg为20～70nm ，多分散系数Mw/Mn为1.000～1.300，红芪多糖3‑A各单糖组成的摩尔比例为：葡萄糖(Glc)：半乳糖(Gal) =70～95：1～10，多糖含量为80～100%；红芪多糖3‑A是由α‑D‑(1→4)吡喃(缩写为p)葡萄糖构成主链，每隔3～7个糖残基在O‑6位有1个分支，其中分支上含有→1)Glc，→1)Gal(4→，每8～12个糖残基有1个硫酸基，硫酸基位于Gal的O‑6位。
结构如式Ⅰ所示：

其中，n=1~14。
所述红芪多糖3‑B为高支化度结构，Mw为10～200KDa，Rg为11～25nm，Mw/Mn为1.005～1.410,单糖组成的摩尔比例为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：鼠李糖(Rha)=10～55：5～50；1～15：1～20,多糖含量为70～99%；红芪多糖3‑B以β‑D‑(1→4)半乳糖及β‑D‑(1→4)半乳糖醛酸构成主链，其中还有大量支链，每1～7个糖残基在O‑6位有1个较短或长支链，支链上有→1)Ara(5→与→1) Rha (2→，另外还有非还原末端α‑D‑(1→)吡喃葡萄糖，Ara (1→，每13～19个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于β‑D‑(1→4)半乳糖的O‑6位；红芪多糖3‑B主要含缬氨酸(Val)（37.5%）和甘氨酸(Gly)（22.3%）。
结构如式Ⅱ所示：

其中，n=1~85。
所述红芪多糖3‑C构象为无规则线团，Mw为15～200KDa，Rg为10～23.5nm ，Mw/Mn为1.100～1.350,单糖组成的摩尔比例为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：鼠李糖=12～40：15～65：1～13： 0.15～3，多糖含量为80～98%；红芪多糖3‑C以β‑D‑(1→4)半乳糖及β‑D‑(1→4)半乳糖醛酸构成主链，其中还有较多支链，每4～9个糖残基在O‑6位有1个较短或长支链，支链上含有→1)Ara(5→与→1) Rha (2→，另外还有非还原末端 α‑D‑(1→)吡喃葡萄糖，Ara (1→，每11～16个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于β‑D‑(1→4)半乳糖的O‑6位；红芪多糖3‑C主要含天冬氨酸(Asp)（19.8%），谷氨酸(Glu)（17.6%）， Gly（15.7%）三种氨基酸。
结构如式Ⅲ所示：
其中，n=1~93。
所述红芪多糖3‑D为高支化度结构，Mw为10～150 KDa，Rg为10～25nm，Mw/Mn为1.800～3.000,单糖组成的摩尔比例为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：鼠李糖=15～60：13～55：0.5～10： 3～25.5。多糖含量为82～98.5%；红芪多糖3‑D以β‑D‑(1→4)半乳糖及β‑D‑(1→4)半乳糖醛酸构成主链，其中还有大量支链，每1～5个糖残基在O‑6位有1个较短或长支链，支链上有→1)Ara(5→，→1)Ara(3，5→与→1) Rha (2→，另外还有非还原末端 α‑D‑(1→)吡喃葡萄糖，Ara (1→，每15～19个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于β‑D‑(1→4)半乳糖的O‑6位；红芪多糖3‑D主要含Gly （24.6%），Glu （17.3%），Asp（13.1%）三种氨基酸。
结构如式Ⅳ所示：

其中，n=1~120。
上述红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C和红芪多糖3‑D的任一种或任两种以上的组合在制备抗衰老药物、降血糖药物、降血脂药物、提高机体免疫力药物、抗辐射药物、抗氧化药物、抗肿瘤药物、抗凝血药物中的应用。
红芪多糖3在制备抗衰老药物、提高机体免疫力药物、抗辐射药物、抗氧化药物、抗肿瘤药物、抗凝血药物中的应用。
一种药物制剂，包括上述红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C或红芪多糖3‑D的任一种或任两种以上的组合，或红芪多糖3，以及药学上可接受的辅料。
所述制剂的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂。
一、红芪多糖3中4个组分的构象研究
1、HPS‑3‑B, HPS‑3‑C,HPS‑3‑D水溶液对双缩脲和茚三酮均呈阳性，HPS‑3‑A水溶液则呈阴性；4个组分对苯酚硫酸试剂均产生颜色反应；DAD检测器色谱图显示，HPS‑3‑B,HPS‑3‑C,HPS‑3‑D水溶液在280nm有较弱紫外吸收,HPS‑3‑A水溶液则没有吸收；而4个组分在190nm左右均有多糖特征吸收峰。以上结果表明组分HPS‑3‑A为多糖；组分HPS‑3‑B, HPS‑3‑C,HPS‑3‑D为含少量蛋白质或多肽的多糖蛋白质组合物，经元素分析仪分析，HPS‑3‑B, HPS‑3‑C,HPS‑3‑D有0.3～0.5%N元素（凯氏定氮法为含蛋白质1.875～3.125%）存在也验证了这一点。
2、HPGPC法鉴定多糖组分纯度
采用HPGPC‑DAD‑RI联用技术，色谱柱：Ultrahydrogel 1000、500色谱柱串联，流动相: 超纯水，流速: 0.8ml/min,柱温：40℃，示差折光检测器温度：40℃，进样量:30μl。样品溶液浓度为3mg/ml,0.22μm膜过滤。
图1可见HPS‑3‑A为单一对称峰，而其它3个组分峰虽为单峰，但峰前伸，这是因为HPS‑3‑B, HPS‑3‑C,HPS‑3‑D为多糖蛋白质组合物，其分子结构中存有带电荷的基团，与凝胶柱发生吸附作用，从而出现前延峰。
3、GPC‑MALLS色谱分析条件
采用Ultrahydrogel 1000、500色谱柱串联凝胶色谱，流动相为含0.02%NaN3的0.1MNaNO3溶液，流速为0.8ml/min，柱温：40℃；MALLS的光源气体为氦气和氖气，波长：690nm。流动相的折光指数取1.330，多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)为0.135,校准激光的仪器常数为8.1104×10‑61/(V cm)，校准示差折光检测器仪器常数为2.2697×10‑41/(V cm)。
精密称取样品HPS‑3‑A,HPS‑3‑B,HPS‑3‑C,HPS‑3‑D，用流动相配制成5mg/ml溶液 ，经0.22μm滤膜过滤，进行GPC‑MALLS分析。
进行GPC‑MALLS分析前，样品在溶液中须处于完全溶解状态，且样品浓度不能低于2mg/ml。
本发明采用凝胶渗透色谱‑多角度激光散射（GPC‑MALLS）联用技术，测得红芪多糖3中4个组分在溶液状态的构象，可为红芪多糖3研发成为药品（如注射剂等）提供基础。
通过对流动相含0.02%NaN3的NaNO3溶液的浓度（0～0.1mol/L）、样品浓度（2～5mg/mL）、柱温（30～50℃）及流速（0～1mL/min）对样品激光信号影响的考察，结果表明，流动相对样品激光信号的影响最大，其次为样品浓度，而柱温与流速的影响则较小。为避免过高柱压，同时尽量缩短分析时间，流速设为0.8mL/min。流动相浓度的增大以及样品浓度的增加（特别是分子量较小的样品），在较大程度上削减了噪音，提高了激光信号。因此，选用含0.02%NaN3的0.1MNaNO3溶液为流动相，样品浓度为5mg/mL，柱温为40℃，选取90度角激光信号（灵敏度高），此条件下的样品色谱图见图2～5。
与图1比较，HPS‑3‑A在MAALLS示差图上的出峰时间基本不变，而其他三者出峰时间均出现明显延迟，这与流动相的种类有很大关系。图1采用纯水作为流动相，图2，图3，图4则均采用含0.02%NaN3的0.1MNaNO3溶液作为流动相，HPS‑3‑A作为多糖组分，多糖链的构型与分子形状大小在流动相一定浓度范围内不会随电解质（盐）的浓度改变；而HPS‑3‑B 、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D作为多糖蛋白质组合物，其中含有少量多肽或蛋白质，其构型和分子形状大小会受到电解质（盐）的影响。一般，在电解质（盐）浓度较小时，一定分子量的多糖蛋白组合物会具有较大分子形状，随着电解质（盐）的增加，分子形状会逐渐变小，因为凝胶柱的分子筛作用是按分子大小出峰，而不是按分子量大小被洗脱出来。由于激光信号强弱与样品浓度及分子量有直接关系，而HPS‑3‑A、HPS‑3‑B 、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D配制的浓度相等，因此，由4个组分的90度角激光峰色谱图可见，HPS‑3‑A分子质量最小， HPS‑3‑D的分子质量分布最宽。
图6显示了HPS‑3  4个组分的分子质量分布，可以看出HPS‑3‑D 分子质量分布范围最大。结果显示，HPS‑3‑A重均分子量为3～20KDa ，均方根旋转半径Rg为20～70nm, 多分散系数Mw/Mn为1.000～1.300;HPS‑3‑B重均分子量为10～200KDa，Rg为10～25nm ,Mw/Mn为1.005～1.410; HPS‑3‑C重均分子量为15～200KDa，Rg为10～23.5nm, Mw/Mn为1.100～1.350；HPS‑3‑D重均分子量为11～150 KDa，Rg为11～25nm ,Mw/Mn为1.800～3.000。
由图7可以看出HPS‑3 4个组分中，四者的均方根旋转半径（Rg）随着洗脱体积的增加，均有逐渐变小的趋势，说明分子形状逐渐减小。由软件统计结果可知，四者的Rg都较小，其中，HPS‑3‑A的Rg最大，HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D三者相差不大，这与重均分子量大小顺序是不一致的，这是由于HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D在电解质（盐）溶液中分子形状发生皱缩而引起分子大小降低造成的。一般来说，MALLS准确测定样品均方根旋转半径（Rg）的范围为10nm～500nm,而HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D的Rg均接近于其测定范围下限,从而造成较大的测量误差。
当斜率为1时，表示高分子在溶液中是棒状排列，当斜率为0.4～0.6时则表示高分子在溶液中呈线性无规则线团，斜率约为0.33 时则表示为球状形态。由图8计算HPS‑3‑A的斜率为0.35±0.01，可知HPS‑3‑A在流动相溶液中为球形结构，由图10计算HPS‑3‑C的斜率为0.66±0.15，可知HPS‑3‑C为无规则线团构象的线性聚合物。而由图9与图11可以看出，HPS‑3‑B与HPS‑3‑D的Rg对Mw作图线性关系较差，两者类似U型的曲线表明HPS‑3‑B与HPS‑3‑D为典型的高支化度结构，而且HPS‑3‑D的枝化程度比HPS‑3‑B更高。
二、红芪多糖3中4个组分的单糖组成与多糖含量研究
1、薄层色谱条件
1.1 显色剂：邻苯二甲酸1.6g溶于水饱和的正丁醇100mL，加苯胺0.93g(相当于0.9mL)。展开剂：V（乙酸乙酯）∶V（冰醋酸）∶V（甲醇）:V（水）=7:2:2:1。临用前配。薄层板：硅胶板，用0.3mol·L‑1NaH2PO4 CMC‑Na溶液铺板，105 ℃活化0.5 h。
1.2 单糖标准品混合溶液的配制
称取葡萄糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖各3～5mg，分别加100 μL 水溶解，即得标准单糖溶液。
1.3 样品制备和薄层色谱
将HPS‑3‑A、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D 4个组分分别溶于4mL三氟醋酸( TFA)中 ，封管，110 ℃下水解6 h 。试管内溶液减压蒸干,除尽TFA。再向样品中加水100μL使样品溶解，分别点样单糖对照品和样品，进行薄层色谱，展开显色后，85 ℃加热10 min。
HPS‑3‑A、HPS‑3‑B、 HPS‑3‑C、HPS‑3‑D 4个组分水解液的TLC见图12，5种混合单糖标准品基本分开，单糖标准品在TLC显不同颜色，阿拉伯糖、木糖显红色，葡萄糖、鼠李糖、半乳糖则显棕色。比较4个组分水解液与混合单糖标准品的Rf值，以及TLC的颜色，可推测HPS‑3‑A含葡萄糖，HPS‑3‑B、 HPS‑3‑C、HPS‑3‑D三者均含有阿拉伯糖和半乳糖。
2．气相色谱条件
2..1 程序升温：120 ℃下保持4 min，然后以5 ℃·min‑1 升至190 ℃，保持4 min，再以3 ℃·min‑1升至210 ℃，保持10min。
进样口温度：250 ℃；检测器温度：240 ℃；载气压力：0.5Mpa。
2..2 标准单糖糖腈乙酸酯衍生物的制备
分别称取葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖各8mg，分别加入10 mg盐酸羟胺，再加0.5 mL 吡啶， 90 ℃反应30 min， 冷至室温，加入0.5 mL 醋酸酐，90 ℃继续加热乙酰化，冷却后加入1mL水和1mL氯仿萃取3次，取氯仿层，挥干，残渣加1mL氯仿溶解摇匀，即得标准单糖衍生物。
2..3 多糖水解及糖腈乙酸酯衍生化
分别称取HPS‑3‑A、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D各10 mg，加入2 moL·L‑1 三氟乙酸4 mL，90 ℃密闭水解10 h，减压蒸干，加入MeOH 再蒸干,重复3 次,以彻底除去过量的TFA。以后处理与标准单糖衍生物制备过程相同， 分别进样标准单糖衍生物和多糖衍生物，GC分析。
见图13～17，采用色谱峰面积归一化法测定样品中单糖的摩尔比例，确定HPS‑3‑A是由阿拉伯糖、半乳糖组成的杂多糖，HPS‑3‑A各单糖组成的摩尔比例为：葡萄糖：半乳糖=70～95：1～10， HPS‑3‑B、 HPS‑3‑C、HPS‑3‑D则均为由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖的杂多糖，HPS‑3‑B单糖组成的摩尔比例为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：鼠李糖=10～55：5～50；1～15： 1～18； HPS‑3‑C单糖组成的摩尔比例为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：鼠李糖=12～40：15～65：1～13：0.15～3；HPS‑3‑D单糖组成的摩尔比例为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：鼠李糖=15～60：13～55：0.5～10： 3～25.5。这与TLC分析结果一致。
3.红芪多糖3中4个组分的多糖含量测定
标准溶液的配制: 精确称取已经干燥的各种单糖各20 mg, 分别溶于100 mL蒸馏水中。标准液分别稀释成浓度为40,60,80,100,120,150μg·m L‑1的溶液，取该溶液各0.2mL( 含糖8～30μg，以下同)置于10mL具塞试管中，加入5%苯酚溶液0.5mL混匀后，迅速加入2.5mL浓硫酸，混匀，在60 ℃水浴中保温15min,立即冷却，在490nm处测吸光度，以蒸馏水作为空白。
各种单糖标准曲线在糖含量0～30μg范围内, 吸光度和糖含量呈良好的线性关系。对应的线性方程分别为:
Glc: A= 1.09×10‑ 2c +0.004；
Man: A = 1.40×10‑ 2c‑0.0011 ； Gal: A = 0.87×10‑ 2c‑0.005；
Xyl: A = 1.03×10‑ 2c‑0.002；A ra: A = 0.98×10‑2+0.003；
Rha: A= 0.92×10‑2c‑0.0013 。
A: 在490 nm 处的吸光度,   c :糖含量(μg)。
从各种单糖的标准曲线, 可知其斜率k，并可由此计算各种单糖的校正系数k′，亦即它们对葡萄糖的相对斜率(表1)。对于已知单糖组成的多糖, 可用下式计算其校正系数, k′= Σk a，a为组成糖的重量百分含量，k′为其相对于葡萄糖的校正系数。应用这一结果，就可以葡萄糖为标准测定组成已知的多糖的含量。
表1  各种单糖标准品的校正系数k′
GlcManAraGalXylRhaK×10‑21.091.400.980.871.030.92k′1.001.280.900.800.920.84
以HPS‑3‑A为例计算多糖含量，由GC分析结果得知，HPS‑3‑A各单糖组成的摩尔比例为：葡萄糖：半乳糖=83.83：9.44，其k′=（1.00×92.56+7.44×0.80）/100=0.98,实验测得吸光度值为0.304，由于多糖是以水解产生的单糖参与反应的, 所以由标准曲线直接计算得到的是单糖含量, 需进一步转化为相应多糖含量, 转化系数f = 多糖分子量/有效分子量, 对于多聚己糖f = [ 180 n ‑ 18 (n ‑1) ]/180 n; 对于多聚戊糖f = [ 150 n ‑ 18 (n ‑1) ]/150 n, 对于多糖n> 10, 如果既含有己糖也含有戊糖, 那么0. 91> f > 0. 88。HPS‑3‑A 中主要含己糖，故取f = 0. 90。所以HPS‑3‑A中多糖含量为[(0.304‑0.004)/ 1.10×10‑ 2/0.98]×0.9=24.5（μg）。
表2红芪多糖3中4个组分的多糖含量测定的结果

由表2可知， HPS‑3‑A的RSD值小于5% , 而其他三者误差较大, 这主要是由于这些组分中含有3%～5% 的结合蛋白, Bradford法将其扣除, RSD值均减小到5%以内。
对于由不同单糖构成的杂多糖， 因为不同单糖的标准曲线不同，所以应采用与杂多糖组成相同的混合单糖制作标准曲线。通过TLC和GC分析，得到多糖的单糖组成及其摩尔比例，此可为选择合适单糖标准品制作不同单糖标准曲线提供依据，从而避免因盲目选取单糖标准品造成的浪费及较大实验误差。
三、红芪多糖3中4个组分的化学结构研究
1.红芪多糖3中4个组分的多糖部分化学结构研究
采用部分酸水解、甲基化结合气‑质联用等技术对红芪多糖3中4个组分多糖部分的结构进行了研究。
将100mg 红芪多糖3中4个组分分别置圆底烧瓶中，加入0.1mol/L的TFA 50ml， 100℃水浴水解1h，减压蒸干，加入甲醇蒸干，重复3次，以彻底除去过量的TFA。水解产物溶于H2O中流水透析2d（Mw=3500），蒸馏水透析1d。透析袋内的多糖浓缩，冷冻干燥，凝胶柱色谱（Sephadex G‑100，2.6×50cm）纯化，流速为0.4ml/min，部分收集器每4ml收集一管，浓缩，冷冻干燥得4部分次级多糖。
多糖的甲基化：甲基化前先用硼氘化钠将4个组分样品及部分酸水解样品进行还原，再采用Hakomori法进行四次，将还原后的样品分别置于5ml带橡皮帽的烧瓶中，加DMSO，超声使其溶解，缓慢加1.5ml SMSM，10min之内加完。混合物置超声波中（20～25℃）超声30min，超声过程中通过注射针头通氮气。超声完成后反应瓶置于室温中避光过夜，在冰浴下缓慢滴加2ml碘甲烷，5min内加完，充氮气后密封，常温超声1h，溶液呈淡黄色澄清液。
甲基化多糖的分离：用氮气驱赶剩余的碘甲烷，加入蒸馏水后再转移至透析袋中在蒸馏水中透析完全，冷冻干燥即得甲基化多糖。以上甲基化过程重复多次直至甲基化完全。多糖的甲基化完全与否采用红外光谱来确认，在3400cm‑1处的OH伸缩振动消失为甲基化反应完全。
部分甲基化糖醇乙酸酯的制备：分为水解、还原、乙酰化三步。甲基化多糖置密封特氟龙试管中加88%甲酸（2ml）100 ℃水解6h。旋转蒸发除去甲酸后，剩余物加2mol/L三氟醋酸3ml 100℃再水解6h，通过加入3ml甲醇减压共蒸重复数次至三氟醋酸除尽。最终的水解物溶于2ml 蒸馏水中，加硼氢化钠25mg，摇匀，密封，室温下放置2小时，使其转化为相应的甲基化糖醇，减压蒸发至干，加3ml甲醇和1滴醋酸使多余的硼氢化钠转化为硼酸盐，减压蒸干溶剂。重复三次以上，最后加入5ml甲醇吹干，重复两次。
甲基化糖醇置于试管中，加2ml醋酸酐，密封，100℃加热1小时，取出，冷却至室温，减压蒸干，加入甲苯40℃共蒸至干，再加入3ml氯仿溶解，用蒸馏水3ml洗涤3次，氯仿层用无水硫酸钠干燥，浓缩至300µl即得部分甲酯化糖醇乙酸酯，气质联用分析。
红芪多糖3‑A是由α‑D‑(1→4)吡喃(缩写为p)葡萄糖构成主链，每3～7个糖残基在O‑6位有1个分支，其中分支上含有→1)Glc，→1)Gal(4→，硫酸基,每8～12个糖残基有1个硫酸基，硫酸基在Gal 的O‑6位；红芪多糖3‑B以β‑D‑(1→4)半乳糖及β‑D‑(1→4)半乳糖醛酸构成主链，其中还有大量支链，每1～7个糖残基在O‑6位有1个较短或长支链，支链上有→1)Ara(5→与→1) Rha (2→，另外还有非还原末端α‑D‑(1→)吡喃葡萄糖，Ara (1→，每13～19个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于β‑D‑(1→4)半乳糖的O‑6位；红芪多糖3‑C以β‑D‑(1→4)半乳糖及β‑D‑(1→4)半乳糖醛酸构成主链，其中还有较多支链，每4～9个糖残基在O‑6位有1个较短或长支链，支链上有→1)Ara(5→，;与→1) Rha (2→，另外还有非还原末端 α‑D‑(1→)吡喃葡萄糖，Ara (1→，每11～16个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于β‑D‑(1→4)半乳糖的O‑6位；红芪多糖3‑D以β‑D‑(1→4)半乳糖及β‑D‑(1→4)半乳糖醛酸构成主链，其中还有大量支链，每1～5个糖残基在O‑6位有1个较短或长支链，支链上有→1)Ara(5→，→1)Ara(3，5→与→1) Rha (2→，另外还有非还原末端 α‑D‑(1→)吡喃葡萄糖，Ara (1→，每15～19个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于β‑D‑(1→4)半乳糖的O‑6位。
2. 红芪多糖3中4个组分的氨基酸分析
为了准确的研究糖缀合物中所含氨基酸的种类和数量，所以一般采用氨基酸自动分析仪进行检测。首先称取一定质量的已制备的糖缀合物样品溶于0.5ml6mol/L 的盐酸溶液中，移入水解管封管后，在110℃水解20～24h，切开封管，抽干后，用氨基酸分析仪进行氨基酸分析。
由于HPS‑3‑A中不含蛋白质，氨基酸含量为0； HPS‑3‑B主要含Val（37.5%）与Gly（22.3%） 等2种氨基酸；HPS‑3‑C 主要含Asp （19.8%），Glu（17.6%）， Gly（15.7%）等3种氨基酸，HPS‑3‑D则主要含Gly （24.6%），Glu （17.3%），Asp（13.1%）等3种氨基酸。
3.多糖与蛋白连接方式的分析
取红芪多糖3中4个组分各10mg 溶于5ml 0.1mol/L NaOH 溶液中，30℃反应20h，测定碱处理前后240nm 处氨基酸含量的变化。
红芪多糖3中4个组分经β‑ 消除反应后，HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D三者在240nm 处有明显的吸收峰，因此可说明其均为O‑糖蛋白组合物。
四、红芪多糖3及3中4个组分的抗衰老作用的研究
1.材料：HPS‑3‑A、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D、HPS‑3、70只昆明小鼠，体质量（20.0± 2.0g），雌雄各半。在室温正常光线下自由饮食水,适应性喂养1周后随机分为7组，即正常对照组、衰老模型组，HPS‑3‑A、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D、HPS‑3组  5个治疗组，每组10 只，雌雄各半。D‑半乳糖、超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒,谷胱甘肽过氧化物酶( GSH‑Px)测试盒。
2.给药：昆明小鼠分为7组，除正常对照组外，衰老模型组和红芪多糖3中4个组分及红芪多糖3组每只颈背部皮下注射50g/l D‑半乳糖 0.5ml，进行造模。正常对照组颈背部皮下注射同等剂量生理盐水 。造模完成后，正常对照组和衰老模型组每只腹腔注射生理盐水0.5ml；分别给予治疗组腹腔注射相应的剂量体质量0.5ml的红芪多糖，连续6周。
3.实验指标测定：小鼠血中实验指标测定：血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量，小鼠全血中，谷胱甘肽过氧化物酶的活力。 6 周后，麻醉下将小鼠摘除眼球取血，一部分常规分离血清，在4 ℃下3000r/min 离心5min，取上清待测；另一部分全血待测；超氧化物歧化酶活性，丙二醛含量，谷胱甘肽过氧化物酶( GSH‑Px)测定严格按试剂盒操作程序进行。
4.免疫器官指数测定：6周后，将小鼠称质量并剖取小鼠胸腺和脾脏，用电子天平称质量，以脏器湿质量(mg/g)表示小鼠脾指数和胸腺指数。
5.评估标准：小鼠每天1次注射给药，6 周后，用分光光度计检测小鼠血清中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量及测定小鼠全血中谷胱甘肽过氧化物酶活力。
6.主要观察指标：测定血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、全血中谷胱甘肽过氧化物酶活性及小鼠脾指数和胸腺指数。
7.统计学分析：统计处理数据采用SPSS10.0 统计学软件处理，多组间差异的显著性检验使用方差分析和两组比较用t 检验。
表3红芪多糖3及3中4个组分对D‑gal致衰老小鼠胸腺指数和腺脏指数的影响(n=10, .x±s)
组别剂量mg·kg‑1动物数n胸腺指数mg·(10g)‑1  腺脏指数mg·(10g)‑1对照组‑1022.17±2.6445.63±6.91模型组‑1019.50±2.54**40.98±5.75**HPS‑3‑A1001027.96±5.32ΔΔ50.97±8.94ΔΔHPS‑3‑B1001028.98±4.32ΔΔ51.27±7.34ΔΔHPS‑3‑C1001030.12±5.31ΔΔ52.03±5.23ΔΔHPS‑3‑D1001032.95±4.13ΔΔ54.15±6.16ΔΔHPS‑31001028.96±5.82ΔΔ50.17±9.74ΔΔ
注：t检验，与对照组比较，**p<0.01；与模型组比较，ΔΔP<0.01
如表3所示，小鼠连续皮下注射D‑gal 6周后,胸腺指数和脾脏指数与对照组比较有所下降,且均具有统计学意义，同时灌服100mg·kg‑ 1·d‑ 1HPS‑3‑A、HPS‑3‑B、 HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3均能使衰老小鼠胸腺指数与脾脏指数明显回升(P < 0. 01)，且HPS‑3‑D作用效果最好。
表4 红芪多糖3及3中4个组分对衰老模型小鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛及全血中谷胱甘肽过氧化物酶的影响(GSH‑Px) ( n = 10, .x ±s)

与对照组比较，P*<0.05；与衰老模型组PΔ<0.05
如表4所示，衰老模型组与正常对照组比较，小鼠血清中超氧化物歧化酶活性显著降低，丙二醛含量显著升高（P < 0. 05），证明衰老模型成功建立。HPS‑3‑ A、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D、HPS‑3治疗组与模型组比较，小鼠血清中超氧化物歧化酶活性均显著升高，丙二醛含量均显著降低，全血中谷胱甘肽过氧化物酶活性均明显升高（P < 0. 05或P < 0. 01）。
本实验复制的D‑gal半乳糖致衰老小鼠行动迟缓，皮毛松散无光泽，体质量增加量明显下降，同时血清中超氧化物歧化酶活性显著降低，丙二醛水平明显升高，与上述报道的结论相符。本实验结果表明，红芪多糖3及3中4个组分组与衰老模型组比较，小鼠血清中超氧化物歧化酶活性均明显升高，丙二醛均含量明显降低，具有统计学意义。红芪多糖3及3中4个组分均能明显对抗D‑gal半乳糖的致老化作用，使体内超氧化物歧化酶活性显著提高，丙二醛水平则明显下降，因而推测红芪多糖3及3中4个组分可能通过提高超氧化物歧化酶活性，增强其对自由基的清除能力，抑制脂质过氧化，降低丙二醛含量，从而减轻对机体组织的损伤以延缓衰老。另外，红芪多糖3及3中4个组分对免疫功能也有调节作用，它能够显著增加小鼠的脾指数与胸腺指数。
五、红芪多糖3及3中4个组分降血糖作用的研究
5.1红芪多糖3及3中4个组分对实验性小鼠糖尿病的降血糖作用及小鼠糖耐量的影响
5.1.1.实验动物　清洁级昆明种小白鼠,体质量(20g ±2) g,兰州大学动物中心提供。
5.1.2.药品与试剂　四氧嘧啶(ALX) ( Sigma‑A7413) ,葡萄糖氧化酶试剂盒(四川迈克科技有限公司,批号: 0606101)。
5.1.3.动物造模及给药 取健康昆明种雄性小鼠80只,适应性饲养1 w,禁食(不禁水) 16 h后,腹腔注射2%的新鲜ALX溶液(220 mg/kg) 。末次给药后72 h,禁食(不禁水) 5 h,断尾取血,用葡萄糖氧化酶(GOD‑PAP)法测空腹血糖值( FPG) 。FPG >11.1 mmol/L ,并出现多饮、多食、多尿者,判为造模成功。取造模成功的小鼠60只,随机分为模型组、HPS‑3‑A组、HPS‑3‑B组、HPS‑3‑C组、HPS‑3‑D组、HPS‑3组(各组剂量均为100mg/kg) ,组间血糖差值不大于1.1 mmol/L,每组10只。每天灌胃给药1 次,连续2 w。模型对照组灌胃等容积生理盐水。
5.1.4.检测指标: 一般状况: 观察饮食、饮水、尿量、体质量、精神状态、毛色等状况; 血糖:用GOD‑PAP法测定,第1、2 w禁食3 h,灌胃5 h后的血糖值;糖耐量:在第2 w断尾采血后给药1次,并在给药后0.5 h给予葡萄糖2.5 g/kg灌胃,于灌胃葡萄糖后0.5、2 h断尾采血测血糖值,计算血糖曲线下面积。比较各组动物血糖值及灌胃葡萄糖后各时间点血糖曲线下面积的变化。血糖曲线下面积= 0.25 ×(0 h血糖值+ 4 ×0.5 h血糖值+ 3 ×2 h血糖值) 。
5.1.5.　HPS‑3及3中4个组分的降血糖作用实验
动物造模及给药:取健康昆明种雄性小鼠120只,适应性饲养1 w,将小鼠随机分为正常对照组与实验组,按“3”方法建立四氧嘧啶实验性糖尿病小鼠模型。取造模成功的小鼠84只,按表5分组给药,组间血糖差值不大于1.1 mmol/L。正常对照组灌胃等容积生理盐水。检测指标:同“4”项下内容。
5.1.6.　统计学处理　以SPSS 15.0 处理数据,采用重复测量方差分析( P < 0.05) ,所有数据以.x ±s表示。
5.2红芪多糖3及3中4个组分对实验性大鼠2型糖尿病的降血糖作用
5.2.1.动物  Wistar大鼠，SPF级，体重180～220g，♀，实验动物使用许可证号：SCXK(甘)2004‑0006)由甘肃中医学院科研实验中心提供。
5.2.2.试剂  格华止盐酸二甲双胍片（批号：0906066），由中美上海施贵宝制药有限公司提供；ACCU‑CHEKActive型血糖试纸（批号：22967331），由德国ROCHE公司提供。
5.2.3. 方法
实验性2型糖尿病大鼠模型的建立、分组及给药
取7～8周龄雌性wistar大鼠100只，按体重随机选取10只作为空白对照，用基础饲料喂养。其余90只饲以高脂高糖饲料4周，一次性按30 mg/kg注射链脲佐菌素（STZ），继续饲以高脂高糖饲料4周制作实验性2型糖尿病模型。8周后选取空腹血糖≥11.l mmoL/L的大鼠70只，按体重随机分为2型糖尿病模型组、HPS‑3‑A、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D、HPS‑3  5个治疗组（100mg/kg·d）及二甲双胍组（100 mg/kg·d）。空白对照组及2型糖尿病模型组给予量生理盐水。以上各组均灌胃给药，连续给药5周后取材，测血糖指标。取材前一天断尾取血，用血糖测试仪测大鼠血糖，结果以mmol/L。
5.2.4. 统计学处理
以SPSS 15.0 处理数据,采用重复测量方差分析( P < 0.05) ,所有数据以.x ±s表示。
表5红芪多糖3及3中4个组分对实验性糖尿病小鼠血糖影响(±s,n=14)

注：与空白组和模型组对比，*P<0.05。
由表5可见， 5个治疗组和空白组、模型组比较，在不同时间点上小鼠血糖均降低有统计学意义(P<0.05)， 显示HPS‑3及3中4个组分治疗后小鼠血糖均降低。
表6芪多糖3及3中4个组分对实验性糖尿病小鼠糖耐量的影响(±s,n=14)

注：与空白组和模型组对比,*P<0.05 ☆☆P<0.01
由表6可见HPS‑3及3 中4个组分在2 h均可不同程度地降低葡萄糖小鼠血糖，与空白组和模型组相比，均有统计学意义(P<0.05)，HPS‑3‑A (P<0.01)；5个组血糖曲线下面积的降低与空白组和模型组相比,均有统计学意义(P<0.05)，HPS‑3‑A(P<0.01)；说明模型组存在糖耐量减退，HPS‑3 及3中4个组分均可改善2型糖尿病及胰岛素抵抗。
表7HPS‑3及3中4个组分对实验性2型糖尿病大鼠血糖的影响(±s,n=10)

注：与空白组对比*P<0.05 与模型组对比ΔP<0.05 与MET组对比, ☆P<0.05
由表7可见，实验性2型糖尿病大鼠模型组血糖值很高，而HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D 、HPS‑3组和二甲双胍（MET）组的血糖值均较低，与模型组比较具有统计学意义（P<0.05）。说明较MET相比，HPS‑3‑A、 HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D、HPS‑3具有更好地降血糖作用。另外，在实验过程中还观察到红芪多糖中5个给药组均可明显改善糖尿病大鼠“三多一少”症状及大鼠的精神状态，而MET则没有。
本实验通过探讨红芪多糖3及3中4个不同组分对实验性糖尿病小鼠血糖的影响,表明其均对胰岛素依赖型———四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠血糖升高有显著的抑制作用；糖耐量试验表明：红芪多糖3中及3中4个组分能提高糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力,较快地抑制餐后血糖的上升,可能对胰岛β细胞具有较强的修复能力。P<0.05
红芪多糖3及3中4个组分均可明显改善糖尿病大鼠“三多一少”症状及大鼠的精神状态，表明其在降低2型糖尿病大鼠血糖的同时，能够通过调节大鼠机体免疫功能，从而在整体上改善糖尿病大鼠的生存质量。
六、红芪多糖3及3中4个组分降血脂作用的研究
6.1 实验试剂与仪器
6.1.1实验药品与试剂
HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3均配制成7.5g/l溶液，置于4℃条件下保存;
总胆固醇试剂盒中生北控生物科技股份有限公司;
甘油三脂试剂盒中生北控生物科技股份有限公司;
高密度脂蛋白胆固醇试剂盒中生北控生物科技股份有限公司;
格华止盐酸二甲双胍片(批号：0706066)
6.1.2 实验仪器:
雅培Abbott Alcyon 300全自动生化分析仪
6.1.3 Wistar大鼠，SPF级，体重180～220g，♀，实验动物使用许可证号：SCXK(甘)2004‑0006)由甘肃中医学院科研实验中心提供。
6.1.4剂量选择及饲喂
HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3剂量均为0.075g/kg.bw。每日一次经口给予，连续灌胃30天后测各项指标。设正常对照组与模型组(0 g/kg.bw)和二甲双胍组，用水(己消毒)代替受试物。
高脂饲料配方为:7.88%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、.02%胆盐。
6.2实验方法
6.2.1大鼠的分组及饲养
在实验环境下，大鼠喂饲基础饲料，观察10天。禁食16小时，取血测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL‑C)。根据基础值水平随机分为：空白组、高脂对照组、HPS‑3‑A、 HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3七个组。
采用预防性高脂动物模型实验方法。HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3组在给予高脂饲料的同时灌胃相同剂量的多糖溶液；正常对照组给予正常饲料，高脂对照组给予高脂饲料的同时灌胃相应体积的水。给受试物30天后，禁食16小时，测定各组大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇。
6.2.2 血清总胆固醇测定方法
大鼠股动脉采血，收集血清用雅培Abbott Alcyon 300全自动生化分析仪进行测定，结果以mol·L ‑ 1表示。
6.2.5实验数据处理:
实验数据用统计软件SPSS软件进行方差分析统计。
6.3 结果与讨论
6.3.1  HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3组对SD大鼠血清TC的影响
表11HPS‑3及3中4个组分对实验性2型糖尿病大鼠降血脂作用的影响(±s,n=10)

注：与空白组对比*P<0.05 与模型组对比ΔP<0.05 与MET组对比, ☆P>0.05
由表11可见，实验性2型糖尿病大鼠模型血脂代谢异常表现在TC、TG含量增加，而HDL‑C含量降低，LDL‑C含量升高。HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3改善了糖尿病大鼠血脂代谢异常:(1)降低了血浆中TC、TG的含量。与2型糖尿病模型组比较，均有统计学意义(p<0.05)。(2)使HDL‑C的含量增高(P＞0.05)；使LDL‑C的含量降低，与模型组比较，给药组各剂量组均具有统计学意义(p<0.05)。HPS‑3改善2型糖尿病大鼠模型高血糖的同时也改善了血脂代谢异常，并且无剂量依赖性。
6.4结论
实验采用预防性高脂模型实验方法，经口给予大鼠HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3 30天后，与模型对照组比较: HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3组不但能降低血清血清甘油三酯的含量(P<.005)及降低血清总胆固醇的含量(P<.005)，而且能升高血清高密度脂蛋白胆固醇的含量(P<.005), 根据降血脂功能的判定方法可得出结论：HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3具有预防和降低高血脂症的作用。
七．红芪多糖3及3中4个组分增强免疫力功能研究
7.1 材料和方法
7.1.1  HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3均配制成7.5g/l溶液，置于4℃条件下保存;
7.1.2  对小鼠免疫器官重量的影响:见四中的表3。
7.1.3 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取昆明种小鼠70只, 体重19‑21g, 雌雄各半, 随机分为对照和实验组。给药组灌胃给予浓度均为7.5g/l 的HPS‑3‑A、 HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3,对照组给予自来水。灌胃容积100mg/kg体重。 每天1次, 连续给药14天。停药当天每只小鼠腹腔注入5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml。20小时后处死动物。注射2.5mlHank液冲洗腹腔, 取0.2ml冲洗液滴于载玻片上,37℃ 温孵30分钟。用生理盐水冲去未贴壁的细胞, 甲醇固定, 姬‑瑞氏混合染液染色。镜下计算200个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的细胞数, 计算吞噬百分率, 并按下式计算吞噬指数。
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/100个巨噬细胞
7.1.4 对环磷酰胺致红细胞、白细胞减少和免疫器官抑制作用的影响
昆明种小鼠70只, 体重19‑21g , 雌雄各半, 随机分为6组。空白对照组, 环磷酰胺组, HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3组，于1,3,6天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg各1次,给药组灌胃100mg/kg体重, 每天灌胃给药1次, 连续7天, 并于1、3和6天腹腔注射环磷酞胺50mg/kg各1次。于末次给药后1小时, 尾尖取血镜下计数红、白细胞, 并处死小鼠称胸腺和脾脏湿重。
8.1 结果
表12HPS‑3及3中4个组分对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

与对照组比较*P<0.05  **P<0.01
表12表明，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能增强, 吞噬率由对照组27%增加至62%。
表13HPS‑3及3中4个组分对环磷酞胺致红细胞.、白细胞数减少和免疫抑制作用的影响

表13表明, 环磷酸胺可致红细胞、白细胞数减少和脾脏、胸腺萎缩.与环磷酞胺组相比, HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3可使红细胞、白细胞数量显著增加, 并使胸腺和脾脏重量增加。
8.2 讨论
HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用,此外, HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3还可增加免疫器官重量,抑制环磷酞胺引起的小鼠红细胞、白细胞减少和免疫器官萎缩。提示HPS‑3‑A HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3不仅可增加非特异性免疫功能, 还可对抗化疗药的毒性作用。
九．红芪多糖3及3中4个组分抗辐射功能研究
9.1 实验部分
9.1.1 实验材料
健康昆明种雄性小鼠，20 ± 2g，鼠龄6～7周，由兰州大学GLP实验动物中心提供，共90只×2批，每组15只，随机分为6组，空白组(不照射不给药)，实验对照组(照射模型组，只照射不给药)，HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3组（100mg/kg）。
8.1.2. 实验方法
动物存活率测定：雄性健康小鼠90只，于实验室适应性喂养三天后，随机分为7组，每组15只。正常对照组和辐射对照组给予等量生理盐水，均于早晨空腹灌胃，每日1次，每次0.5mL，每两天称体重，根据体重调整给药量，期间动物自由摄食和饮水。各组连续灌胃10d后进行X射线源照射，辐射后继续灌胃10d，观察照射后30d存活率及存活时间。
外周血细胞数、胸腺脾脏指数测定：健康雄性小鼠90只，于实验室适应性喂养三天后，随机分为7组，每组15只。空白组和辐射对照组给予等量蒸馏水，均于早晨空腹灌胃，每日1次，每次0.5mL，每天称体重，记录并根据体重调整给药量，期间动物自由摄食和饮水。各组连续灌胃10d后进行X射线照射，于照射前、照射后第2、5、7、11、16d，分别剪尾尖采血，加稀释液后用自动血球分析仪（日本Sysmex，KX‑21N）测外周血白细胞和淋巴细胞数、血红蛋白、血小板、网织红细胞。照射后第15d称量小鼠体重，颈椎脱臼处死后，摘取小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血后，称重，分别除以小鼠体重，再乘以10，得到胸腺指数和脾脏指数。
照射条件：以6MHz X射线辐射源（由兰州市陆军总院提供）对小鼠进行一次性全身照射，吸收剂量率为1.0 Gy/min，吸收剂量为8Gy，源距为50cm，观察小鼠存活率；吸收剂量率为1.0 Gy/min，吸收剂量为4Gy，源距为50cm，小鼠进行一次性全身照射观察对小鼠造血功能的影响。
统计学处理：
数据以均数±标准差（X±S）表示，组间差异显著性采用t检验，采用SPSS统计软件，应用LSD法进行两两比较。外周血细胞数用方差分析，显著性（p<0.01，0.05）作为有效依据。
计软件，应用LSD法进行两两比较。外周血细胞数用方差分析，显著性（p<0.01，0.05）作为有效依据。
9.2 结果与讨论
9.2.1 对小鼠体重的影响：
表14.HPS‑3及3中4个组分对小鼠体重的影响(g，x±s)

*与照射模型组相比P<0.05，**与空白组相比P<0.01。
结果表明：照射后第2～5天除空白组外各组重均明显下降，HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3剂量组与模型组均有显著性差异。随着剂量组的口服时间延长，体重也随之缓慢增加，说明HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3均能增加辐照后小鼠体重。
9.2.2  HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3对30天受照小鼠X射线照射小鼠存活率影响：
表15.HPS‑3及3中4个组分对受8GyX‑照射对各组小鼠存活率的影响

*与照射模型组相比P<0.05，**与照射模型组相比P<0.01。
各组鼠（除空白组）在射线照射后当天，小鼠食欲下降活动减少，体重皆下降，陆续出现精神萎靡不振，耳廓及尾部苍白，部分小鼠耳廓出现血斑，辐照组更为明显。但随着时间的推移小鼠渐渐恢复活力，HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3组恢复较快，两周左右；小鼠毛色有光泽且较浓密，较少出现皮毛稀疏松散现象。照射后，辐照组小鼠开始出现被毛蓬乱，稀疏无光泽，采食量下降，从第8天开始陆续死亡。辐照组与实验组相比，死亡时间较早，死亡数较多。从表4中可以看出，HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3组均能提高辐照小鼠的存活率。HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3量组与辐照组比较，死亡鼠平均存活时间均有所延长，能显著延长平均存活时间。
存活率和存活时间是反映抗辐射作用的最基本最客观的指标，因为抗辐射的最终目的就是为了提高存活率和延长存活时间。实验结果表明HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3组对X‑照射小鼠具有良好的抗辐射效果，可以增加小鼠的体重、平均存活时间和30d存活率，即HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3对X‑射线照射小鼠有保护作用。
9.2.3  HPS‑3‑A 、HPS‑3‑ B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3对辐射损伤小鼠外周血白细胞和淋巴细胞数量的影响：
表16.HPS‑3及3中4个组分对小鼠辐照前后外周血白细胞计数的影响(109/L,X±S)

*与照射模型组相比，P<0.05**与照射模型组相比，P<0.01
表17.HPS‑3及3中4个组分对小鼠辐照前后外周血淋巴细胞计数的影响(109/L，X±S)

*与照射模型组相比,P<0.05**与照射模型组相比,P<0.01
中等剂量4.0 Gry射线作用后，主要遭受严重损伤的是以骨髓为代表的造血器官。照射使造血功能受抑制，出现造血系统的早期辐射效应：造血干细胞减少，增殖不力，造血微环境调控失调，造血因子网络调节紊乱，导致全血细胞减少。
由表16可知，各给药组在第16天与模型组比较均能显著性提高辐照小鼠白细胞数量。由表17可见，各给药组能显著提高外周血淋巴细胞数量。白细胞数与外周血白细胞数的变化基本一致。综上，各给药组外周血白细胞和淋巴细胞数有不同程度的提高。
9.2.4  HPS‑3‑A 、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3‑对小鼠脾指数和胸腺指数的影响：
表18.HPS‑3及3中4个组分对辐射小鼠胸腺、脾脏指数的影响
组别剂量(mg/kg)胸腺指数(mg/10g)脾脏指数(mg/10g)空白组‑‑17.90±6.2678.65±13.64模型组‑‑12.92±8.6428.58±6.54HPS‑3‑A组10018.26±9.06*39.51±9.04*HPS‑3‑B组10015.21±5.15*50.27±13.09**HPS‑3‑C组10015.05±8.61*53.02±8.39**HPS‑3‑D组10015.82±7.85*57.51±11.26**HPS‑3组10017.56±9.56*40.45±10.04*
＊ 与照射模型组相比P＜0.05，＊＊与照射模型组相比P＜0.01。
胸腺是机体重要的免疫器官，在淋巴细胞的成熟过程中起着重要的作用。放射线损伤可使胸腺萎缩，胸腺重量减轻，并伴随其功能的改变，导致机体内未成熟的淋巴细胞明显增多，从而影响机体的免疫功能，所以一般以胸腺作为免疫功能研究的指标。
与模型组比较，各给药组的胸腺指数均有显著性差异，脾脏既是免疫器官又是小鼠的造血组织，各给药组脾脏指数与正常对照组均无显著性差异，与模型组却有显著性差异。以上结果说明HPS‑3‑A 、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C 、‑D、HPS‑3均能提高免疫器官胸腺、脾脏的脏器指数，对小鼠免疫损伤的恢复有促进作用。本实验结果表明，HPS‑3‑A 、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C 、HPS‑3‑D、HPS‑3均对X‑射线诱发的辐射损伤有较好的保护作用。
十、红芪多糖3（HPS‑3）及3中4个组分的抗氧化活性
实验试剂
三羟甲基氨基甲烷(Sigma公司进口分装)；抗败血酸‑Vc(西安化学试剂厂)红芪多糖
3及3中4个组分（红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D）；邻菲啰啉等其它试剂均为国产分析纯。
实验仪器
CR22G Ⅱ型离心机(日本日立公司)；UV‑1700型紫可见分光光度计(日本岛津公司)；UV‑9100型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器厂)；AB204‑S电子分析天平；KQ3200DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
实验方法
1. 总还原能力
分别配制一系列浓度为0，1.0，2.0， 3.0，4.0和5.0 mg/mL的红芪多糖3及3中4个组分溶液1mL，分别与1mL pH 6.6的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)，以及 1mL 1%((W/V) 铁氰化钾混合液于 50℃保持 20min，随即加入 1mL三氯乙酸(10%，W/V)终止反应，并于3000rpm离心 10min，取上层液，用2mL水稀释后加入0.1%(W/V)三氯化铁 (新配置)0.2mL，振摇之后在 700nm处测定吸光度 A值。同时测定Vc、HPS‑3及3中4个组分。
2.OH.抑制作用的测定
反应混合物中包括2.4mL 0.15mol/L的磷酸钠缓冲液(pH7.4）中含60μL的氯化亚铁(1 mmol/L)，0.15 mL的过氧化氢(0.17mol/L)，90μL的邻菲啰啉 (1mmol/L)及一系列浓度为0， 1.0，2.0， 3.0， 4.0和5.0 mg/mL的红芪多糖3及3中4个组分1.5mL为被测液，室温反应 1 h。在 λ=560 nm处测定A值。测试。同时测定Vc 、HPS‑3及3中4个组分对∙OH的抑制率。抑制率=[1‑（A1‑A2）/A0]×100%，式中 A0(不加样品)、A（加样品）、A2（不加邻菲啰啉）的吸光度。
3. O‑2∙抑制作用的测定
采用邻苯三酚法。取4mLpH 8.2，0.05 mol/L 的Tris‑HCl缓冲液，适量去离子水混匀后置25℃水浴保温10m in，分别加入一系列浓度为0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mg/mL的红芪多糖3及3中4个组分溶液1mL，25 ℃温浴 10 min，最后加入25 ℃预热过的邻苯三酚盐酸(3mmol/L)溶液0.4 mL，混匀后在37 ℃保温 4 min， 立即用浓盐酸 HCl溶液0.5ml终止反应， 并在λ=320 nm处测定A值。空白组以去离子水代供试品。同样的操作测定Vc与HPS‑3中4个组分。抑制率(E%)=（A空‑A样）/A空白×100%。式中 A空、A样分别表示不含样品溶液和被测样品溶液反应后的吸光度。
实验结果
总还原能力
总还原能力如图1所示，由图1可以看出，在实验浓度范围（1～5 mg/mL）内，对照Vc，红芪多糖3及3中4个组分还原能力与浓度的增加正相关，它们的总还原力与Vc（Vc代表维生素C）接近。一般情况下，物质的还原能力越强，其抗氧化活性也越高。
OH.（羟基自由基）抑制作用
其结果如图2所示，由图2可以看出，在实验浓度范围（1～5 mg/mL）内，对照Vc，红芪多糖3及3中4个组分还原能力与浓度的增加正相关，它们的总还原力与Vc 相当。而且，当4个组分浓度低于2mg/mL时，它们的OH.清除作用能力甚至要高于Vc。
O‑2∙(超氧自由基)抑制作用
结果如图3所示，由图3可以看出，在实验浓度范围（1～5 mg/mL）内，对照Vc，红芪多糖3及3中4个组分O‑2∙清除能力与浓度的增加正相关，它们的O‑2∙清除能力与Vc 接近，甚至，当4个组分浓度低于2mg/mL时，它们的O‑2∙清除作用能力甚至要高于Vc（维生素C）。
讨论
心脑血管疾病、糖尿病等都与自由基的过剩有关，特别是一些活泼自由基如 O‑2∙等。它们会使机体发生氧化而损伤人体的正常细胞，但是，抗氧剂可以有效地通过竞争或化学反应等清除各种类型的自由基，预防自由基引起的病变、机能减退等。
具体地，在实际应用中，由红芪多糖3及红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D制备的抗氧化药物的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制。
在具体制备时，溶液剂加辅料苯甲酸钠，加入量为0.1%~8%；糖浆剂辅料为蔗糖，加入量6%左右；颗粒剂辅料为淀粉，加入量为多糖量的1/16~1/4；胶囊剂辅料为淀粉，加入量为多糖量的1/8~1/4；散剂辅料为淀粉，加入量为多糖量的1/4~1；丸剂辅料为水蜜，加入量为多糖量的0.1%~10%；片剂辅料为低取代羟丙基纤维素,加入量为多糖量的0.5%~8%；水针剂辅料为斑蝥酸钠，加入量为多糖量的1%~15%；冻干粉剂辅料为乳糖，加入量为多糖量的0.5%~9%；贴剂辅料为羟丙基纤维素，加入量为多糖量的0.5%~8%；凝胶剂辅料为卡波沫，加入量为多糖量的1%~10%；膜剂辅料为海藻酸钠，加入量为多糖量的0.6%~7%；滴丸剂辅料为聚乙二醇6000，加入量为多糖量的0.5%~8%；酒剂辅料为黄酒，加入量为多糖量的1/20~1/5；浸膏剂加入辅料为蜂蜜，加入量为多糖量的0.8%~5%；缓控释制辅料为海藻酸钠，加入量为多糖量的0.1%~5%。
十一、红芪多糖3及3中4个组分的抗肿瘤活性
MTT，全称3‑(4,5)‑dimethylthiahiazo (‑z‑y1)‑3,5‑di‑ phenytetrazoliumromide，为一种黄色染料。在活细胞线粒体中， 细胞色素C的作用下，琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜生成的多少用酶标仪在570nm 处进行测定。通常情况下，甲臜生成量与活细胞数量成正比例关系，因此可根据光密度OD值推算出活细胞的数目，而在死细胞中，由于不含有琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会发生反应。通常情况下，此法中的 MTT 浓度为5mg/mL。因此，可以称取MTT0.5g，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜滤过以去除溶液里的细菌，然后4℃ 避光保存。在配制和保存的整个过程中，容器最好采用铝箔纸包住，不过需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，却不能测定细胞的绝对数。在使用酶标仪进行检测时，为了保证实验结果的较好线性，MTT 吸光度A值最好在0‑0.7 范围内。
1.细胞株
人胃癌细胞株MKN45  (兰州大学第二附属医院) ,培养于含10%新生胎牛血清、100 U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM 完全培养液中, 37℃恒温、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育,每隔1～2 d更换1次培养液,取对数生长期的细胞进行实验。
2.主要试剂
DMEM培养基( Gibco公司) ；新生胎牛血清( Fetal Bovin serum, FBS,兰州民海生物工程有限公司)；胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO) 、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(均为Sigma公司产品) ; 环磷酰胺(上海易利试剂盒专卖);多糖样品均为实验室自制。
3. 试验仪器
超净工作台(上海博迅实业有限公司) ; CO2培养箱(日本三洋工业株式会社) ;酶标自动分析仪B IO2RAD550 型(美国) 。
4. 实验步骤
（1）接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔2×104个细胞接种到96孔板，每孔体积100uL.
（2）培养细胞：同一般培养条件，培养24h（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
（3）加样∶培养24 h后,分别加入含有不同浓度（50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、400ug/mL）环磷酰胺溶液（阳性对照）、红芪多糖3及3中4个组分（红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D）溶液,每孔加药量为100μL。
（4）呈色：培养2天后，每孔加MTT溶液（5g/L用PBS <ph=7.4>配)20uL.
（5）继续37℃孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150uL DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。
（6）比色：选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，比较红芪多糖3及3中4个组分的抗肿瘤活性。
5.实验结果与讨论
表19    红芪多糖3及3中4个组分对人胃癌细胞的抑制作用

实验结果，如表19，可知红芪多糖3及3中4个组分均对人胃癌细胞MKN45具有抑制作用，而且，均具有量效关系。当多糖浓度达400μg/mL时，对肿瘤细胞抑制率达到了60%以上。然而，，五者的作用效果与常见的抗肿瘤药环磷酰胺相比较小，但环磷酰胺毒副作用较多，因此，红芪多糖3很有潜力成为新一代的抗癌药。
具体地，在实际应用中，由红芪多糖3及红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D制备的抗肿瘤药物的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制。其中，溶液剂加辅料苯甲酸钠，加入量为0.1%~8%；糖浆剂辅料为蔗糖，加入量6%左右；颗粒剂辅料为淀粉，加入量为多糖量的1/16~1/4；胶囊剂辅料为淀粉，加入量为多糖量的1/8~1/4；散剂辅料为淀粉，加入量为多糖量的1/4~1；丸剂辅料为水蜜，加入量为多糖量的0.1%~10%；片剂辅料为低取代羟丙基纤维素,加入量为多糖量的0.5%~8%；水针剂辅料为斑蝥酸钠，加入量为多糖量的1%~15%；冻干粉剂辅料为乳糖，加入量为多糖量的0.5%~9%；贴剂辅料为羟丙基纤维素，加入量为多糖量的0.5%~8%；凝胶剂辅料为卡波沫，加入量为多糖量的1%~10%；膜剂辅料为海藻酸钠，加入量为多糖量的0.6%~7%；滴丸剂辅料为聚乙二醇6000，加入量为多糖量的0.5%~8%；酒剂辅料为黄酒，加入量为多糖量的1/20~1/5；浸膏剂加入辅料为蜂蜜，加入量为多糖量的0.8%~5%；缓控释制辅料为海藻酸钠，加入量为多糖量的0.1%~5%。
十二、红芪多糖3及3中4个组分的抗凝血活性
1.分组与给药
实验将动物随机分为6组( n = 12) :模型对照组、红芪多糖3、红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D组， 分别于手术前灌胃给药1 个月, 每天一次,模型组分别予同等体积的生理盐水灌胃。
2. 动物模型制备
大鼠末次给药0. 5 h 后, 以10% 水合氯醛( 300mg/ kg) 麻醉, 仰位固定, 保证手术期间有自主呼吸。常规消毒, 颈正中切口, 分离双侧颈总动脉( 注意避免损伤迷走神经和鞘后方的交感干) , 用手术线分别在近心端和远心端双重结扎, 造成急性不完全性脑缺血， 缝合创口后放回原环境饲养。
3. 凝血功能、血清测定
造模成功后24 h, 大鼠腹主动脉取血2 ml, 置于抗凝的试管中( 血与抗凝剂的比值为9：1) , 血凝仪测定血浆凝血酶原时间( PT) 、凝血活酶时间( APTT) 、凝血酶时间( TT) 和纤维蛋白原含量(FIB) 。
4.对大鼠凝血功能的影响
各用药组大鼠的凝血酶原时间、凝血活酶时间、凝血酶时间较模型组大鼠显著延长， 纤维蛋白原显著减少( P < 0. 01， 见表20)，表明红芪多糖3及3‑A、3‑B、3‑C、3‑D具有抗凝血作用。
表20 大鼠凝血功能实验结果
组别PT(秒)APTT(秒)TT(秒)FIB(g/L)空白组18.22±1.8819.02±2.5647.68±5.211.92±0.11红芪多糖3‑A19.50±2.03*21.44±1.23**39.51±4.35**3.12±0.12**红芪多糖3‑B20.51±1.65*21.67±2.02**44.02±3.45**2.34±0.16**红芪多糖3‑C19.04±2.01*23.56±1.03**46.34±2.66**2.02±0.22**红芪多糖3‑D19.61±1.23*21.53±3.45**41.35±2.23*2.40±0.21**红芪多糖319.06±1.45*22.53±2.45**42.33±3.53*2.01±0.28*
*P<0.05,**P<0.01与空白组比较
5.讨论：
研究结果表明，红芪多糖是通过干扰内源性凝血系统的活性，抑制凝血酶原向凝血酶的转化，从而使纤维蛋白原向纤维蛋白的转变过程受到抑制，达到抗凝血的效果。
具体地，在实际应用中，由红芪多糖3及红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D制备的抗肿瘤药物的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制。其中，溶液剂加辅料苯甲酸钠，加入量为0.1%~8%；糖浆剂辅料为蔗糖，加入量6%左右；颗粒剂辅料为淀粉，加入量为多糖量的1/16~1/4；胶囊剂辅料为淀粉，加入量为多糖量的1/8~1/4；散剂辅料为淀粉，加入量为多糖量的1/4~1；丸剂辅料为水蜜，加入量为多糖量的0.1%~10%；片剂辅料为低取代羟丙基纤维素,加入量为多糖量的0.5%~8%；水针剂辅料为斑蝥酸钠，加入量为多糖量的1%~15%；冻干粉剂辅料为乳糖，加入量为多糖量的0.5%~9%；贴剂辅料为羟丙基纤维素，加入量为多糖量的0.5%~8%；凝胶剂辅料为卡波沫，加入量为多糖量的1%~10%；膜剂辅料为海藻酸钠，加入量为多糖量的0.6%~7%；滴丸剂辅料为聚乙二醇6000，加入量为多糖量的0.5%~8%；酒剂辅料为黄酒，加入量为多糖量的1/20~1/5；浸膏剂加入辅料为蜂蜜，加入量为多糖量的0.8%~5%；缓控释制辅料为海藻酸钠，加入量为多糖量的0.1%~5%。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
附图说明
图1为HPS‑3中4个组分的HPGPC图；
图2为HPS‑3‑A示差图（1）和90度角激光峰色谱图（2）；
图3为HPS‑3‑B示差图（1）和90度角激光峰色谱图（2）；
图4为HPS‑3‑C示差图（1）和90度角激光峰色谱图（2）；
图5为HPS‑3‑D示差图（1）和90度角激光峰色谱图（2）；
图6为HPS‑3中4个组分的分子质量分布图；
图7为HPS‑3 中4个组分的均方根旋转半径分布图；
图8为 HPS‑3‑A的Rg 与Mw 之间的关系图；
图9为HPS‑3‑A的Rg 与Mw 之间的关系图；
图10为HPS‑3‑A的Rg 与Mw 之间的关系图；
图11为HPS‑3‑A的Rg 与Mw 之间的关系图；
图12为红芪多糖3中4个组分TLC图（1. HPS‑3‑A；2. HPS‑3‑B；3.混合单糖标准品(Rf值由小到大依次为半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖);4. HPS‑3‑C；5. HPS‑3‑D）；
图13混合单糖标准品的气相色谱图；
图14 HPS‑3‑A的气相色谱图；
图15 HPS‑3‑B的气相色谱图；
图16 HPS‑3‑C的气相色谱图；
图17 HPS‑3‑D的气相色谱图；
图18是红芪多糖3中4个组分的总还原能力(n=5)曲线图；
图19是红芪多糖3中4个组分的OH.抑制作用(n=5) 曲线图；
图20是红芪多糖3中4个组分的O‑2∙抑制作用(n=5) 曲线图；
在图18‑图20中，HPS3a、HPS3b、HPS3c、HPS3d、HPS3分别表示红芪多糖3‑A、红芪多糖3‑B、红芪多糖3‑C、红芪多糖3‑D、红芪多糖3。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
（1）红芪多糖3的提取
红芪药材粉碎后，用95%乙醇脱脂1～3h。5～20倍水量在40～100℃下提取1～5次，每次1～3h。合并提取液，浓缩成一定体积。将浓缩液首先用终浓度为0～70%乙醇沉淀，过滤，沉淀；上述沉淀后的上清液用终浓度为20%～80%乙醇再沉淀；再沉淀后的上清液再用终浓度为30%～90%乙醇沉淀，过滤，沉淀冷冻干燥，得红芪多糖3（HPS‑3）。
（2）红芪多糖3的分离纯化
HPS‑3经Sevag法脱蛋白，双氧水脱色， 将脱色后的HPS‑3溶液浓缩至一定体积，用终浓度为70%～90%乙醇沉淀1～3次，冷冻干燥。脱色后的HPS‑3用水溶解后，过DEAE‑cellulose 52柱色谱(2.6cm ×70cm)，分别用含0～2M不同浓度NaCl的NaAc‑HAc缓冲盐洗脱，苯酚‑硫酸法示踪，得到4个组分。
以上4个组分分别反复过Sephadex G‑100(2.6cm ×90cm)、Sephadex G‑75凝胶柱(2.6cm ×90cm)，用蒸馏水洗脱，最终得到HPS‑3‑A、HPS‑3‑B、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D 4个组分。
HPS‑3过 DEAE‑cellulose 52柱色谱，洗脱溶液的PH值需保持5.2左右。采用含0、0.1、0.3M 3种不同浓度NaCl的NaAc‑HAc缓冲盐洗脱。上样前，对于不溶杂质离心去除。
（3）红芪多糖3中4个组分的构象分析
经HPGPC鉴定，HPS‑3‑A,HPS‑3‑B,HPS‑3‑C,HPS‑3‑D均为均一组分，采用Ultrahydrogel 1000、500色谱柱串联凝胶色谱，流动相为含0.02%NaN3的0.1MNaNO3溶液，流速为0.8ml/min，柱温：40℃；MALLS的光源气体为氦气和氖气，波长：690nm。流动相的折光指数取1.330，多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)为0.135,校准激光的仪器常数为8.1104×10‑6 (V cm)‑1，校准示差折光检测器仪器常数为2.2697×10‑4 (V cm)‑1。
精密称取样品HPS‑3‑A,HPS‑3‑B,HPS‑3‑C,HPS‑3‑D，用流动相配制成5mg/ml溶液 ，经0.22μm虑膜过滤，进行GPC‑MALLS分析。
HPS‑3‑A 为球形构象，重均分子量为3～20KDa ，均方根旋转半径Rg为20～70nm, 多分散系数Mw/Mn为1.000～1.300;HPS‑3‑B为高支化度结构，重均分子量为10～200KDa，Rg为10～25nm,Mw/Mn为1.005～1.410;HPS‑3‑C构象为无规则线团,重均分子量为15～200KDa，Rg为10～23.5nm,Mw/Mn为1.100～1.350； HPS‑3‑D为高支化度结构,重均分子量为11～150 KDa，Rg为11～25nm,Mw/Mn为1.800～3.000。
GPC‑MALLS分析，样品在溶液中处于完全溶解状态，样品浓度为5mg/ml左右。采用0.02%NaN3的0.1MNaNO3溶液为流动相。
（4）红芪多糖3中4个组分的单糖组成
1.薄层色谱条件
显色剂：邻苯二甲酸1.6g溶于水饱和的正丁醇100mL，加苯胺0.93g(相当于0.9mL)。展开剂：V（乙酸乙酯）∶V（冰醋酸）∶V（甲醇）:V（水）=7:2:2:1。临用前配。薄层板：硅胶板，用0.3mol·L‑1NaH2PO4 CMC‑Na溶液铺板，105 ℃活化0.5 h。
2．气相色谱条件
程序升温：120 ℃下保持4 min，然后以5 ℃·min‑1 升至190 ℃，保持4 min，再以3 ℃·min‑1升至210 ℃，保持10min。
进样口温度：250 ℃；检测器温度：240 ℃；载气压力：0.5Mpa
采用色谱峰面积归一化法测定样品中单糖的摩尔比例，确定HPS‑3‑A是由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖，HPS‑3‑A各单糖组成的摩尔比例为：葡萄糖：半乳糖： =70～95：1～10， HPS‑3‑B、 HPS‑3‑C、HPS‑3‑D则均为由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖的杂多糖，HPS‑3‑B单糖组成的摩尔比例为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：鼠李糖=10～55：5～50；0～15： 0～18； HPS‑3‑C单糖组成的摩尔比例为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：鼠李糖=12～40：15～65：0～13： 0～3；HPS‑3‑D单糖组成的摩尔比例为：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：鼠李糖=15～60：13～55：0～10： 0～25.5。
（5）红芪多糖3中4个组分的多糖含量测定
标准溶液的配制: 精确称取已经干燥的各种单糖各20 mg, 分别溶于100 mL蒸馏水中。标准液分别稀释成浓度为40, 60, 80, 100,120,150 μg·m L‑1的溶液，取该溶液各0.2mL( 含糖8～30μg，以下同)置于10mL具塞试管中，加入5%苯酚溶液0.5mL混匀后，迅速加入2.5mL浓硫酸，混匀，在60 ℃水浴中保温15min,立即冷却，在490nm处测吸光度，以蒸馏水作为空白。
HPS‑3‑A中多糖含量为50～100%； HPS‑3‑B中多糖含量为50～99%；HPS‑3‑C中多糖含量为50～98%；HPS‑3‑D中多糖含量为50～98.5%。
（6）红芪多糖3中4个组分的多糖部分化学结构研究
采用部分酸水解、甲基化结合气‑质联用等技术研究了红芪多糖3中4个组分多糖部分的结构进行了研究。
红芪多糖3‑A是由α‑D‑(1→4)吡喃(缩写为p)葡萄糖构成主链，每隔3～7个糖残基在O‑6位有1个分支，其中分支上含有→1)Glc，→1)Gal(4→，每8～12个糖残基有1个硫酸基，硫酸基在O‑6位；红芪多糖3‑B以β‑D‑(1→4)半乳糖及β‑D‑(1→4)半乳糖醛酸构成主链，其中还有大量支链，每1～7个糖残基在O‑6位有1个较短或长支链，支链上有→1)Ara(5→，与→1) Rha (2→，另外还有非还原末端α‑D‑(1→)吡喃葡萄糖，Ara (1→，每13～19个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于β‑D‑(1→4)半乳糖的O‑6位；红芪多糖3‑C以β‑D‑(1→4)半乳糖及β‑D‑(1→4)半乳糖醛酸构成主链，其中还有较多支链，每4～9个糖残基在O‑6位有1个较短或长支链，支链上有→1)Ara(5→，;与→1) Rha (2→，另外还有非还原末端 α‑D‑(1→)吡喃葡萄糖，Ara (1→，每11～16个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于β‑D‑(1→4)半乳糖的O‑6位；红芪多糖3‑D以β‑D‑(1→4)半乳糖及β‑D‑(1→4)半乳糖醛酸构成主链，其中还有大量支链，每1～5个糖残基在O‑6位有1个较短或长支链，支链上有→1)Ara(5→，→1)Ara(3，5→与→1) Rha (2→，另外还有非还原末端 α‑D‑(1→)吡喃葡萄糖，Ara (1→，每15～19个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于β‑D‑(1→4)半乳糖的O‑6位。
（7）红芪多糖3中4个组分的氨基酸分析
首先称取一定质量的已制备的糖缀合物样品溶于0.5ml6mol/L 的盐酸溶液中，移入水解管封管后，在110℃水解20～24h，切开封管，抽干后，用氨基酸分析仪进行氨基酸分析。
由于HPS‑3‑A中不含蛋白质，因此氨基酸含量为0. HPS‑3‑B主要含Val（37.5%）与Gly（22.3%）, HPS‑3‑C 主要含Asp （19.8%），Glu（17.6%）， Gly（15.7%）三种氨基酸，HPS‑3‑D则主要含Gly （24.6%），Glu （17.3%），Asp（13.1%）三种氨基酸。
（8）多糖与蛋白连接方式的分析
取红芪多糖3中4个组分各10mg 溶于5ml 0.1mol/L NaOH 溶液中，30℃反应20h，测定碱处理前后240nm 处氨基酸含量的变化。
红芪多糖3中4个组分经β‑消除反应后，HPS‑3‑B 、HPS‑3‑C、HPS‑3‑D在240nm处有明显的吸收峰，因此可说明三者均为O‑糖蛋白组合物。
（9）红芪多糖3胶囊制备
红芪药材粉碎后，5～20倍水量在40～100℃下提取1～5次，每次1～3h。合并提取液，浓缩成一定体积。将浓缩液首先用终浓度为0～70%乙醇沉淀，过滤，沉淀；上述沉淀后的上清液用终浓度为20%～80%乙醇再沉淀；再沉淀后的上清液再用终浓度为30%～90%乙醇沉淀，过滤，沉淀60℃以下干燥，加60%‑95%乙醇制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g‑1.0g）。
（10）红芪多糖3饮料制备
红芪药材粉碎后，5～20倍水量在40～100℃下提取1～5次，每次1～3h。合并提取液，将提取液浓缩为每1ml液体相当于0.01‑1g红芪药材的浸膏，向浸膏中加甜味剂和矫味剂，制成饮料。
(11) 红芪多糖3‑A,3‑B,3‑C,3‑D制剂的制备
红芪多糖3‑A,3‑B,3‑C,3‑D粉，加药物制剂常用的润滑剂、崩解剂，压片，制片剂。
红芪多糖3‑A,3‑B,3‑C,3‑D粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒剂。
红芪多糖3‑A,3‑B,3‑C,3‑D粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g‑1.0g）。
红芪多糖3‑A,3‑B,3‑C,3‑D粉，加注射用水使浓度达每ml含0.01mg‑10mg 3‑A,3‑B, 3‑C, 3‑D，封装于安瓶中，每瓶1ml‑5ml,高压灭菌，制成灭菌注射剂，用于肌肉注射或静脉注射。
红芪多糖3‑A,3‑B,3‑C,3‑D粉，加注射用水使浓度达每ml含0.01mg‑10mg 3‑A,3‑B, 3‑C, 3‑D，高压灭菌，在百级净化环境中装于西林瓶中，冷冻干燥，制成冻干粉针剂，用于肌肉注射或静脉注射。
以上所述仅为说明本发明的实施方式，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。