本发明涉及一种制备可热胶凝的β-1，3-葡聚糖的方法，该葡聚糖可在食品及化学工业领域应用。 在自然界中，存在许多含有非热胶凝性β-1，3-葡聚糖颗粒的细胞。例如，已经存在从眼虫属（一种原生动物属）回收这种葡聚糖颗粒的已知方法（日本专利公开号37279/1989）。这些葡聚糖颗粒结晶度很高，其特征是在热水中不溶胀（Carbohydrate Research，75（1979）231-242）。另一方面，作为一种由（例如）产碱杆菌属或土壤杆菌属的微生物胞外排泄的β-1，3-葡聚，已知有Curdlan，于热水中加热时，它会凝胶（New Food Industry，20，49，1978）。
如上所述，存在两种β-1，3-葡聚糖，即非热胶凝性的β-1，3-葡聚糖和可热胶凝性的β-1，3-葡聚糖。
非热胶凝性的β-1，3-葡聚糖在诸如凝胶性、保水性、粘合性等方面无法起到Curdlan的作用。目前还没有通过从细胞获得的非热胶凝性β-1，3-葡聚糖制备可热胶凝的β-1，3-葡聚糖的工业化方法。
本发明涉及一种制备可热胶凝的β-1，3-葡聚糖的方法，该方法包括将非热胶凝性β-1，3-葡聚糖溶于碱中，调节该溶液的pH，使其不超过10，从而沉淀出可热胶凝的β-1，3-葡聚糖。
本发明所用的非热胶凝性β-1，3-葡聚糖颗粒是通过常规方法从含有这种葡聚糖颗粒的动物、植物、微生物等地细胞中得到的。所述的细胞最好通过培养原生动物（如眼虫属）获取，眼虫属原生动物的实例包括Euglena gracilis和Euglena gyacilis Var bacillars.
具体讲，可以提到下列菌株，如Euglena gracilis Klebs NIES-47，Euglena gracilis Klebs NIES-48、Euglena gracilis Var baci-llaris Pringsheim NIES-49等。这些菌株是已知的原生动物，已保藏在Global Environmental Forum at the National Institute of Pol-lution Research。
这些眼虫属原生物在受到x射线、紫外线或其它辐射时，或用诱变剂处理时，很容易发生突变。这些突变体只要具备在其细胞内各界非热胶凝性β-1，3-葡聚糖的能力，也可以用于本发明方法。
关于眼虫属原生动物培养基，可以提到的有Koren-Hutner培养基（Koren，L.E.C.，Hutner，S.H.，Journal of Protozoology14，Supplement17，1967）、Kuragano培养基（日本专利公报号58064/1985）和Kitaoka培养基（日本专利公报号37297/1989）。通过令眼虫属原生动物在这种培养基中，或在该培养基的适当变体中生长，并收获该眼虫属原生动物细胞，可以得到含非热胶凝性的β-1，3-葡聚糖。
将含有一种β-1，3-葡聚糖的细胞湿法破裂，释放出非热胶凝性的β-1，3-葡聚糖颗粒。可采用压力为300-600千克/平方厘米的压力细胞分裂仪，或借助超声分裂仪实施上述破裂过程。然后用碱处理破裂的细胞，溶解非热胶凝性的β-1，3-葡聚糖颗粒。在进行这项处理时，可以事先将非热胶凝β-1，3-葡聚糖颗粒与破裂的细胞碎片相分离，也可以照原样使用既含所述葡聚糖颗粒又含破裂细胞的体系。在后一情况下，破裂细胞（它们是不溶性的）可以通过发泡工艺（下文将与碱溶解工艺一同介绍）去除，这种工艺具有适于工业生产的效率。实际上对所用的碱并没有任何限制，但一般采用氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵。溶解非热胶凝性β-1，3-葡聚糖颗粒所需的碱浓度一般不需要比1N高许多，但当体系中既含非热胶凝性β-1，3-葡聚糖又含细胞碎片时，3-5N的浓度是恰当的。因为这有助于产生泡沫。溶解工艺中非热胶凝性β-1，3-葡聚糖的优选浓度约为0.1-1%（重量）。
将该非热胶凝性β-1，3-葡聚糖颗粒溶解之后，去除碱不溶性部分。此不溶部分主要是眼虫属或其它细胞的碎片。通过向上述碱化体系鼓入空气，可产生泡沫，这些泡沫可将细胞碎片带走，从而高效率经济地除去不溶性物质。下文将更加详细地介绍这一工艺。
利用涡轮混合机或类似的机械，或借助于连续发泡机械，将空气压缩或鼓入含有破裂细胞的碱化淤浆中，从而产生泡沫。泡沫的体积一般不少于淤浆体积的30%，最好为50-70%。尽管在上述碱浓度下很容易产生泡沫，但为了稳该泡沫以便更加分散地将其除去，可以向体系中添加卵清蛋自（占淤浆体积的0.1-0.5%）或表面活性剂（如糖酯）。
最好于环境温度（20-30℃）对泡沫进行分离，形成离散界面所需的时间，即泡沫层形成时间，不大于3-4小时。可采用容器规模的间歇分离装置对泡沫进行分离，或者对于泡沫层或多或少有些不稳定的体系，采用包括细长容器的连续分离装置。
通过上述处理得到不含不溶物的非热胶凝性β-1，3-葡聚糖溶液。然后将此溶液pH调至10或低于10，使β-1，3-葡聚糖析出。在考虑对β-1，3-葡聚糖进行沉淀时，该沉淀过程宜在中性pH范围进行，最好在pH为6-6.5范围进行。尽管可以选择性地采用适当的pH调节剂，但一般使用无机酸较好，例如，盐酸、硫酸、硝酸和磷酸。上述沉淀出的β-1，3-葡聚糖是可热胶凝的，从商业角度考虑，最好将其进一步脱盐、浓缩并干燥，以便将其制成粉末。举例讲，用离心法对含有沉淀葡聚糖的上述溶液进行浓缩，用水洗涤，得到脱盐的浓缩物（2-4%）。可对此浓缩物进行喷雾干燥，得到干燥粉末，或者经冻干，在亲水有机溶剂中解冻，脱水，真空加热干燥，得到干燥粉末。
按本发明制备的β-1，3-葡聚糖是可热胶凝的，与副淀粉和其它已知的非热胶凝性β-1，3-葡聚糖不同。利用一特性，可将其更加有利地用于食品和化学工业。例如，它可以用于与Curdlan相同的应用领域。
下面的实例进一步说明本发明。
例1
向一个5升发酵缸中添加3升Koren-Hutner培养基，然后于121℃灭菌20分钟。用150毫升处于同样的培养基中的Euglena gracilis klebs NIES-48培养种接种该发酵缸。于28℃，400转/分的转速，1升/分通气量的条件下，于暗处培养96小时。两个发酵缸得到6.15升培养肉汤。细胞的产率为2%（以干重为基准），这种干产物含20%的β-1，3-葡聚糖。
（1）利用台式离心机（型号PS-18GL，Tomy Rrecision Industries，Ltd，Japan），于6000转/分转速下对5.0升上述培养肉汤进行离心浓缩，得到一千克浓缩的眼虫属膏状物。
（2）向此湿细胞膏状物添加足量的水，使总量达到2升，利用高压匀浆器（商品名：Manton-Gaulin，APV Gaulin，美国产）于300个大气压下对该混合物进行匀化，从而将该眼虫属细胞破碎，并释放出葡聚糖颗粒。
（3）向所得的含破裂细胞的浆液中添加30%氢氧化钠，使其浓度达到3N，将该混合物加热到60℃，所述β-1，3-葡聚糖于4小时内溶解。
（4）将此碱化的破裂细胞溶液（3.5升）冷却至约30℃。然后添0.2%（体积）非热胶凝性卵清蛋白（Takeda，Chemical Industries，Ltd.Japan出产）。在一个涡轮搅拌器（5升）中搅拌该混合物，以形成泡沫。当泡沫的体积达到进料体积的约50%时，停止搅拌，体系静置3-4小时。这样，原生动物细胞碎片和其它不溶物被吸收到泡沫中，并作为浮渣被除去。从该搅拌器的底部取出不含破裂细胞碎片的β-1，3-葡聚糖溶液（约3.0升）。
（5）用4N盐酸将该β-1，3-葡聚糖溶液的pH调为6-6.5，以便沉淀出β-1，3-葡聚糖。
（6）用上述Tomy离心机对此含有沉淀葡聚糖的溶液进行离心浓缩（8000转/分，10分钟），得到一种中性浓缩物（含固量2.5%）。添加足量的水（使总体积达到3升）重新将此浓缩物淤浆化，得到脱盐的中性浓缩物（含固量3%）。再次用水稀释该浓缩物，经过与上述相同的操作，得到300克中性浓缩物（含固量3%）。
（7）于-20℃将上述浓缩物（300克）分批冻干，添加两倍于其体积的醇于室温将该浓缩物融化，接着用玻璃过滤器真空脱水，得到24克脱水产物（含固量为25%）。将此脱水产物于60℃真空干燥，得到干燥的絮片。然后用台式粉碎机对该干絮片进行粉碎，得到7克β-1，3-葡聚糖粉末。
这种β-1，3-葡聚糖粉末（样品1）的品质参数与碱处理之前的β-1，3-葡聚糖颗粒（样品2）的品质参数均列于表1。
表1 粉末的品质参数
样品2 样品1
平均粒度（μ） 3 70
湿度（%） 2 5
溶解性（光学密度，660nm） - 80
燃烧后的残余量（%） 0.05 1.2
凝胶强度（克/平方厘米）：
2%浓度 不凝胶 160
3%浓度 不凝胶 400
4%浓度 不凝胶 750
凝胶强度：向β-1，3-葡聚糖添加10毫升水，使之达到指定的浓度，用Potter′s均混器对该混合物进行均化，并真脱气。将匀浆置于试管（直径1.6厘米）中，于沸水浴中加热10分钟。用自来水将试管冷却30分钟，将所得的凝胶切成10毫米高。用凝乳计（Iio Type，Iio Elect-ric Co.，Japan）测定此试样的凝胶强度。
从表1的数据可以明显看到，得自眼虫属培养肉汤（属名：副淀粉）的β-1，3-葡聚糖是非热胶凝性的，本发明方法制备的β-1，3-葡聚糖是可热胶凝的，其凝胶强度可与通常的凝胶剂（琼脂，明胶，Curdlan等）相比。
例2
采用5升发酵缸，按与例1相同的方式培养Euglena glacilis klebs NIES-48，得3.1升培养肉汤。用自立式离心机（8000转/分，10分钟）对2升上述肉汤进行离心浓缩，得到上述细胞的膏状物。用水稀释该细胞膏状物，使总体积达400毫升，并用近距离声波定位器（T-A-4280，10kc，10分钟）进行处理，以便将细胞粉碎。
（1）向200毫升该淤浆中添加30%氢氧化钠，使其浓度达到3N，β-1，3-葡聚糖颗粒于60℃在约5小时内被溶解。用Tomy离心机（8000转/分，10分钟）对该溶液进行离心分离，以除去不溶物。用35%HCl将所得溶液中和至pH为6.0，将此中性溶液脱盐，并用Tomy离心机（8000转/分，10分钟）进行浓缩，得到约12克膏状物。用水稀释该膏状物，使总体积达200毫升，经两次脱盐和浓缩，得12克脱盐的浓缩物。于-20℃冻干浓缩的膏状物，然后添加两倍于其体积的醇将其融化，经Nutsche真空过滤脱水后，得1.4克脱水产物。此脱水产物进一步于50℃真空干燥，得到一种多孔的淡绿色干燥产物。然后在研钵中对其进行粉碎，得0.5克粉末。
（2）在上述步骤（1）中进行碱溶之前，用100%体积的99%乙醇对该淤浆进行脱色，并用Tomy离心机进行离心浓缩，得到脱色的破裂细胞膏状物。用水重新将该膏状物淤浆化，使总体积达200毫升，用100%体积的正己烷对其进行脱脂。水层经与步骤（1）相同的处理，得0.5克多孔白色粉末。
分别将粉末（1）和粉末（2）分散在水中，制成2%分散液，然后进行均化，于100℃加热，冷却至环境温度。这些凝胶的凝胶强度分别为150克/平方厘米和180克/平方厘米。
按照上述方法，可从由眼虫属得到的非热胶凝性β-1，3-葡聚糖制备可热胶凝的β-1，3-葡聚糖。
例3
在200毫升1N氢氧化钠水溶液中溶解2克副淀粉粉末，同时进行搅拌，用4N盐酸将该溶液的pH调至6.0，从而沉淀出β-1，3-葡聚糖。用Tomy离心机（8000转/分，10分钟）离心浓缩所得的中性淤浆，用200毫升水重新将浓缩物配成浆液。按与上述相同的方式离心浓缩此淤浆，得50克膏状物。于-20℃冻干此膏状物，添加200%体积的乙醇将其融化，接着通过滤纸进行吸滤，得8克脱水产物。此产物进一步于60℃真空干燥，得2克多孔干燥产物。
按前述方法测定所得β-1，3-葡聚糖粉末的凝胶强度，浓度为2%时其值为200克/平方厘米。因此这种葡聚糖粉末是可热胶凝的，原料副淀粉没有凝胶性。