MYB28蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用.pdf

本发明公开了一种MYB28蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。本发明所提供的应用为由序列3所示蛋白质在如下任一中的应用：a1)调控植物对ABA耐受性；a2)选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种；a3)调控植物的胎萌抗性；a4)选育胎萌抗性提高或降低的植物品种。本发明可应用于将植物激素ABA作为选择性除草剂，通过基因工程手段获得MYB28低表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草，亦可通过调节MYB28的表达水平控制植物种子的萌发率，通过基因工程手段获得MYB28基因高表达、抗胎萌转基因作物。本发明符合可持续农业发展需求，对于开拓绿色环保、无公害的除草方法，提高种子食用品质和贮藏品质等方面具有重要的实用价值和市场前景。

权利要求书1.  由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1)-a4)任一中的 应用： a1)调控植物对ABA耐受性； a2)选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种； a3)调控植物的胎萌抗性； a4)选育胎萌抗性提高或降低的植物品种。 2.  由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1)-a4) 任一中的应用： a1)调控植物对ABA耐受性； a2)选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种； a3)调控植物的胎萌抗性； a4)选育胎萌抗性提高或降低的植物品种。 3.  培育转基因植物的方法，为如下(A)-(D)中任一种： (A)培育对ABA耐受性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物 中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植 物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性降低； (B)培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物 中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得 到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高； (C)培育胎萌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导 入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物； 所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性提高； (D)培育胎萌抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中对 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转 基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性降低。 4.  根据权利要求1或2所述的应用，或权利要求3所述的方法，其特征在于： 所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至5)中 任一所述的DNA分子： 1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第3至1103位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)序列表中序列1所示的DNA分子； 4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子； 5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。 5.  根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：在所述(A)和(C)中，所 述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因均是通过含有所述蛋 白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。 6.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述蛋 白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。 7.  根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶 植物或单子叶植物。 8.  一种对权利要求3-7任一中所述(B)中的转基因植物进行除草的方法，其特 征在于：所用除草剂是浓度为M的ABA溶液；所述浓度为M的ABA溶液对于待除 杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受。

说明书MYB28蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种MYB28蛋白及其编码基因在调控植物对 ABA耐受性中的应用。
背景技术
脱落酸(Abscisic Acid，ABA)是植物体内重要的激素之一，早在20世纪60年 代初被人们发现，因其具有促进植物叶片脱落的功能而得名。植物激素脱落酸(ABA) 在植物生长发育的各阶段都发挥重要作用，包括种子休眠、萌发，幼苗生长，气孔运 动，以及营养生长向生殖生长转换等过程。同时，ABA在植物应对外界各种逆境胁迫 响应中起着重要作用，例如干旱、冷、盐以及机械伤害等非生物胁迫，以及病虫害等 生物胁迫。由于植物在固着生物，遇到不良环境不能像动物通过移动位置去躲避外界 不良环境以及全球气候环境变化等因素的影响，植物ABA信号转导通路分子机制的 阐明对调控植物生长、提高作物品质、改良遗传特性、促进现代农业生产发展具有重 要的意义。
近年来，植物中ABA受体及其信号转导功能组分的筛选与鉴定、ABA生物代谢 及转运以及ABA信号转导通路模型的构建及与其它植物激素间的交叉对话等研究均 取得了重要进展，有力推动了植物中ABA信号转导调控机理的阐明。到目前为止， 研究人员分别鉴定出了三种不同的ABA受体或候选受体：镁螯合酶H亚基 CHLH/ABAR、START超家族中的PYR/PYL/RCAR受体以及G蛋白偶联受体GTG1、 GTG2。
ABAR是第一个被鉴定出来的植物ABA受体，拟南芥中ABAR蛋白就是叶绿体 中的镁螯合酶的H亚基(CHLH)，在其介导的ABA信号通路中起正调控作用。目前 的研究表明ABAR介导的ABA信号通路是非常复杂的。通过酵母双杂交筛选候选的 ABAR互作因子，已经获得一些重要的ABAR下游调节子。这些调节子预示着ABAR 介导着多样化的ABA信号调控网络。
MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域通常 含有1-4个不完全重复的氨基酸序列(R)，每一个重复序列R中大约有52个氨基酸， 形成3个α螺旋，每隔约18个氨基酸规则间隔的色氨酸(W)残基，所以每一个重复 中共有3个规则间隔色氨酸。随着对MYB转录因子家族成员的研究，越来越多的MYB 转录因子被人们所认知。
MYB转录因子在动植物中都存在，拟南芥中已鉴定处超过140个以上MYB转录 因子，其中含有两个MYB结构域的R2R3-MYB成员最多，MYB转录因子广泛参与 植物次生代谢调控、细胞形态发生、胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等。拟 南芥中已报道的参与ABA信号通路中的MYB转录因子有：MYB2、MYB13、MYB15、 MYB30、MYB33、MYB44、MYB60、MYB96、MYB101，其中只有MYB30和MYB60 是负调节子，其余都是正调节子。有关MYB转录因子家族参与ABA信号转导调控还 有着很大的研究空间。
随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的正负调节因子改 变植物对ABA信号的响应水平，控制植物种子的萌发以及植物生长以达到所需要的 状态，调控植物抗逆性，以及利用天然植物激素实现的选择性除草等成为研究前沿。
另外，植物对ABA信号的响应水平还与种子胎萌相关。种子胎萌是是指种子收 获前早萌现象，泛指种子收获前在田间母体植株上发芽的现象。水稻、小麦、油菜、 玉米等禾本科植物，收获时如遇雨和高温，种子收获前在田间母体植株上会出现提前 发芽的胎萌现象，胎萌消耗其部分营养和贮藏物质，致使种子食用品质、贮藏品质下 降，严重劣化了种子的品质、种用价值和耐贮性，将给农业生产造成较大的损失。种 子的胎萌现象取决于种子的休眠特性，而ABA是种子休眠的主导因素，对ABA反应 不敏感可导致种子胎萌的发生。
发明内容
本发明的目的是提供一种MYB28蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中 的应用。
本发明所提供的应用，具体为如下A或B：
A：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(MYB28蛋白)在如下a1) -a4)任一中的应用：
a1)调控植物对ABA耐受性；
a2)选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种；
a3)调控植物的胎萌抗性；
a4)选育胎萌抗性提高或降低的植物品种。
B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(MYB28蛋白)的编码基 因在如下a1)-a4)任一中的应用：
a1)调控植物对ABA耐受性；
a2)选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种；
a3)调控植物的胎萌抗性；
a4)选育胎萌抗性提高或降低的植物品种。
在本发明中，以上a1)中的所述调控植物对ABA耐受性均体现为：MYB28蛋白 的表达量越高，则所述植物对ABA的耐受性越弱；MYB28蛋白的表达量越低，则所 述植物对ABA的耐受性越强。以上a3)中的所述调控植物的胎萌抗性均体现为： MYB28蛋白的表达量越高，则所述植物的胎萌抗性越强；MYB28蛋白的表达量越低， 则所述植物的胎萌抗性越弱。
在本发明中，以上所有a2)中的所述选育对ABA耐受性降低的植物品种的方法， 以及所有a4)中的所述选育胎萌抗性提高的植物品种的方法，均具体可包括将所述 MYB28蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。以上所有a2)中的所述选 育对ABA耐受性提高的植物品种的方法，以及所有a4)中的所述选育胎萌抗性降低 的植物品种的方法，均具体可包括将所述MYB28蛋白表达量较低的植株作为亲本进 行杂交的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，可为如下(A)-(D)中任一种：
(A)培育对ABA耐受性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物 中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植 物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性降低；
(B)培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物 中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得 到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高；
(C)培育胎萌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导 入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物； 所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性提高；
(D)培育胎萌抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中对 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转 基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性降低。
在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的 编码基因(即MYB28基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第3至1103位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)序列表中序列1所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列1由1647个核苷酸组成，为所述MYB28基因在拟南芥基因组中序列， 其中第136-215位、第346-485位均为内含子序列；序列2由1427个核苷酸组成，为 所述MYB28基因的cDNA序列，其中第3-1103位为编码序列(ORF)；序列1和序列2 均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由366个氨基酸残基组成。
在所述(A)和所述(C)的方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的编码基因均是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述 受体植物中的。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农 杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、 pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺 苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体 时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启 动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、 胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外， 使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增 强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编 码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子 的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始 区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组 表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物 的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性 标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为 35S启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为将所述MYB28基因插入pCAMBIA-1300-221 载体的多克隆位点Xba I与Kpn I之间后得到的重组质粒。
在上述方法中，将携带有所述MYB28基因的所述重组表达载体导入所述受体植 物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注 射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织 培育成植株。
在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物(如十字花科植物)，也可为 单子叶植物。
在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为十字花科植物拟南芥， 更加具体为拟南芥野生型(Col-0生态型)。
本发明的又一个目的是提供一种对所述(B)中的所述转基因植物进行除草的方 法。
在本发明所提供的对所述(B)中的所述转基因植物(即所述对ABA耐受性提高 的转基因植物)进行除草的方法中，所用除草剂是浓度为M的ABA溶液；所述浓度 为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受。
在上述方法中，所述“所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受， 但对于所述转基因植物来说能耐受”是指：向所述待除杂草喷洒所述浓度为M的ABA 溶液后，所述待除杂草死亡；但向所述转基因植物喷洒所述浓度为M的ABA溶液后， 所述转基因植物不死亡，且生长状态与喷洒所述浓度为M的ABA溶液前相比无统计 学差异。
在本发明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质均 可替换为序列3所示蛋白质与标签蛋白所形成的融合蛋白，具体如在 pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点Xba I和Kpn I之间插入序列2的第3-1100位所 示DNA片段后所得重组质粒表达得到的融合蛋白。
本发明研究发现MYB28蛋白是ABA信号传导的核心正调节子。本发明可应用于 将植物激素ABA作为一种选择性除草剂，其选择性取决于植物对ABA的敏感性，利 用MYB28调节植物对ABA的耐受性，通过基因工程手段获得MYB28低表达、抗除 草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明亦可通过调节MYB28的表达水平控制植 物种子的萌发率，通过基因工程手段获得MYB28基因高表达、抗胎萌转基因作物。本 发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物耐受ABA的分子机制、改良遗传特性， 开拓绿色环保、无公害的除草方法，研究种子胎萌机制、提高种子食用品质和贮藏品 质等方面具有重要的实用价值和市场前景。
附图说明
图1为MYB28基因相关T-DNA插入突变体myb28-1的鉴定。测序比对结果，突 变体myb28-1插入在MYB28基因的起始密码子(ATG)前182bp(启动子区)位置。
图2为用实时荧光定量PCR检测各遗传材料MYB28基因表达量的分析结果。从 图中可以看出myb28-1为基因敲除突变体，OE1中MYB28mRNA表达量是野生型 (Col-0)的近两倍，OE2中MYB28mRNA表达量是野生型(Col-0)的近3.5倍。
图3为ABA对MYB28各遗传材料幼苗生长的影响分析结果。
图4为ABA对MYB28各遗传材料种子萌发的影响分析结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试 验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供(记载文献：Lijing Liu,Yiyue Zhang, Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltration  in Nicotiana benthamiana.The Plant Journal,2010(61):893-903.)。在 pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。 在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息： http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。
拟南芥野生型(Col-0生态型)：拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,ecotype  Columbia-0)，为拟南芥生物研究中心(ABRC)的产品。
MYB28基因敲除突变体myb28-1，为拟南芥生物研究中心(ABRC)的产品，编 号为SALK_136312C。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学 提供(记载文献：R.Berres,L.otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue by  different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell  Reports,1992(11):192-195.)。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a(DE3)感受态：为全式金生物有限公司产 品。
实施例1、MYB28转基因植物的获得及鉴定
本实施例中所涉及的MYB28基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南 芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由1647个核苷酸组成，其中第 136-215位和第346-485位为内含子序列；所述MYB28基因的cDNA序列如序列表中 序列2所示，序列2由1427个核苷酸组成，其中第3-1103位为编码序列(ORF)；序 列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由366个氨基酸残基组成。
一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB28的构建
提取拟南芥野生型(Col-0生态型)的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA 为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩 增得到约1100bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第3-1100 位核苷酸序列。
引物1：5’-CTAGTCTAGAATGTCAAGAAAGCCATG-3’(下划线部分为Xba I的 识别位点，其后的序列为序列2的第3-19位)；
引物2：5’-CGGGGTACCTATGAAATGCTTTTCAAG-3’(下划线部分为Kpn I的 识别位点，其后的序列为序列2的第1083-1100位的反向互补序列)。
用限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与 经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质 粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点Xba I和Kpn I之 间插入序列2的第3-1100位所示DNA片段的重组质粒命名为 pCAMBIA-1300-221-MYB28。在重组表达载体PCAMBIA-1300-221-MYB28中，启动 所述MYB28基因转录的启动子为35S启动子。
在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB28的构建过程中，也可以人工合成的 序列表的序列2所示的MYB28基因为模板。
二、MYB28基因敲除突变体鉴定
MYB28基因敲除突变体T-DNA插入突变体，将其命名为myb28-1，购买自拟南芥 生物研究中心(Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)， http://www.arabidopsis.org/)，背景为拟南芥野生型(Col-0生态型)。通过PCR技术鉴 定出纯合体。
PCR鉴定后的结果与TAIR网站(http://www.arabidopsis.org/)预测的插入位置一 致，myb28-1突变体中的T-DNA插入在MYB28基因起始密码子(ATG)前182bp(图 1)。
所用引物序列如下：
myb28-1LP：5’-TTTCATTATGCGTTTGCAG-3’(Left primer,LP)
myb28-1RP：5’-TTTCCACACCGTTTCAAC-3’(Right primer,RP)
LBb1.3：5’-TTGCCGATTTCGGAAC-3’(Left border primer,LB)
三、MYB28转基因拟南芥的获得及鉴定
1、MYB28转基因拟南芥及转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株的获得
将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-MYB28通过冻融法导入农杆 菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR 鉴定。将经鉴定表明含有MYB28基因(PCR目的条带大小为1100bp)的农杆菌GV3101 命名为GV3101/pCAMBIA-1300-221-MYB28；将转入pCAMBIA-1300-221空载体的 农杆菌GV3101命名为空-GFP/pCAMBIA-1300-221。
采用农杆菌花序侵染的方法(SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplified method for  Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998， 16(6):735-743.)将上述所得的重组农杆菌GV3101/pCAMBIA-1300-221-MYB28(或空 -GFP/pCAMBIA-1300-221)转化拟南芥野生型(Col-0生态型)。
转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素MS培养基上培养，收集具有 潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入 pCAMBIA-1300-221-MYB28的拟南芥植株和转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南 芥植株(T1代)。
2、MYB28转基因拟南芥鉴定
(1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数
根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的 方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植 株为单拷贝插入的株系(单拷贝MYB28转基因拟南芥)，从而用于纯合体的筛选。
(2)转基因拟南芥OE1、OE2纯合系的筛选
经上述鉴定分析后，随机选择其中二个单拷贝MYB28转基因拟南芥株系，分别记 为OE1和OE2(T1代)。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选， 以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系， 最终获得T3代转基因拟南芥OE1和OE2的纯合系植株，作为实验材料进行以下ABA 耐受性试验分析。
四、转基因拟南芥OE1和OE2纯合系及突变体myb28-1中MYB28基因表达量分 析
提取拟南芥野生型(Col-0生态型)与T-DNA插入突变体myb28-1，过表达植株 OE1和OE2的总RNA，利用实时荧光定量PCR检测材料中MYB28基因在转录水平 上表达情况。具体如下：
1、转录水平分析(RNA表达量)
以上述获得的转基因拟南芥OE1和OE2纯合系，T-DNA插入突变体myb28-1， 以及拟南芥野生型(Col-0生态型)平皿中生长12天的幼苗做为实验材料。提取各实 验材料的基因组RNA，分别通过实时荧光定量PCR方法分析MYB28基因在各实验材 料中的表达情况。其中，扩增MYB28基因的引物序列为：
MYB28RT-F1：5’-TCGGTCATAGCGAGACATTTAC-3’(序列2的第270-291位)；
MYB28RT-R1：5’-AGGAGGACGAGACAGAAAAGG-3’(序列2的第480-500位 的反向互补序列)。
以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Act in的引物序列为：
Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
上述引物的反应条件如下:
(1)反应体系的建立
实时荧光定量PCR反应体系

(2)三个重复，轻甩混匀，用BiO-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。
(3)反应程序的设定：
实时荧光定量PCR反应程序

(4)数值分析，以2-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各个基因的表达 进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引 物Ct值与Actin引物Ct值之差。
MYB28相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图2所示，MYB28基因的 表达均为相对值，以拟南芥野生型(Col-0)的MYB28基因的表达为1。从图中可以看 出，T-DNA插入突变体myb28-1中MYB28基因在转录水平上没有表达，为基因敲除 突变体；相比拟南芥野生型(Col-0)，步骤三获得的转基因拟南芥OE1中MYB28mRNA 表达量是野生型(Col-0)的近两倍，OE2中MYB28mRNA表达量是野生型(Col-0) 的近3.5倍。
实施例2、MYB28转基因植物对ABA耐受性分析试验
一、ABA对MYB28各遗传材料幼苗生长的影响
ABA能够抑制植物幼苗的生长。随着外源ABA浓度的升高，拟南芥野生型(Col-0 生态型)受到的抑制得到增强，其主根和叶片的生长都会受到不同程度的影响，实验 重复3次。
以拟南芥野生型(Col-0生态型)、MYB28基因敲除突变体myb28-1及实施例1得 到的单拷贝插入的T3代纯合体MYB28转基因株系OE1和OE2，以及实施例1得到的 转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子分别播 种在含有不同浓度ABA的MS培养基上(0μΜ、0.8μM和1.4μΜ)(每种实验材料播 种80-100粒)。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中，10天和12天分别观察拟南 芥幼苗生长的情况。
结果如图3所示，在含0μM ABA的培养基上，各种遗传材料的幼苗都能够正常 生长。在含0.8μM和1.4μΜABA的MS培养基上，myb28-1相对于拟南芥野生型(Col-0 生态型)，对ABA表现出明显脱敏的表型(对ABA的耐受性增强)；而MYB28转基 因株系OE1和OE2相对于野生型Col-0，对ABA均表现出明显超敏的表型(对ABA 的耐受性降低)。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株， 无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其幼 苗生长情况均与拟南芥野生型(Col-0生态型)基本一致，无统计学差异。综合以上实 验结果可见，MYB28基因敲除突变体myb28-1对ABA表现出较高的耐受性。
二、ABA对MYB28各遗传材料种子萌发的影响
ABA在促进种子休眠、抑制种子萌发中发挥重要调节作用。遗传学研究表明，种 子萌发过程中发生的染色质重建及组蛋白甲基化、去乙酰化等过程均受ABA调节。 随着外源ABA浓度的增加，拟南芥野生型(Col-0生态型)种子的萌发率会逐渐降低。 统计种子萌发实验是研究ABA信号转导的重要方法之一。实验重复3次。
以拟南芥野生型(Col-0生态型)、MYB28基因敲除突变体myb28-1及实施例1得 到的单拷贝插入的T3代纯合体MYB28转基因株系OE1和OE2，以及实施例1得到的 转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在 含有不同浓度ABA的MS培养基上(0μΜ，0.5μΜ，1μM和3μΜ)(每种实验材料播 种80-100粒)。4℃下低温层积3天后移入光照培养箱中。记录种子在层积后的24h到 84h之间的萌发数，每隔12h记录一次，并对结果进行统计。实验重复3次，结果取 平均值。
结果如图4所示，在含有0μM ABA的培养基上，各种实验材料种子的萌发情况 大体上基本一致，转基因株系OE1和OE2相对于野生型(Col-0生态型)略微慢一些。 在含有不同浓度ABA的培养基上，相同时间点下MYB28基因敲除突变体myb28-1相 对于拟南芥野生型(Col-0生态型)种子萌发速率更快，明显的表现出对ABA脱敏的 表型(对ABA的耐受性增强，对胎萌抗性减弱)；而实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体MYB28转基因株系OE1和OE2相同时间点下相对于拟南芥野生型(Col-0 生态型)种子萌发速率更慢，都明显的表现出ABA超敏的表型(对ABA的耐受性降 低，对胎萌抗性增强)。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对 照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基 上，其种子萌发情况均与拟南芥野生型(Col-0生态型)基本一致，无统计学差异。综 合以上结果可见，MYB28基因敲除突变体myb28-1对ABA表现出较高的耐受性，但 对胎萌抗性减弱；而转基因株系OE1和OE2对ABA表现出较低的耐受性，但对胎萌 抗性增强。另外，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA 的培养基上(0.5μΜ，1μM和3μΜABA)，相同时间点下转基因株系OE1和OE2相对 于野生型种子萌发速率均变慢，对ABA敏感，这正是农业生产所需要的，能够很好 的抑制种子过早萌发，抑制胎萌，减少胎萌所消耗营养和贮藏物质，使种子食用品质、 贮藏品质提升，使种子质量提高，给作物生产提高更大的经济利益。