一种获得三叶木通无菌苗的方法.pdf

本发明公开了一种获得三叶木通无菌苗的方法，该方法主要用三叶木通未成熟种子通过组织培养得到无菌苗，且先对果实进行灭菌处理，然后从灭菌处理过的果实中取出种子再次进行灭菌处理，将灭菌处理过的种子接种于培养基中，然后在组培室培养，培养基为MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA＋0.1g/L活性炭。采用本发明可大量获得三叶木通无菌苗，可克服外植体在得到无菌苗过程中染菌率大的问题，可大大缩短出苗时间，提高出苗率，并且节约成本和时间，提高了经济效益；所培育出的无菌苗可作为植物生物技术的材料。此外，本发明中采用种子做组培材料，具有材料多、繁殖快速的特点。

权利要求书1.  一种获得三叶木通无菌苗的方法，该方法包括材料选择、果实处理、种子消毒、接种及培养的步骤，其特征在于：先对果实进行灭菌处理，然后从灭菌处理过的果实中取出种子再次进行灭菌处理。 2.  根据权利要求1所述的获得三叶木通无菌苗的方法，其特征在于：采用8-9月份期间采摘的未成熟的果实作为种子来源材料。 3.  根据权利要求2所述的获得三叶木通无菌苗的方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 1）材料选择：摘取8-9月份期间未成熟的三叶木通果实； 2）果实处理：将摘回的果实冲洗干净，然后在超净工作台中用升汞和酒精对洗净的果实进行灭菌处理； 3）种子消毒：从灭菌好的果实里取出种子，用酒精和升汞对种子进行灭菌处理； 4）接种及培养：将灭菌处理过的种子接种于培养基中，然后在组培室培养。 4.  根据权利要求3所述的获得三叶木通无菌苗的方法，其特征在于：所述的种子在接种前先纵切成两半。 5.  根据权利要求3所述的获得三叶木通无菌苗的方法，其特征在于：所述培养基为MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 0.2mg/L＋0.1g/L活性炭培养基。 6.  根据权利要求3所述的获得三叶木通无菌苗的方法，其特征在于：组培室的培养温度为25±2℃，光照时间为12h，光照强度为1500lx。

说明书一种获得三叶木通无菌苗的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种获得三叶木通无菌苗的方法。
背景技术
三叶木通是木通科木通属木质藤本植物，其全株均可入药，具有清心泻火、理气止痛、疏肝益肾、通经散瘀、出烦利尿等功效。三叶木通原产于中国和日本，在中国主要分布于贵州、山东、河北、陕西、山西、江西等地区。它既是一种药源，又是一种果树资源。随着经济的发展、人们生活水平的提高，对绿色水果和具抗癌保健等功能水果的需求不断增加。三叶木通的果肉含丰富的营养物质，富含蛋白质、脂肪、淀粉及各种可溶性糖、钙、磷、铁、有机酸、维生素B1、B2、B6等。由于目前市场上的三叶木通多数为野生资源，人工种植较少，难以满足市场需求。无菌外植体的获得是植物组织培养的重要环节，可用于原生质体融合、细胞培养、离体快繁及植物转基因等方面。
三叶木通无菌的研究，目前主要集中在以腋芽、叶片、茎段为外植体，通过组织培养技术得到无菌苗的研究上。但这些方法存在染菌率高，成功率低，可重复性差，所需时间长的缺点。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术染菌率高、成功率低等问题，提供一种高效率的获得三叶木通无菌苗的方法。
本发明的技术方案如下：
本发明是这样一种获得三叶木通无菌苗的方法，它包括材料选择、果实处理、种子消毒、接种及培养的步骤，其中，本发明采用了先对果实进行灭菌处理，然后从灭菌处理过的果实中取出种子再次进行灭菌处理的方法，并且，本发明采用8-9月份期间采摘的未成熟的果实作为种子来源材料。
具体的，该方法包括以下步骤：
1）材料选择：摘取8-9月份期间未成熟的三叶木通果实；
2）果实处理：将摘回的果实冲洗干净，然后在超净工作台中用升汞和酒精对洗净的果实进行灭菌处理；
3）种子消毒：从灭菌好的果实里取出种子，用酒精和升汞对种子进行灭菌处理；
4）接种及培养：将灭菌处理过的种子接种于培养基中，然后在组培室培养。
进一步的，灭菌处理过的种子在接种前先纵切成两半然后再接种于培养基中。培养基为MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 0.2mg/L＋0.1g/L活性炭培养基。组培室的培养温度为25±2℃，光照时间为12h，光照强度为1500lx。
本发明在8-9月份采摘三叶木通未成熟果实，对其灭菌处理，剖开果肉后对种子进行灭菌处理，接种到培养基后将材料放置组培室培养，一个月左右便可出苗。其有益效果如下：本发明在灭菌种子前加了一道灭菌果实的操作，能更低地降低染菌率，使染菌率极低。再者在接种前先对种子进行纵切处理，可大幅提高三叶木通无菌苗的成苗速度、出苗率。与现有技术相比，本方法提供的获得三叶木通无菌苗的技术能短时间内获得大量的三叶木通无菌苗。
本发明用未成熟果实做组培的前期材料还具有以下几个优点：
1）未成熟果实的果肉完整，种子在果实里处于一种相对无菌的环境。如果材料选择的好，可直接在灭菌果实后将种子接种到培养基中。
2）每个三叶木通果实可有种子100-150粒，一次性获得的无菌苗量大，且一个月左右的样子便可以获得无菌苗。
3）未成熟果实在低温保湿条件下可较长时间储藏。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
1）材料选择：于8-9月份期间摘取未成熟三叶木通果实。挑取健康、完整、无病虫害的果实。
2）果实处理：果实带回实验室后用自来水冲洗干净。在超净工作台中用浓度为0.1％的升汞灭菌果实11min后，再用浓度为75％的酒精灭菌4min，用无菌水冲洗3次。
3）种子消毒：用已灭菌的水果刀切开果肉，用镊子取出种子。将取出的种子用浓度为75％的酒精灭菌20s，再用浓度为0.1％的升汞灭菌8min，然后用无菌水冲洗3次。
4）接种及培养：将灭菌好的种子用解剖刀纵切成两半，接种于培养基中，每个组培瓶接种5个种子，培养温度为25℃，光照时间为12h，光照强度1500lx。培养基为MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.20mg/L NAA＋0.1g/L活性炭。
实施例2：
1）材料选择：于8-9月份期间摘取未成熟三叶木通果实。挑取健康、完整、无病虫害的果实。
2）果实处理：果实带回实验室后用自来水冲洗干净。在超净工作台中用浓度为0.1％的升汞灭菌果实15min后，再用浓度为70％的酒精灭菌5min，用无菌水冲洗5次。
3）种子消毒：用已灭菌的水果刀切开果肉，用镊子取出种子。将取出的种子用浓度为70％的酒精灭菌25s，再用浓度为0.1％的升汞灭菌10min，然后用无菌水冲洗5次。
4）接种及培养：将灭菌好的种子用解剖刀纵切成两半，接种于培养基中，每个组培瓶接种5个种子，培养温度为27℃，光照时间为10h，光照强度1200lx。培养基为MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.25mg/L NAA＋0.1g/L活性炭。
实施例3：
1）材料选择：于8-9月份期间摘取未成熟三叶木通果实。挑取健康、完整、无病虫害的果实。
2）果实处理：果实带回实验室后用自来水冲洗干净。在超净工作台中用浓度为0.2％的升汞灭菌果实9min后，再用浓度为75％的酒精灭菌5min，用无菌水冲洗4次。
3）种子消毒：用已灭菌的水果刀切开果肉，用镊子取出种子。将取出的种子用浓度为75％的酒精灭菌18s，再用浓度为0.1％的升汞灭菌8min，然后用无菌水冲洗4次。
4）接种及培养：将灭菌好的种子用解剖刀纵切成两半，接种于培养基中，每个组培瓶接种5个种子，培养温度为23℃，光照时间为14h，光照强度1500lx。培养基为MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.15mg/L NAA＋0.1g/L活性炭。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明所保护的范围。