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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410655306.0(22)申请日 2014.11.17A01H 4/00(2006.01)(71)申请人 江苏省农业科学院地址 210014 江苏省南京市钟灵街 50 号(72)发明人 曾爱松 严继勇 宋立晓 高兵(74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任公司 32218代理人 傅婷婷 徐冬涛(54) 发明名称一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法(57) 摘要本发明公开了一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法。该方法包括(1)胚胎发生，(2)胚萌发和再生植株的获得步骤，其中(1)胚胎发生中将分离出的小孢。
2、子置于180.5培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生；将小胚状体转到 250.5、黑暗、5055rpm摇床上震荡培养，至子叶胚状体形成。应用此方法，可批量获得遗传上纯合的双单倍体植株材料，加速种质资源创新，缩短育种进程。本发明也可在结球甘蓝分子标记育种、突变体筛选及细胞全能性的模式体系等研究领域中推广应用。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图1页(10)申请公布号 CN 104429952 A(43)申请公布日 2015.03.25CN 104429952 A1/1 页21.一种培养结球甘蓝游离小孢子获得再生植株的。
3、方法，其特征在于包括以下步骤 ：(1) 胚胎发生1) 供体材料选取 ：选取健康结球甘蓝植株处于单核后期的花蕾为供体花蕾 ；2) 供体材料灭菌 ；3) 小孢子的分离、分装 ；4) 小孢子胚状体的诱导培养 ：将上一步分离出的小孢子置于 180.5培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生 ；5) 子叶胚形成 ：将小胚状体转到 250.5、黑暗、50 55rpm 摇床上震荡培养，至子叶胚状体形成 ；(2) 胚萌发和再生植株的获得1)胚萌发在6000lx光照14h/d、250.5条件下，将子叶胚转接在胚萌发固体培养基上于培养皿中进行培养，直至胚萌发 ；2)植株再生23周后，转入植株再生固体培养基上，于。
4、三角瓶中继续培养12周长成幼苗。2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的小孢子的分离、分装方法为 ：将灭菌后的花蕾放入无菌研钵中，加入小孢子提取培养基，用研棒轻轻挤压，使小孢子从花药中游离到溶液中，45m 孔径的尼龙筛网过滤，收集滤液，100g 离心 3 次，每次 3min ；最后 1次离心后，弃上清，将小孢子沉淀悬浮在胚状体诱导培养基中，调整小孢子密度为 1105个/mL，于每个无菌玻璃培养皿 (60mm) 中分装 2mL 悬浮液，并加入 100L 1的活性炭，Parafilm 封口。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的小孢子提取培养基配方为 ：B5+蔗糖130g/L+ 。
5、甘露醇 7g/L，pH5.8。4.根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于 ：所述的胚状体诱导培养基配方为 ：NLN+蔗糖 130g/L+ 阿拉伯半乳糖 12mg/L，pH6.0。5.根据权利要求 2 4 中任一项所述的方法，其特征在于 ：所述的小孢子胚状体的诱导培养步骤中将分装后的小孢子悬浮液置于 180.5培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生。6.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于 ：所述的胚萌发固体培养基配方为 ：B5+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 10g/L+6-BA 0.15mg/L，pH 5.8。7.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于 ：所述的植株再生固体培养基配方。
6、为 ：B5+蔗糖 20g/L+ 琼脂 7g/L，pH 5.8。8.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于供体材料灭菌方法为先用纯净水清洗花蕾，然后在超净工作台中用体积比 75酒精消毒 30s，之后用体积比 7的次氯酸钠溶液表面消毒 15min，再用无菌水冲洗 3 次，每次 5min。权 利 要 求 书CN 104429952 A1/6 页3一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法技术领域0001 本发明属于生物技术领域，涉及一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法。技术背景0002 结球甘蓝 (Brassica oleracea L.var.capitata L.) 简称甘蓝。
7、，在中国又称为包菜、圆白菜、洋白菜、卷心菜等，是十字花科芸薹属中最重要的蔬菜作物之一。甘蓝为异花授粉植物，杂种优势十分明显。但是，作为绿体春化植物，受条件的限制，一般一年只能自交繁殖一代，育成一个稳定的自交系至少需要 5 6 年的时间。游离小孢子培养是快速获得纯合双单倍体的最佳方法之一，对加快农作物的新品种选育，提高育种效率具有重要作用。此外，游离小孢子培养还可应用于遗传图谱构建、诱变、基因转化、突变体筛选等的研究。同时，小孢子胚胎诱导和发育作为一种研究细胞全能性及胚胎发育的模式体系也引起越来越多的关注。0003 在芸薹属植物中，30 35热激预处理被作为游离小孢子培养中诱导胚胎发生的一个先决。
8、条件。目前结球甘蓝游离小孢子培养使用的诱导胚胎发生的胁迫条件为 30 35热激 24 48h 后再置于 25培养，在此基本培养体系下，已有较多胚胎诱导成功的报道。但是，许多基因型胚胎发生率还是很低，尤其是一些农艺性状重要的基因型在小孢子胚胎形成时表现出顽抗性，限制了该技术在甘蓝育种中大规模应用。同时，相较于其他作物小孢子培养的植株再生率，结球甘蓝胚状体的植株再生较为困难。发明内容0004 本发明的目的在于针对现有结球甘蓝小孢子培养体系存在的胚胎发生率、植株再生频率低的问题，提供一种由结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的新方法。0005 本发明的目的可通过以下技术方案实现 ：0006 一种培养结。
9、球甘蓝游离小孢子获得再生植株的方法，包括以下步骤 ：0007 (1) 胚胎发生0008 1) 供体材料选取 ：选取健康结球甘蓝植株处于单核后期的花蕾为供体花蕾 ；0009 2) 供体材料灭菌 ；0010 3) 小孢子的分离、分装 ；0011 4) 小孢子胚状体的诱导培养 ：将上一步分离出的小孢子置于 180.5培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生 ；0012 5) 子叶胚形成 ：将小胚状体转到 250.5、黑暗、50 55rpm 摇床上震荡培养，至子叶胚状体形成 ；0013 (2) 胚萌发和再生植株的获得0014 1)胚萌发在6000lx光照14h/d、250.5条件下，将子叶胚转接在胚。
10、萌发固体培养基上于培养皿中进行培养，直至胚萌发 ；说 明 书CN 104429952 A2/6 页40015 2) 植株再生 2 3 周后，转入植株再生固体培养基上，于三角瓶中继续培养 12周长成幼苗。0016 所述的小孢子的分离、分装方法优选 ：将灭菌后的花蕾放入无菌研钵中，加入小孢子提取培养基，用研棒轻轻挤压，使小孢子从花药中游离到溶液中45m 孔径的尼龙筛网过滤，收集滤液，100g 离心 3 次，每次 3min ；最后 1 次离心后，弃上清，将小孢子沉淀悬浮在胚状体诱导培养基中，调整小孢子密度为 1105个 /mL，于每个无菌玻璃培养皿(60mm) 中分装 2mL 悬浮液，并加入 100。
11、L 1的活性炭，Parafilm 封口。0017 所述的小孢子提取培养基配方为 ：B5+ 蔗糖 130g/L+ 甘露醇 7g/L，pH5.8。0018 所述的胚状体诱导培养基配方为：NLN+蔗糖130g/L+阿拉伯半乳糖12mg/L，pH6.0。0019 所述的小孢子胚状体的诱导培养步骤中优选将上一步分装后的小孢子悬浮液置于 180.5培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生。0020 所述的胚萌发固体培养基配方为 ：B5+蔗糖20g/L+琼脂10g/L+6-BA 0.15mg/L，pH 5.8。0021 所述的植株再生固体培养基配方为 ：B5+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 7g/L，pH 5。
12、.8。0022 供体材料灭菌方法优选先用纯净水清洗花蕾，然后在超净工作台中用体积比 75酒精消毒 30s，之后用体积比 7的次氯酸钠溶液表面消毒 15min，再用无菌水冲洗 3 次，每次 5min。0023 有益效果0024 本研究以结球甘蓝为材料，建立了高效的游离小孢子培养胚胎发生与植株再生体系，为结球甘蓝育种、细胞、基因工程等的研究奠定了基础。本发明提供的一种高效获得结球甘蓝游离小孢子培养再生植株的新方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果 ：0025 (1) 本发明小孢子胚胎发生的诱导培养的条件为 180.5低温培养直至有肉眼可见的胚状体产生，该培养条件与32.50.5高温热激处理24。
13、h后置于250.5培养相比，不但获得了较高的胚胎发生率，而且胚状体的质量也得到很大改善 ( 图 1)。0026 (2) 本发明在胚胎发生中，不但观察到 32.50.5高温热激处理 24h，再置于250.5培养下的无胚柄的多细胞类胚结构 ( 图 4a)，也观察到与合子胚相似的具有胚柄的多细胞类胚结构 ( 图 4b)，该细胞学事件为体外合子胚的发育模式研究提供了技术平台。0027 (3)本发明在植株再生中使用B5-2固体培养基，比使用MS-2固体培养基植株再生率提高。0028 (4)本发明在游离、纯化小孢子的B5-13液体提取培养基添加7g/L甘露醇，降低小孢子培养中小孢子的死亡率，提高了结球甘蓝。
14、小孢子的胚胎发生。0029 (5) 本发明在悬浮培养小孢子的 NLN-13 液体培养基中添加 12mg/L 阿拉伯半乳糖蛋白，对小孢子胚状体诱导有明显的促进作用，特别是诱导了部分难出胚基因型的胚胎发生，这对于难出胚材料是一个较大的突破。0030 (6) 本发明在胚萌发的 B5-2 固体培养基中添加了 0.15mg/L 6-BA, 比不添加任何调节剂的植株再生率提高显著。附图说明说 明 书CN 104429952 A3/6 页50031 图 1(a)32.50.5高温热激处理 24h 再置于 250.5培养下获得的胚状体 ；(b)180.5低温培养下获得的胚状体 ；0032 图 2 胚状体萌发 。
15、；0033 图 3 植株再生 ；0034 图 4(a)32.50.5高温热激处理 24h 再置于 250.5培养中获得的无胚柄的多细胞类胚结构 ；(b)180.5低温培养中获得的具有胚柄的多细胞类胚结构。具体实施方案0035 本发明所提供的结球甘蓝游离小孢子培养和植株再生的方法，通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容不局限于此 ：0036 实施例 10037 (1) 胚胎发生0038 1) 供体材料选取选择生长健康的供体植株不同长度的花蕾，使用镊子挤出部分小孢子，醋酸洋红或 4，6- 联脒 -2- 苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI) 荧光染料染色后在显微镜下对其小孢子发育时期进行。
16、观察，选择小孢子处于单核后期的花蕾为供体花蕾。不同基因型最适培养时期对应的花蕾长度存在差异，但基本上在 3.5 4.5mm 范围内的花蕾中处于单核后期的小孢子比例最高。0039 2) 供体材料灭菌用纯净水清洗花蕾，然后在超净工作台中用体积比 75酒精消毒 30s，之后用体积比 7的次氯酸钠溶液表面消毒 15min，再用无菌水冲洗 3 次，每次5min。0040 3) 甘露醇处理对灭菌后的花蕾用添加 0(CK)、4、7、10、15gL-1甘露醇的 B5-13 液体提取培养基进行游离、纯化。与对照相比 , 随提取培养基中甘露醇浓度提高 , 各材料的平均出胚量随之提高 , 并在 7gL-1甘露醇处理。
17、时达到最高 ；之后 , 随甘露醇浓度继续提高 , 平均出胚量又显著下降。0041 4) 阿拉伯半乳糖处理将分离纯化后的小孢子用添加 0(CK)、612、0、30mg/L 阿拉伯半乳糖的 NLN-13 胚状体诱导培养基进行悬浮，观察小孢子出胚情况。结果表明，在NLN-13 培养基中加入一定浓度的阿拉伯半乳糖，对小孢子胚状体诱导有显著影响。当阿拉伯半乳糖达到 12mg/L 时，供试品种的小孢子胚状体诱导率最高。0042 5)小孢子的分离、分装将灭菌后的花蕾放入无菌研钵中，加入适量B5+蔗糖130g/L+ 甘露醇 7g/L，pH5.8 提取培养基，用研棒轻轻挤压，使小孢子从花药中游离到溶液中，45m。
18、 孔径的尼龙筛网过滤，收集滤液，100g 离心 3 次，每次 3min。最后 1 次离心后，弃上清，将小孢子沉淀悬浮在 NLN+ 蔗糖 130g/L+ 阿拉伯半乳糖 12mg/L，pH6.0 液体培养基中，调整小孢子密度为 1105个 /mL，于每个无菌玻璃培养皿 (60mm) 中分装 2mL 悬浮液，并加入 100L1的活性炭，Parafilm 封口。0043 6)诱导培养条件处理将上述培养皿分别置于32.50.5高温热激处理24h再置于 250.5培养 ；180.5培养箱中暗培养，直至有肉眼可见的胚状体产生。结果表明，180.5培养条件与 32.50.5高温热激处理 24h 再置于 250。
19、.5培养相比，不但获得了较高的胚胎发生率，而且胚状体的质量也得到很大改善。0044 7) 子叶胚形成将小胚状体转到 250.5、黑暗、50-55rpm 摇床上震荡培养，至子说 明 书CN 104429952 A4/6 页6叶胚状体形成 ( 图 1)。0045 (2) 胚萌发和再生植株的获得0046 1) 胚萌发 B5-2 固体培养基中 6-BA 处理设置添加 0(CK)、0.15mg/L、0.3mg/L 6-BA的B5-2固体培养基进行胚萌发实验，结果表明 ：添加0.15mg/L 6-BA促进了胚萌发，并且降低了胚褐化、玻璃化的现象。0047 2) 植株再生培养基处理胚萌发后，分别将其置于 B。
20、5-2( 琼脂 7 )、MS-2( 琼脂7 ) 固体培养基中培养，结果表明 ：B5-2 培养基显著提高了植株再生频率。0048 3) 胚萌发在 6000lx 光照 14hd-1、250.5条件下，将子叶胚转接在 B5+ 蔗糖20g/L+ 琼脂 10g/L+6-BA 0.15mg/L,pH 5.8 固体培养基上于培养皿中进行培养，直至胚萌发(图2)。0049 4) 植株再生 2 3 周后，转入 B5+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 7g/L,pH 5.8 的固体培养基上，于三角瓶中继续培养 1 2 周长成幼苗 ( 图 3)。0050 综上所述，在对花蕾进行消毒后最好使用 B5+ 蔗糖 130g/L+。
21、 甘露醇 7g/L，pH5.8的液体提取培养基游离、纯化小孢子，然后悬浮在 NLN+ 蔗糖 130g/L+ 阿拉伯半乳糖 12mg/L，pH6.0 的液体胚状体诱导培养基中，于 180.5暗培养 ；现肉眼可见的胚状体后，将其转到 250.5、50 55rpm 摇床上震荡培养 ；胚萌发培养基配方为 B5+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 10g/L+6-BA 0.15mg/L,pH 5.8，植株再生培养基配方为 ：B5+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 7g/L,pH 5.8。0051 附 ：培养基配方0052 说 明 书CN 104429952 A5/6 页70053 说 明 书CN 104429952 A6/6 页8说 明 书CN 104429952 A1/1 页9图1图2 图3图4说 明 书 附 图CN 104429952 A。