一种牛角瓜组织培养的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410729059.4	申请日：	2014.12.04
公开号：	CN104488710A	公开日：	2015.04.08
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20141204\|\|\|公开
IPC分类号：	A01H4/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	浙江省农业科学院
发明人：	陈志; 吕永平; 汪一婷; 牟豪杰; 周迪江; 陈剑平
地址：	310021浙江省杭州市石桥路198号
优先权：
专利代理机构：	杭州九洲专利事务所有限公司33101	代理人：	陈继亮
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内容摘要

本发明涉及一种牛角瓜组织培养的方法，属植物组织培养领域，包括如下步骤：培养基配制、外植体选取与消毒、种子萌发、不定芽诱导及增殖、生根诱导、组培苗驯化及移栽。基本培养基为MS培养基，蔗糖25～30g/L，琼脂粉8～9g/L，PVP 0.1～0.5g/L，培养基pH为5.6～5.8；种子萌发培养基为MS或1/2MS；不定芽诱导培养基为MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；生根培养基为MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP0.1～0.5g/L或1/2MS+IBA0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L。培养条件为25±2℃，12～16h/d，40～60μ·mol·m-2·s-1。本发明的优点：建立的牛角瓜组培快繁技术体系种苗繁殖速度快，健壮均匀，变异少，移栽成活率高，适合优良牛角瓜品种种苗规模化生产。

权利要求书

权利要求书1. 一种牛角瓜组织培养的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)、外植体的选取及处理：选取牛角瓜种子作为起始材料，从牛角瓜果实中将种子取出，去除种子表面纤维之后经过浸种2h后，选择沉在容器底部的种子作为组培用外植体；2)、种子萌发：在超净工作台上，将经过表面消毒的牛角瓜种子转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于种子萌发培养基MS或1/2MS培养基中进行种子萌发，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1；3)不定芽诱导：在无菌工作台上，由种子萌发获得的无菌苗从腋芽下方每两个芽为一个单位切段，带芽茎段接种于不定芽诱导培养基进行不定芽的诱导，不定芽诱导培养基为MS+6-BA 3.0～5.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L中，进行不定芽的诱导，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1；4)不定芽增殖：在无菌工作台上，将诱导获得的1～2cm高的丛生不定芽从基部以2～3个连在一起的不定芽为一个接种单元分离，将分离材料接种于不定芽增殖培养基中增殖，不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0～3.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1；5)、不定芽生根诱导：将高生长到3～4cm的丛生不定芽从基部单个分离，接入生根培养基中进行不定根的诱导,生根培养基为MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L或1/2MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1；6)、组培苗驯化及移栽：丛生不定芽基部长出4～6条2～3cm的不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养3～5d后再打开瓶盖培养1～2d，将牛角瓜组培苗小心从培养瓶中连根取出，用自来水洗净组培苗表面的培养基,然后在通风阴凉处稍晾干组培苗表面水分后将牛角瓜组培苗，栽入基质中，保湿90％以上培养15d，然后在温室中正常培养；种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为25～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，PVP用量为0.1～0.5g/L，培养基pH分装前调整为5.6～5.8；种子萌发培养基为MS或1/2MS培养基；不定芽诱导培养基为MS+6-BA 3.0～5.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0～3.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；生根培养基为MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L或1/2MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根培养条件为，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1。2. 根据权利要求1所述的牛角瓜组织培养的方法，其特征在于：起始外植体的选择及处理、种子萌发、不定芽诱导、不定芽增殖、生根诱导、移栽前驯化过程及移栽后保湿90％以上培养15d。

说明书

说明书一种牛角瓜组织培养的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术，具体涉及一种牛角瓜组织培养的方法。
背景技术
牛角瓜(Calotropis gigantea(Linn.)Dry.ex Ait.f)，别名断肠草、羊浸树、哮喘树、皇冠花等，为萝藦科牛角瓜属多年生草本植物，在亚洲、美洲、非洲均有分布，我国主要分布于两广、海南、福建、云南、四川等省区。牛角瓜耐旱、耐贫瘠能力强，常生于干旱或半干旱的旷野地，可作为干旱地带荒地、贫瘠地绿化先锋植物，而且生长迅速，每周生长最快约30厘米，植株可高达3m，可起到防风、保土、保水的功效，可作为贫瘠土地改良的先锋植物。
牛角瓜全身是宝，具有多种利用价值及广阔的市场前景。牛角瓜整个植株无论老嫩均可用作肥料；牛角瓜纤维可用于生产中高档针织产品、纸张及人造棉等，种毛可供制作丝绒原料，在纺织领域具有广阔的应用前景；牛角瓜的乳液中含有大量的碳氢化合物及某些烃类物质，与天然原油成分相近，1公顷的牛角瓜可提炼出一万多升的原油，也可用于提取生物农药制剂，乳液干燥后可供作黄色染料、树胶原料及鞣料等；此外牛角瓜还具有多种药用价值，其干叶具袪痰、止咳等功效；乳汁具抗炎、抗凝血、强心及驱虫等作用，树皮亦可用于治疗癞癣。
目前，牛角瓜栽培常用种子进行繁殖,但种子数量有限，同时由于生长环境限制，自然状态下，种子萌发率较低，无法同时获得大量优质种苗。植物组织培养是目前最有效的植物种苗快速繁殖的方法，目前关于牛角瓜组织培养研究报道国内仅见李克烈等1篇，其主要是利用无菌萌发苗叶片为起始材料，通过先诱导愈伤再诱导愈伤分化的方式获得牛角瓜再生植株；国外仅见Ashis T.Roy等利用子叶、幼嫩叶片和茎段为起始材料，诱导出愈伤之后利用液体悬浮培养技术对愈伤进行扩繁，然后对扩繁愈伤进行分化诱导从而获得牛角瓜再生植株的研究报道。在植物组培过程中，通过愈伤途径获得再生植株后代变异较高，后代品质差异较大，相对于通过诱导愈伤获得的植株再生途径，利用直接器官发生途径获得再生植株可极大降低组培过程中导致的变异发生，但是关于牛角瓜通过直接器官发生获得再生植株尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种牛角瓜组织培养的方法。本发明拟解牛角瓜利用种子无菌萌发获得的无菌材料，通过直接诱导不定芽途径建立良好的牛角瓜组培再生体系，为牛角瓜优良种植扩繁、新品种培育及遗传改良等做好技术支持。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种牛角瓜组织培养的方法，该方法包括如下步骤：
1)、外植体的选取及处理：选取牛角瓜种子作为起始材料，从牛角瓜果实中将种子取出，去除种子表面纤维之后经过浸种2h后，选择沉在容器底部的种子作为组培用外植体；
2)、种子萌发：在超净工作台上，将经过表面消毒的牛角瓜种子转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于种子萌发培养基MS或1/2MS培养基中进行种子萌发，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1；
3)不定芽诱导：在无菌工作台上，由种子萌发获得的无菌苗从腋芽下方每两个芽为一个单位切段，带芽茎段接种于不定芽诱导培养基进行不定芽的诱导，不定芽诱导培养基为MS+6-BA 3.0～5.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L中，进行不定芽的诱导，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1；
4)不定芽增殖：在无菌工作台上，将诱导获得的1～2cm高的丛生不定芽从基部以2～3个连在一起的不定芽为一个接种单元分离，将分离材料接种于不定芽增殖培养基中增殖，不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0～3.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1；
5)、不定芽生根诱导：将高生长到3～4cm的丛生不定芽从基部单个分离，接入生根培养基中进行不定根的诱导,生根培养基为MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L或1/2MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1；
6)、组培苗驯化及移栽：丛生不定芽基部长出4～6条2～3cm的不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养3～5d后再打开瓶盖培养1～2d，将牛角瓜组培苗小心从培养瓶中连根取出，用自来水洗净组培苗表面的培养基,然后在通风阴凉处稍晾干组培苗表面水分后将牛角瓜组培苗，栽入基质中，保湿90％以上培养15d，然后在温室中正常培养；
种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为25～40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，PVP用量为0.1～0.5g/L，培养基pH分装前调整为5.6～5.8；种子萌发培养基为MS或1/2MS培养基；不定芽诱导培养基为MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；生根培养基为MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L或1/2MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根培养条件为，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1。
起始外植体的选择及处理、种子萌发、不定芽诱导、不定芽增殖、生根诱导、移栽前驯化过程及移栽后保湿90％以上培养15d。
本发明的有益效果为：
1、通过组织培养技术进行牛角瓜种苗快繁，生产不受地区、季节、气候及母株生长年限的限制，便于工厂化育苗，可根据订单进行生产，生产时间及规模可控，为牛角瓜的推广应用提供充足的优质种苗保障。
2、繁殖系数达到3.0～3.5，生根率100％，移栽成活率100％，达到种苗工厂化育苗生产的要求。
3、本发明采用牛角瓜腋芽直接诱导不定芽的增殖方式，无愈组织伤诱导及愈伤分化诱导环节，可极大减少植物组培过程中后代变异的发生，种苗可最大限度保持母本的优良性状。
4、有利于牛角瓜优良单株、新品种组培快繁体系建立借鉴、推广。
5、建立良好的组培快繁体系，为今后利用植物生物技术对牛角瓜进行新品种培育、遗传改良等研究工作奠定基础。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
这种牛角瓜组织培养的方法，该方法包括如下步骤：
1、培养基及培养条件：种子萌发、不定芽诱导、不定芽增殖增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为25～30g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为8～9g/L，PVP用量为0.1～0.5g/L，培养基pH分装前调整为5.6～5.8；种子萌发培养基为MS或1/2MS培养基；不定芽诱导培养基为MS+6-BA 3.0～5.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0～3.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；生根培养基为MS+IBA 0～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L或1/2MS+IBA 0～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根培养条件为,培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1。
2、外植体的处理与消毒：选取牛角瓜种子作为起始材料，将收集到的去掉种毛的牛角瓜种子经过温水浸种2h后，选择沉积在容器底部的种子作为外植体，挑选好的外植体用洗洁精溶液清洗20min，期间不断轻轻搅拌，然后流水冲洗经干净种子表面残留的洗洁精清洗溶液，在已经过消毒的超净工作台上将清洗干净的牛角瓜种子转移至无菌锥形瓶中，用70～75％酒精浸泡60s，期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附着在牛角瓜种子表面气泡，倒出75％酒精，再用0.1％HgCl2溶液浸泡种子6～10min，或用有效氯浓度为1％NaClO溶液浸泡种子20～30min，浸泡期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附着在牛角瓜种子表面气泡，倒出0.1％HgCl2溶液或1％ NaClO溶液，用无菌水清洗经过表面消毒处理的种子4～5次，处理后的种子用少量无菌水浸泡、备用。
3、种子萌发：在超净工作台上，将经过表面消毒的牛角瓜种子转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于种子萌发培养基MS或1/2MS培养基中进行种子萌发，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1。
4、不定芽诱导：将种子萌获得的2～3cm高的无菌苗在无菌工作台上以每个腋(顶)芽为1个单位，切成1cm左右的小段，接种到不定芽诱导培养基MS+6-BA 3.0～5.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L中，进行不定芽的诱导，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1。
5、不定芽增殖：在无菌工作台上，将诱导获得的簇生、1～2cm高的不定芽从基部以2～3个连体不定芽为接种单位进行分离，接种于不定芽增殖培养基中增殖，不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0～3.0mg/L+NAA 0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1。
6、不定芽生根诱导：在无菌工作台上，将高生长到3～4cm的丛生不定芽从基部切开成单个，接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP0.1～0.5g/L或1/2MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L，培养温度25±2℃，光照时间为12～16h/d，光照强度为40～60μ·mol·m-2·s-1。
7、组培苗驯化及移栽：不定芽基部长出4～6条2～3cm的不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养5d后打开瓶盖，再培养1～2d，将牛角瓜生根植株小心从培养瓶中取出，用自来水洗净组培苗表面的培养基，将牛角瓜组培苗，栽入基质中，保湿90％以上培养15d，然后在温室中正常培养。

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410729059.4(22)申请日 2014.12.04A01H 4/00(2006.01)(71)申请人浙江省农业科学院地址 310021 浙江省杭州市石桥路 198 号(72)发明人陈志吕永平汪一婷牟豪杰周迪江陈剑平(74)专利代理机构杭州九洲专利事务所有限公司 33101代理人陈继亮(54) 发明名称一种牛角瓜组织培养的方法(57) 摘要本发明涉及一种牛角瓜组织培养的方法，属植物组织培养领域，包括如下步骤：培养基配制、外植体选取与消毒、种子萌发、不定芽诱导及增殖、生根诱导、组培苗驯化及移栽。基本培养基为 M。

2、S 培养基，蔗糖 25 30g/L，琼脂粉 8 9g/L，PVP 0.1 0.5g/L，培养基 pH 为 5.6 5.8 ；种子萌发培养基为 MS 或 1/2MS ；不定芽诱导培养基为 MS+6-BA3.0 5.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0 3.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；生根培养基为 MS+IBA 0.01 0.5mg/L+PVP0.1 0.5g/L 或 1/2MS+IBA0.01 0.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L。培养条件。

3、为252，12 16h/d，40 60molm-2s-1。本发明的优点：建立的牛角瓜组培快繁技术体系种苗繁殖速度快，健壮均匀，变异少，移栽成活率高，适合优良牛角瓜品种种苗规模化生产。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页(10)申请公布号 CN 104488710 A(43)申请公布日 2015.04.08CN 104488710 A1/1 页21.一种牛角瓜组织培养的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)、外植体的选取及处理：选取牛角瓜种子作为起始材料，从牛角瓜果实中将种子取出，去除种子表面纤维之后经过浸种 2h。

4、后，选择沉在容器底部的种子作为组培用外植体；2)、种子萌发：在超净工作台上，将经过表面消毒的牛角瓜种子转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于种子萌发培养基MS或1/2MS培养基中进行种子萌发，培养温度 252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1；3) 不定芽诱导：在无菌工作台上，由种子萌发获得的无菌苗从腋芽下方每两个芽为一个单位切段，带芽茎段接种于不定芽诱导培养基进行不定芽的诱导，不定芽诱导培养基为MS+6-BA 3.0 5.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L 中，进行不定芽的诱导，培养温度。

5、252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1；4)不定芽增殖：在无菌工作台上，将诱导获得的12cm高的丛生不定芽从基部以23 个连在一起的不定芽为一个接种单元分离，将分离材料接种于不定芽增殖培养基中增殖，不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.03.0mg/L+NAA 0.050.2mg/L+PVP 0.10.5g/L，培养温度 252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1；5)、不定芽生根诱导：将高生长到 3 4cm 的丛生不定芽从基部单个分离，接入生根培养基中进行不定根的诱导 , 生根培养基为 MS+IBA 0.01 0。

6、.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L 或1/2MS+IBA 0.01 0.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L，培养温度 252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1；6)、组培苗驯化及移栽：丛生不定芽基部长出 4 6 条 2 3cm 的不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养 3 5d 后再打开瓶盖培养 1 2d，将牛角瓜组培苗小心从培养瓶中连根取出，用自来水洗净组培苗表面的培养基 , 然后在通风阴凉处稍晾干组培苗表面水分后将牛角瓜组培苗，栽入基质中，保湿 90以上培养 15d，然后在温室中正常培养；种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本。

7、培养基均为 MS 培养基，蔗糖用量为2540g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为89g/L，PVP用量为0.10.5g/L，培养基pH分装前调整为5.65.8 ；种子萌发培养基为MS或1/2MS培养基；不定芽诱导培养基为MS+6-BA 3.0 5.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；不定芽增殖培养基为 MS+6-BA 1.0 3.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；生根培养基为 MS+IBA 0.01 0.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L 或 1/2MS+IBA 0.01 0.5mg/L+PVP 0.1 0。

8、.5g/L ；种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根培养条件为，培养温度252，光照时间为1216h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1。2.根据权利要求 1 所述的牛角瓜组织培养的方法，其特征在于：起始外植体的选择及处理、种子萌发、不定芽诱导、不定芽增殖、生根诱导、移栽前驯化过程及移栽后保湿 90以上培养 15d。权利要求书CN 104488710 A1/4 页3一种牛角瓜组织培养的方法技术领域0001 本发明涉及植物组织培养技术，具体涉及一种牛角瓜组织培养的方法。背景技术0002 牛角瓜 (Calotropis gigantea(Linn.)Dry.ex Ait.f)，。

9、别名断肠草、羊浸树、哮喘树、皇冠花等，为萝藦科牛角瓜属多年生草本植物，在亚洲、美洲、非洲均有分布，我国主要分布于两广、海南、福建、云南、四川等省区。牛角瓜耐旱、耐贫瘠能力强，常生于干旱或半干旱的旷野地，可作为干旱地带荒地、贫瘠地绿化先锋植物，而且生长迅速，每周生长最快约30 厘米，植株可高达 3m，可起到防风、保土、保水的功效，可作为贫瘠土地改良的先锋植物。0003 牛角瓜全身是宝，具有多种利用价值及广阔的市场前景。牛角瓜整个植株无论老嫩均可用作肥料；牛角瓜纤维可用于生产中高档针织产品、纸张及人造棉等，种毛可供制作丝绒原料，在纺织领域具有广阔的应用前景；牛角瓜的乳液中含有大量的碳氢化合物及。

10、某些烃类物质，与天然原油成分相近，1 公顷的牛角瓜可提炼出一万多升的原油，也可用于提取生物农药制剂，乳液干燥后可供作黄色染料、树胶原料及鞣料等；此外牛角瓜还具有多种药用价值，其干叶具袪痰、止咳等功效；乳汁具抗炎、抗凝血、强心及驱虫等作用，树皮亦可用于治疗癞癣。0004 目前，牛角瓜栽培常用种子进行繁殖 , 但种子数量有限，同时由于生长环境限制，自然状态下，种子萌发率较低，无法同时获得大量优质种苗。植物组织培养是目前最有效的植物种苗快速繁殖的方法，目前关于牛角瓜组织培养研究报道国内仅见李克烈等 1 篇，其主要是利用无菌萌发苗叶片为起始材料，通过先诱导愈伤再诱导愈伤分化的方式获得牛角瓜再生植株。

11、；国外仅见 Ashis T.Roy 等利用子叶、幼嫩叶片和茎段为起始材料，诱导出愈伤之后利用液体悬浮培养技术对愈伤进行扩繁，然后对扩繁愈伤进行分化诱导从而获得牛角瓜再生植株的研究报道。在植物组培过程中，通过愈伤途径获得再生植株后代变异较高，后代品质差异较大，相对于通过诱导愈伤获得的植株再生途径，利用直接器官发生途径获得再生植株可极大降低组培过程中导致的变异发生，但是关于牛角瓜通过直接器官发生获得再生植株尚未见报道。发明内容0005 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种牛角瓜组织培养的方法。本发明拟解牛角瓜利用种子无菌萌发获得的无菌材料，通过直接诱导不定芽途径建立良好的牛角瓜组培。

12、再生体系，为牛角瓜优良种植扩繁、新品种培育及遗传改良等做好技术支持。0006 本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种牛角瓜组织培养的方法，该方法包括如下步骤：0007 1)、外植体的选取及处理：选取牛角瓜种子作为起始材料，从牛角瓜果实中将种子取出，去除种子表面纤维之后经过浸种 2h 后，选择沉在容器底部的种子作为组培用外植说明书CN 104488710 A2/4 页4体；0008 2)、种子萌发：在超净工作台上，将经过表面消毒的牛角瓜种子转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸去外植体表面水分，接种于种子萌发培养基 MS 或 1/2MS 培养基中进行种子萌发，培养温度 252，光照时间。

13、为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1；0009 3) 不定芽诱导：在无菌工作台上，由种子萌发获得的无菌苗从腋芽下方每两个芽为一个单位切段，带芽茎段接种于不定芽诱导培养基进行不定芽的诱导，不定芽诱导培养基为 MS+6-BA 3.0 5.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L 中，进行不定芽的诱导，培养温度 252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1；0010 4) 不定芽增殖：在无菌工作台上，将诱导获得的 1 2cm 高的丛生不定芽从基部以 2 3 个连在一起的不定芽为一个接种单元分离，将分离材。

14、料接种于不定芽增殖培养基中增殖，不定芽增殖培养基为 MS+6-BA 1.0 3.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L，培养温度 252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1；0011 5)、不定芽生根诱导：将高生长到 3 4cm 的丛生不定芽从基部单个分离，接入生根培养基中进行不定根的诱导 , 生根培养基为 MS+IBA 0.01 0.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L 或 1/2MS+IBA 0.01 0.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L，培养温度 252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 。

15、60molm-2s-1；0012 6)、组培苗驯化及移栽：丛生不定芽基部长出 4 6 条 2 3cm 的不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养 3 5d 后再打开瓶盖培养 1 2d，将牛角瓜组培苗小心从培养瓶中连根取出，用自来水洗净组培苗表面的培养基 , 然后在通风阴凉处稍晾干组培苗表面水分后将牛角瓜组培苗，栽入基质中，保湿 90以上培养 15d，然后在温室中正常培养；0013 种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为 MS 培养基，蔗糖用量为 25 40g/L，凝固剂为琼脂粉，用量为 8 9g/L，PVP 用量为 0.1 0.5g/L，培养基pH 分装前调整为 5.6 5。

16、.8 ；种子萌发培养基为 MS 或 1/2MS 培养基；不定芽诱导培养基为 MS+6-BA3.0 5.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0 3.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；生根培养基为 MS+IBA 0.01 0.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L 或 1/2MS+IBA 0.01 0.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定芽生根培养条件为，培养温度 252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-。

17、2s-1。0014 起始外植体的选择及处理、种子萌发、不定芽诱导、不定芽增殖、生根诱导、移栽前驯化过程及移栽后保湿 90以上培养 15d。0015 本发明的有益效果为：0016 1、通过组织培养技术进行牛角瓜种苗快繁，生产不受地区、季节、气候及母株生长年限的限制，便于工厂化育苗，可根据订单进行生产，生产时间及规模可控，为牛角瓜的推广应用提供充足的优质种苗保障。0017 2、繁殖系数达到 3.0 3.5，生根率 100，移栽成活率 100，达到种苗工厂化育苗生产的要求。0018 3、本发明采用牛角瓜腋芽直接诱导不定芽的增殖方式，无愈组织伤诱导及愈伤分化诱导环节，可极大减少植物组培过程中后代变异。

18、的发生，种苗可最大限度保持母本的优良性状。说明书CN 104488710 A3/4 页50019 4、有利于牛角瓜优良单株、新品种组培快繁体系建立借鉴、推广。0020 5、建立良好的组培快繁体系，为今后利用植物生物技术对牛角瓜进行新品种培育、遗传改良等研究工作奠定基础。具体实施方式0021 下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。0022 这种牛角瓜组织培养的方法，该方法包括如下步骤：0023 1、培养基及培养条件：种子萌发、不定芽诱导、不定芽增殖增殖、不定芽生根诱导基本培养基均为MS培养基，蔗糖用量为2530g/L，凝。

19、固剂为琼脂粉，用量为89g/L，PVP用量为 0.1 0.5g/L，培养基 pH 分装前调整为 5.6 5.8 ；种子萌发培养基为 MS 或 1/2MS培养基；不定芽诱导培养基为 MS+6-BA 3.0 5.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；不定芽增殖培养基为 MS+6-BA 1.0 3.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；生根培养基为 MS+IBA 0 0.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L 或 1/2MS+IBA 0 0.5mg/L+PVP 0.1 0.5g/L ；种子萌发、不定芽诱导及增殖、不定。

20、芽生根培养条件为 , 培养温度252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1。0024 2、外植体的处理与消毒：选取牛角瓜种子作为起始材料，将收集到的去掉种毛的牛角瓜种子经过温水浸种 2h 后，选择沉积在容器底部的种子作为外植体，挑选好的外植体用洗洁精溶液清洗 20min，期间不断轻轻搅拌，然后流水冲洗经干净种子表面残留的洗洁精清洗溶液，在已经过消毒的超净工作台上将清洗干净的牛角瓜种子转移至无菌锥形瓶中，用7075酒精浸泡60s，期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附着在牛角瓜种子表面气泡，倒出75酒精，再用0.1HgCl2溶液浸泡种子610min，或用有效氯浓度为1。

21、NaClO溶液浸泡种子 20 30min，浸泡期间不断轻轻晃动锥形瓶，去除附着在牛角瓜种子表面气泡，倒出 0.1 HgCl2溶液或 1 NaClO 溶液，用无菌水清洗经过表面消毒处理的种子 4 5 次，处理后的种子用少量无菌水浸泡、备用。0025 3、种子萌发：在超净工作台上，将经过表面消毒的牛角瓜种子转移至无菌接种盘中，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于种子萌发培养基 MS 或 1/2MS 培养基中进行种子萌发，培养温度 252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1。0026 4、不定芽诱导：将种子萌获得的23cm高的无菌苗在无菌工作台上以每个腋 ( 顶。

22、) 芽为 1 个单位，切成 1cm 左右的小段，接种到不定芽诱导培养基 MS+6-BA 3.0 5.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L 中，进行不定芽的诱导，培养温度252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1。0027 5、不定芽增殖：在无菌工作台上，将诱导获得的簇生、1 2cm 高的不定芽从基部以 2 3 个连体不定芽为接种单位进行分离，接种于不定芽增殖培养基中增殖，不定芽增殖培养基为 MS+6-BA 1.0 3.0mg/L+NAA 0.05 0.2mg/L+PVP 0.1 0.5g/L，培养温。

23、度252，光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1。0028 6、不定芽生根诱导：在无菌工作台上，将高生长到 3 4cm 的丛生不定芽从基部切开成单个，接入生根培养基中进行不定根的诱导，生根培养基为 MS+IBA 0.01 0.5mg/L+PVP0.10.5g/L或1/2MS+IBA 0.010.5mg/L+PVP 0.10.5g/L，培养温度252，说明书CN 104488710 A4/4 页6光照时间为 12 16h/d，光照强度为 40 60molm-2s-1。0029 7、组培苗驯化及移栽：不定芽基部长出 4 6 条 2 3cm 的不定根后，将生根苗移至温室，散射光培养 5d 后打开瓶盖，再培养 1 2d，将牛角瓜生根植株小心从培养瓶中取出，用自来水洗净组培苗表面的培养基，将牛角瓜组培苗，栽入基质中，保湿 90以上培养15d，然后在温室中正常培养。说明书CN 104488710 A。

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