防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基及组织培养方法.pdf

一种防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基及其组织培养方法，其步骤是：无菌试管苗建立：选取当年生半木质化枝条，剪成一芽一段的芽段；经过消毒后，把芽段接种到芽启动培养基即MS+ BA0.3～1.5mg/L+IBA0.05～0.2+蔗糖3%+琼脂粉0.6%mg/L的试管内；试管苗增殖：把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS即MS3+BA0.1～1.0mg/L+IBA0.01～0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；试管苗生根：把试管苗接种到生根培养基即1/4MS+IBA0.5～2.0mg/L+蔗糖20～30g/L+琼脂粉0.6%上，在添加激素BA和IBA的作用下，特别使用了改良MS即MS3，满足了云南野樱桃试管苗增殖生长的需要，不再使用常规的MS培养基或QL培养基，因此防止了云南野樱桃试管苗出现黄化现象。

权利要求书1.  一种防止云南野樱桃试管苗黄化的组织培养方法；其特征是：其步骤是： 无菌试管苗建立：选取当年生半木质化枝条，剪成一芽一段的芽段；经过杀菌消毒后，把芽段接种到芽启动培养基即MS + BA 0.3～1.5 mg/L + IBA 0.05～0.2mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6% 的试管内；试管苗增殖：把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS： MS3+ BA 0.1～1.0 mg/L + IBA 0.01～0.1 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；试管苗生根：把试管苗接种到生根培养基即1/4MS + IBA 0.5～2.0 mg/L + 蔗糖20～30 g/L上。 2.  、根据权利要求1所述的基于云南野樱桃试管苗黄化的野樱桃组织培养方法；其特征是：其步骤是： a、无菌试管苗建立：从生长健壮的野樱桃大树上，剪取当年生半木质化枝条，保存在湿度为80%～90%的容器中带回实验室，剪成一芽一段的芽段；用洗衣粉水对芽段进行清洗，而后用自来水流水冲洗30－60分钟，把材料拿到超净工作台上，放入无菌烧杯内，加入70%酒精杀菌30－45秒，倒出酒精，再加入0.1%的升汞（HgCL2）杀菌6－10分钟，中间摇动3－5次，使外植体充分接触杀菌液；倒出升汞，加无菌水洗4－6次；取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的水分，把芽段接种到装有芽启动培养基即MS + BA 0.3～1.5 mg/L + IBA 0.05～0.2mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%  的试管内，每管1个芽段； b、试管苗增殖：在芽启动培养基上芽段萌发生长获得的绿苗即无菌苗，把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS（MS3）+ BA 0.1～1.0 mg/L + IBA 0.01～0.1 mg/L +蔗糖3% + 琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；在灭菌前把培养基的pH值调至5.8，然后在121℃、一个大气压下进行高压灭菌20分钟； c、试管苗生根：切取生长高度在1.5 cm以上的无菌试管绿苗，把试管苗接种到生根培养基即1/4 MS + IBA 0.5～2.0 mg/L + 蔗糖20～30 g/L + 琼脂粉0.6%上，进行生根培养，先使试管苗置连续暗培养7～14d，然后转到光/暗周期为16/8h条件下培养。 3.  一种防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基，其特征是：培养基设置为包含有芽启动培养基设置为包含有MS + BA 0.3～1.5 mg/L + IBA 0.05～0.2mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、增殖培养基设置为包含有改良MS是指MS3+ BA 0.1～1.0 mg/L + IBA 0.01～0.1 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、生根培养基设置为包含有1/4MS + IBA 0.5～2.0 mg/L + 蔗糖20～30 g/L + 琼脂粉0.6%。 4.  根据权利要求3所述的基于云南野樱桃试管苗黄化的培养基；其特征是： MS即Murashige and Skoog培养基, 组份如下：  MS 基本培养基组成 无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L） NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4·7H2O 370 CaCl2·2H2O 440 无机成分 微量元素   FeSO4·7H2O 27.8 EDTA 37.3 KI 0.83 H3BO3 6.2 MnSO4·4H2O 22.3 ZnSO4·7H2O 8.6 Na2MoO4·2H2O 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 有机成分   烟酸 0.5 VB1 0.5 VB6 0.5 甘氨酸 2.0 肌醇 100 蔗糖 30000 琼脂 6000 。 5.   根据权利要求3所述的防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基；其特征是：改良MS即MS3：MS中的无机成分大量元素和微量元素进行改良，有机成分不变；组份如下：            MS3培养基的组成 无机成分 工作浓度mg/L NH4NO3 825 KNO3 900 KH2PO4 170 MgSO4·7H2O 370 CaCl2·2H2O 440 FeSO4·7H2O 41.7 EDTA 56.0 H3BO3 4.8 MnSO4·H2O 33.5 ZnNO3·6H2O 17 Na2MoO4·2H2O 0.39 CuSO4·5H2O 0.25  。 6.  根据权利要求3所述的基于云南野樱桃试管苗黄化的培养基；其特征是：细胞分裂素即BA 设置为 6－苄基氨基嘌呤，生长素即IBA设置为吲哚丁酸。 7.  根据权利要求1和3所述的基于云南野樱桃试管苗黄化的培养基和野樱桃组织培养方法；其特征是：基于云南野樱桃试管苗黄化的培养基和野樱桃组织培养方法在培育欧洲李试管苗的应用。

说明书防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基及组织培养方法
一、     技术领域
本发明涉及一种培养基，一种防止云南野樱桃试管苗黄化现象发生的培养基及其组织培养方法。
二、     背景技术
植物的组织培养，是指在无菌和人工控制环境条件下，利用适当的培养基，对植物的离体器官、组织或细胞进行培养，使其再生形成完整植株的技术。植物的组织培养既是植物遗传工程的基础，也是实用性极强的高新技术，在植物的组织培养在植物的育种、稀有物种和具有重要经济价值物种的保存及繁殖方面都具有重要的应用前景。
植物的组织培养第一个获得成功的是1934年White用离体的番茄根建立了一个活跃生长的无性系。之后，由于培养基成分的不断研究和完善，多种植物获得了组织培养成功。自20世纪60年代，植物的组织培养已走向了工厂化和商品化阶段。现在已不能确切统计有多少种植物获得了组织培养的成功。因为几乎每天都有可能有利用新的植物种类获得组织培养成功的报道。植物组织培养已变成了一种常规的实验技术，广泛应用于植物的脱毒、快繁、外源基因的遗传转化、离体诱变、次生代谢物质的生产、工厂化育苗、种质保存、种质交换等多个方面。到现在，植物的组织培养虽然已经走过了近百年的历程，获得组培成功的植物种类也在日益增多，但由于不同物种基因型及遗传背景的复杂性，至今研究者们还不能实现对所有植物的组织培养再生。即使已成功的物种，由于不同类型和不同品种其基因型的差异，其组培的难易和所需的培养基条件也存在较大差异。因此现有的组培技术都是对特定物种的类型或品种是适宜的，换一个品种或类型可能就是不适宜的或说不是最佳的。如樱桃这一树种，欧洲樱桃（包括甜樱桃和酸樱桃）和中国樱桃都有获得组织培养成功的品种，但不同品种所需的适宜培养基不同，而且不同类型或品种的增殖能力不同。 欧洲甜樱桃增殖倍数较低，没有建立起完善的组织培养植株再生体系；中国樱桃只有少数地方品种获得了组织培养成功，还有很多优良品种和优异资源没有获得组织培养成功。仍需研究者们针对不同的基因型筛选其适宜的组织培养的培养基。尤其是我国具有丰富的中国樱桃的野生资源，要开发利用这些野生资源，就要对其进行评价和保存。保存的最好方法就是组织培养。因为组织培养不仅可以扩大繁殖稀有或频危物种，而且组织培养所占空间小，不会受到因城市发展建设用地所造成的对物种的破坏。因此加强野生资源的组织培养研究，对野生资源的保存具有重要意义。而采用现有培养方法，尚未见中国樱桃－云南野樱桃组织培养成功的报道，表明现有的培养条件不适宜中国樱桃－云南野樱桃的组织培养。
三、     发明内容
为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种防止云南野樱桃在进行组织培养时试管苗出现黄化现象的培养基。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：一种防止云南野樱桃试管苗黄化的组织培养方法，包含有其步骤是：
无菌试管苗建立：选取当年生半木质化枝条，剪成一芽一段的芽段；经过杀菌消毒后，把芽段接种到芽启动培养基即MS + BA 0.3～1.5 mg/L + IBA 0.05～0.2mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6% 的试管内；试管苗增殖：把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS即MS3 + BA 0.1～1.0 mg/L + IBA 0.01～0.1 mg/L +蔗糖3% + 琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；试管苗生根：把试管苗接种到生根培养基即1/4MS  + IBA 0.5～2.0 mg/L + 蔗糖20～30 g/L + 琼脂粉0.6%上。
由于设计了有芽启动培养基、增殖培养基和生根培养基，选用适宜浓度的BA和IBA，特别使用了改良MS即MS3，满足了云南野樱桃试管苗的增殖生长的成份需要，增殖阶段不再选用常规的MS培养基或QL培养基，因此防止了云南野樱桃试管苗黄化现象的发生。
本发明设计了，一种防止云南野樱桃试管苗黄化的组织培养方法，其步骤是：
a、无菌试管苗建立：从生长健壮的野樱桃大树上，剪取当年生半木质化枝条，保存在湿度为80%～90%的容器中带回实验室，剪成一芽一段的芽段；用洗衣粉水对芽段进行清洗，而后用自来水流水冲洗30～60分钟，把材料拿到超净工作台上，放入无菌烧杯内，加入70%酒精杀菌30～45秒，倒出酒精，再加入0.1%的升汞（HgCL2）杀菌6～10分钟，中间摇动3～5次，使外植体充分接触杀菌液；倒出升汞，加无菌水洗4～6次；取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的水分，把芽段接种到装有芽启动培养基即MS + BA 0.3～1.5 mg/L + IBA 0.05～0.2mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6% 的试管内，每管1个芽段；
b、试管苗增殖：在芽启动培养基上芽段萌发生长获得的绿苗体即无菌苗，把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS（MS3）+ BA 0.1～1.0 mg/L + IBA 0.01～0.1 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；在灭菌前把培养基的pH值调至5.8，然后在121℃、一个大气压下进行高压灭菌20分钟；
c、试管苗生根：切取生长高度在1.5 cm以上的无菌苗得到试管苗，把试管苗接种到生根培养基即1/4MS  + IBA 0.5～2.0 mg/L + 蔗糖20～30 g/L+ 琼脂粉0.6%上，进行生根培养，先置试管苗连续暗培养7～14d，然后转到光/暗周期为16/8h条件下培养。
本发明设计了，一种基于云南野樱桃试管苗黄化的培养基，培养基设置为包含有有芽启动培养基设置为包含有MS + BA 0.3～1.5 mg/L + IBA 0.05～0.2 mg/L、增殖培养基设置为包含有改良MS是指MS3+ BA 0.1～1.0 mg/L + IBA 0.01～0.1 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、生根培养基设置为包含有1/4MS  + IBA 0.5～2.0 mg/L + 蔗糖20～30 g/L + 琼脂粉0.6%。
本发明设计了， MS（Murashige and Skoog）培养基, 组成如下：
 MS 基本培养基组成
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L） NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4·7H2O 370 CaCl2·2H2O 440 无机成分 微量元素   FeSO4·7H2O 27.8 EDTA 37.3 KI 0.83 H3BO3 6.2 MnSO4·4H2O 22.3 ZnSO4·7H2O 8.6 Na2MoO4·2H2O 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 有机成分   烟酸 0.5 VB1 0.5 VB6 0.5 甘氨酸 2.0 肌醇 100 蔗糖 30000 琼脂 6000
本发明设计了，改良MS即MS3：MS中的无机成分大量元素和微量元素进行改良，有机成分不变。组成如下：
MS3培养基的组成
无机成分 工作浓度mg/L NH4NO3 825 KNO3 900 KH2PO4 170 MgSO4·7H2O 370 CaCl2·2H2O 440 FeSO4·7H2O 41.7 EDTA 56.0 H3BO3 4.8 MnSO4·H2O 33.5 ZnNO3·6H2O 17 Na2MoO4·2H2O 0.39 CuSO4·5H2O 0.25
本发明设计了，细胞分裂素即 BA为 6－苄基氨基嘌呤，生长素即IBA 为吲哚丁酸。
本发明设计了，防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基及培养方法。
在本技术方案中，基于云南野樱桃试管苗黄化的培养基和野樱桃组织培养方法在培育欧洲李试管苗的应用。
本发明的技术效果在于：运用现有常用基本培养基如MS、QL等配方培养时，试管苗总是表现黄化，继代繁殖时，黄化现象也难以消除。黄化现象严重影响试管苗的生产及利用离体培养技术对其进行遗传改良研究；同时黄化现象的发生也不利于利用组织培养技术对优良野生资源进行离体保存。试管苗黄化现象的发生可能是所用培养基中的某个成分或某几个成分的用量不适宜造成的。本专利的发明目的就是解决云南野樱桃组织培养过程中试管苗发生黄化的问题，获得健壮生长的试管绿苗。为优良野生资源的离体保存提供有效技术方法；为试管苗的生产提供优良繁殖材料，为利用基因工程和细胞工程技术进行这些野生资源的遗传改良提供基础。
在本技术方案中，芽启动培养基、增殖培养基和生根培养基为重要技术特征，在基于云南野樱桃试管苗黄化的培养基和野樱桃组织培养方法的技术领域中，具有新颖性、创造性和实用性，在本技术方案中的术语都是可以用本技术领域中的专利文献进行解释和理解。
四、     附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为云南野樱桃芽段无菌接种后2周绿芽萌发生长的状况图：
图2 为云南野樱桃试管绿苗和黄化苗生长比较的状况图：
A图的试管苗使用了改良MS（MS3）培养基；B图的试管苗使用了MS和改良MS（MS1）；C图的试管苗使用了QL培养基；
图3 为云南野樱桃试管苗生根的状况图。
图4 为欧洲李试管绿苗和黄化苗生长比较的状况图：
A图为MS培养基试管苗表现黄化；B图为MS3即改良MS培养基上试管苗表现浓绿。
五、     具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的组织培养方法，第一个实施例,其步骤是：
a、无菌试管苗建立：从生长健壮的野樱桃大树上，剪取当年生半木质化枝条，保存在湿度为80%的容器中带回实验室，剪成一芽一段的芽段；用洗衣粉水对芽段进行清洗，而后用自来水流水冲洗30分钟，把材料拿到超净工作台上，放入无菌烧杯内，加入70%酒精杀菌30秒，倒出酒精，再加入0.1%的升汞（HgCL2）杀菌6分钟，中间摇动3次，使外植体充分接触杀菌液；倒出升汞，加无菌水洗4次；取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的水分，把芽段接种到装有芽启动培养基即MS + BA 0.3 mg/L + IBA 0.05mg/L 的试管内，每管1个芽段。
b、试管苗增殖：在芽启动培养基上芽段萌发生长获得的绿苗体即无菌苗，把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS是指MS3+ BA 0.1 mg/L + IBA 0.01 mg/L +蔗糖3% + 琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；在灭菌前把培养基的pH值调至5.8，然后在121℃、一个大气压下进行高压灭菌20分钟；
c、试管苗生根：切取生长高度在1.5 cm以上的无菌苗得到试管苗，把试管苗接种到生根培养基即1/4MS  + IBA 0.5 mg/L + 蔗糖120 g/L上，进行生根培养，先使试管苗连续暗培养7d，然后转到光/暗周期为16/8h条件下培养。
使用本实施例，对云南野樱桃植株的试验结果：
芽的萌发生长
选取五个云南野樱桃植株（云野1、云野2、云野3、云野4、云野5）的芽段都成功获得了萌发生长的绿芽梢（图1），说明所选用培养基MS + 0.3～1.0 mg/L BA + 0.05～0.2mg/L IBA对云南野樱桃芽的启动培养是有效的。
试管苗的增殖生长
获得的不同株系的无菌绿苗转移到增殖培养上继代增殖培养，结果表明在改良MS （MS3）上生长的苗绿、苗壮，增殖倍数高（图2，A），能有效克服黄化现象的发生。在普通MS及改良MS（MS1）培养基上，叶色表现黄绿（图2，B），随着培养时间的加长趋于黄化；在QL培养基上表现黄化（图2，C），随着培养时间的加长趋于白化；而在改良MS（MS2）上，虽然可以获得绿苗，但苗细弱，也不是理想的培养基组成。
3 试管苗的生根
  健康绿苗经生根诱导培养20 d, 不同株系的生根率都可达90%以上（图3），平均单株根数为3～5。说明所选用生根方法能有效诱导云南野樱桃试管苗的生根。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的组织培养方法，第二个实施例,把第一个实施例应用于欧洲李的组织培养，也成功获得了叶色浓绿的健壮试管苗（图4）。说明本专利技术还能有效防止其他核果类果树试管苗黄化现象的发生。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的组织培养方法，第三个实施例,其步骤是：
a、无菌试管苗建立：从生长健壮的野樱桃大树上，剪取当年生半木质化枝条，保存在湿度为90%的容器中带回实验室，剪成一芽一段的芽段；用洗衣粉水对芽段进行清洗，而后用自来水流水冲洗60分钟，把材料拿到超净工作台上，放入无菌烧杯内，加入70%酒精杀菌45秒，倒出酒精，再加入0.1%的升汞即HgCL2杀菌10分钟，中间摇动5次，使外植体充分接触杀菌液；倒出升汞，加无菌水洗6次；取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的水分，把芽段接种到装有芽启动培养基即MS + BA 1.5 mg/L + IBA 0.2mg/L 的试管内，每管1个芽段。
b、试管苗增殖：在芽启动培养基上芽段萌发生长获得的绿苗体即无菌苗，把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS是指MS3+ BA 1.0 mg/L + IBA 0.1 mg/L +蔗糖3% + 琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；在灭菌前把培养基的pH值调至5.8，然后在121℃、一个大气压下进行高压灭菌20分钟；
c、试管苗生根：切取生长高度在1.5 cm以上的无菌苗得到试管苗，把试管苗接种到生根培养基即1/4MS  + IBA 2.0 mg/L + 蔗糖30 g/L上，进行生根培养，先使试管苗连续暗培养14d，然后转到光/暗周期为16/8h条件下培养。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的组织培养方法，第四个实施例,其步骤是：
a、无菌试管苗建立：从生长健壮的野樱桃大树上，剪取当年生半木质化枝条，保存在湿度为85%的容器中带回实验室，剪成一芽一段的芽段；用洗衣粉水对芽段进行清洗，而后用自来水流水冲洗45分钟，把材料拿到超净工作台上，放入无菌烧杯内，加入70%酒精杀菌38秒，倒出酒精，再加入0.1%的升汞即HgCL2杀菌8分钟，中间摇动4次，使外植体充分接触杀菌液；倒出升汞，加无菌水洗4次；取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的水分，把芽段接种到装有芽启动培养基即MS + BA 0.9 mg/L + IBA 0.125mg/L 的试管内，每管1个芽段。
b、试管苗增殖：在芽启动培养基上芽段萌发生长获得的绿苗体即无菌苗，把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS是指MS3+ BA 0.55 mg/L + IBA 0.055～mg/L +蔗糖3% + 琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；在灭菌前把培养基的pH值调至5.8，然后在121℃、一个大气压下进行高压灭菌20分钟；
c、试管苗生根：切取生长高度在1.5 cm以上的无菌苗得到试管苗，把试管苗接种到生根培养基即1/4MS  + IBA 1.25 mg/L + 蔗糖75 g/L上，进行生根培养，先使试管苗连续暗培养10d，然后转到光/暗周期为16/8h条件下培养。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的组织培养方法，第五个实施例,其步骤是：
a、无菌试管苗建立：从生长健壮的野樱桃大树上，剪取当年生半木质化枝条，保存在湿度为90%的容器中带回实验室，剪成一芽一段的芽段；用洗衣粉水对芽段进行清洗，而后用自来水流水冲洗30分钟，把材料拿到超净工作台上，放入无菌烧杯内，加入70%酒精杀菌32秒，倒出酒精，再加入0.1%的升汞即HgCL2杀菌9分钟，中间摇动5次，使外植体充分接触杀菌液；倒出升汞，加无菌水洗4次；取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的水分，把芽段接种到装有芽启动培养基即MS + BA 0.35 mg/L + IBA 0.2mg/L 的试管内，每管1个芽段。
b、试管苗增殖：在芽启动培养基上芽段萌发生长获得的绿苗体即无菌苗，把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS是指MS3+ BA 0.9 mg/L + IBA 0.016 mg/L +蔗糖3% + 琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；在灭菌前把培养基的pH值调至5.8，然后在121℃、一个大气压下进行高压灭菌20分钟；
c、试管苗生根：切取生长高度在1.5 cm以上的无菌苗得到试管苗，把试管苗接种到生根培养基即1/4MS  + IBA 0.53 mg/L + 蔗糖118 g/L上，进行生根培养，先使试管苗连续暗培养13d，然后转到光/暗周期为16/8h条件下培养。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的组织培养方法，第六个实施例,其步骤是：
a、无菌试管苗建立：从生长健壮的野樱桃大树上，剪取当年生半木质化枝条，保存在湿度为80%～90%的容器中带回实验室，剪成一芽一段的芽段；用洗衣粉水对芽段进行清洗，而后用自来水流水冲洗30～60分钟，把材料拿到超净工作台上，放入无菌烧杯内，加入70%酒精杀菌30～45秒，倒出酒精，再加入0.1%的升汞（HgCL2）杀菌6～10分钟，中间摇动3～5次，使外植体充分接触杀菌液；倒出升汞，加无菌水洗4～6次；取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的水分，把芽段接种到装有芽启动培养基即MS + BA 0.3～1.5 mg/L + IBA 0.05～0.2mg/L 的试管内，每管1个芽段。
b、试管苗增殖：在芽启动培养基上芽段萌发生长获得的绿苗体即无菌苗，把无菌苗接种到增殖培养基即改良MS（MS3）+ BA 0.1～1.0 mg/L + IBA 0.01～0.1 mg/L +蔗糖3% + 琼脂粉0.6%上，进行增殖快繁；在灭菌前把培养基的pH值调至5.8，然后在121℃、一个大气压下进行高压灭菌20分钟；
c、试管苗生根：切取生长高度在1.5 cm以上的无菌苗得到试管苗，把试管苗接种到生根培养基即1/4MS  + IBA 0.5～2.0 mg/L + 蔗糖120～30 g/L上，进行生根培养，先使试管苗连续暗培养7～14d，然后转到光/暗周期为16/8h条件下培养。
把第三、四、五和六个实施例应用于欧洲李的组织培养，也成功获得了叶色浓绿的健壮试管苗。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基，第一实施例，培养基设置为包含有芽启动培养基设置为包含有MS + BA 0.3 mg/L + IBA 0.05 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、增殖培养基设置为包含有改良MS是指MS3+ BA 0.1 mg/L + IBA 0.01 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、生根培养基设置为包含有1/4MS + IBA 0.5 mg/L + 蔗糖20 g/L。
在本实施例中， MS（Murashige and Skoog）培养基, 组成如下：
 MS 基本培养基组成
无机成分 大量元素 工作浓度（mg/L） NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4·7H2O 370 CaCl2·2H2O 440 无机成分 微量元素   FeSO4·7H2O 27.8 EDTA 37.3 KI 0.83 H3BO3 6.2 MnSO4·4H2O 22.3 ZnSO4·7H2O 8.6 Na2MoO4·2H2O 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 有机成分   烟酸 0.5 VB1 0.5 VB6 0.5 甘氨酸 2.0 肌醇 100 蔗糖 30000 琼脂 6000
在本实施例中，改良MS设置为MS3：MS中的无机成分大量元素和微量元素进行改良，有机成分不变。改良如下：
           改良MS培养基（MS3）的组成
无机成分 工作浓度mg/L NH4NO3 825 KNO3 900 KH2PO4 170 MgSO4·7H2O 370 CaCl2·2H2O 440 FeSO4·7H2O 41.7 EDTA 56.0 H3BO3 4.8 MnSO4·H2O 33.5 ZnNO3·6H2O 17 Na2MoO4·2H2O 0.39 CuSO4·5H2O 0.25
在本实施例中，细胞分裂素即BA设置为 6－苄基氨基嘌呤，生长素即IBA设置为吲哚丁酸。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基，第二实施例，培养基设置为包含有芽启动培养基设置为包含有MS + BA 1.5 mg/L + IBA 0.2 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、增殖培养基设置为包含有改良MS是指MS3+ BA 1.0 mg/L + IBA 0.1 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、生根培养基设置为包含有1/4MS + IBA 2.0 mg/L + 蔗糖30 g/L。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基，第三实施例，培养基设置为包含有芽启动培养基设置为包含有MS + BA 0.9 mg/L + IBA 0.125 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、增殖培养基设置为包含有改良MS是指MS3+ BA 0.55mg/L + IBA 0.055 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、生根培养基设置为包含有1/4MS + IBA 0.75 mg/L + 蔗糖25 g/L。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基，第四实施例，培养基设置为包含有芽启动培养基设置为包含有MS + BA 0.32 mg/L + IBA 0.2 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、增殖培养基设置为包含有改良MS是指MS3+ BA 1.0 mg/L + IBA 0.02 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、生根培养基设置为包含有1/4MS + IBA 0.58mg/L + 蔗糖28 g/L。
一种防止云南野樱桃试管苗黄化的培养基，第五实施例，培养基设置为包含有芽启动培养基设置为包含有MS + BA 0.3～1.5 mg/L + IBA 0.05～0.2 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、增殖培养基设置为包含有改良MS是指MS3+ BA 0.1～1.0 mg/L + IBA 0.01～0.1 mg/L + 蔗糖3% + 琼脂粉0.6%、生根培养基设置为包含有1/4MS + IBA 0.5～2.0 mg/L + 蔗糖20～30 g/L。
本发明具有下特点：
1、由于设计了芽启动培养基、增殖培养基和生根培养基，在BA和IBA组合作用下，特别使用了改良MS即MS3，满足了云南野樱桃试管苗增殖生长的需要，不再使用常规的MS培养基和QL培养基，因此防止了云南野樱桃试管苗出现黄化现象。
2、本专利技术的优点是对组织培养过程中云南野樱桃试管苗出现的黄化问题，能有效克服黄化现象的发生，成功获得叶色浓绿、芽梢健壮生长的野樱桃试管苗，建立野樱桃的高效、高质量组织培养快繁技术体系，获得试管苗的高效生根。本专利技术可用于苗木的试管育苗、植物的细胞工程及基因工程的遗传改良、特异资源的离体保存等。
上述实施例只是本发明所提供的基于云南野樱桃试管苗黄化的培养基和云南野樱桃组织培养方法的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中的成份或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的技术领域，均属于本发明的保护范围。