一种微生物菌剂在含酚废水生物处理中的应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210057537.2	申请日：	2012.03.07
公开号：	CN102776137A	公开日：	2012.11.14
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20120307\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/20; C02F3/34; C12R1/15(2006.01)N; C12R1/01(2006.01)N; C02F101/34(2006.01)N	主分类号：	C12N1/20
申请人：	昆明金泽实业有限公司; 云南省微生物研究所; 玉溪山水生物科技有限责任公司
发明人：	李铭刚; 文孟良; 侯金荣; 黄伟初; 武仕敏; 滕峰; 周江东
地址：	650109 云南省昆明市西山区春雨路1426号
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内容摘要

特效脱酚菌种AgromycessoliPhe-03(专利菌株保藏号为：CCTCCNO:M2012030)与CorynebacteriumlubricantisPhe-05（专利菌株保藏号为：CCTCCNO:M2012031）单一及混合菌剂可直接用于含酚工业污水处理，效率高，成本低，不会对环境造成二次污染。具体应用方式有：（1）为相关污水处理企业提供特效脱酚菌剂，培养出新型活性污泥，广泛用于各类水体处理，降低苯酚残留；（2）为相关污水产生企业提供特效脱酚菌剂，提高其污水处理系统内苯酚降解菌种群数量，实现高效率，低成本，简单操作，简单管理，不造成环境二次污染的含酚废水生物处理过程。

权利要求书

1：特效降解酚菌种 phe-03( 专利菌株保藏号为： CCTCC M 2012030 ) 与 phe-05 （专利菌株保藏号为： CCTCC M 2012031），其特征是：利用化工环境废水及附近土样的微生物细菌群，通过以苯酚为唯一碳源的培养基筛选，再采用高浓度含酚工业污水驯化，菌株对苯酚具有优良降解性能。
2：特效降解酚菌种 phe-03( 专利菌株保藏号为： CCTCC M 2012030 ) 与 phe-05 （专利菌株保藏号为： CCTCC M 2012031）在含苯酚废水处理上的应用，其特征是： phe-03 与 phe-05 单一及混合菌剂，适用于含苯酚废水的高效生物处理。

说明书

一种微生物菌剂在含酚废水生物处理中的应用
    技术领域本发明涉及两株高效苯酚降解菌在含酚废水处理上的应用，属于环境保护技术领域，也属于生物强化技术的范畴。
     背景技术含酚废水是水体重要污染物之一。目前国内外工业上治理含酚废水的方法一般分为物化法、化学法、生化法三大类。根据长期试用效果表明，物化法、化学法及生化法在工业含酚废水的处理上取得了相当可观的理论成果及实效，如：汽提法、塔式萃取法、吸附法、化学沉淀法、普通活性污泥净化法、电解净化法等均对工业废水中的酚类物质具有去除作用。然而，也存在着不容忽视的诸多问题，物化法、化学法在处理污水的投入上往往成本较高，且会对环境造成二次污染；对于生化法，仅能处理含酚浓度较低的污水，故对高浓度的工业含酚废水现目前仍未实现投入少，效果好的处理目的。
     针对于以上问题，结合与物理、化学及生物处理含酚工业废水方法的优缺点，经过几十年研究表明在生物处理方法上具有广阔的开发空间。目前己基本了解微生物降解苯酚的生物学途径主要有两条： 1. 好氧微生物利用苯酚羟化酶将苯酚氧化为邻苯二酚，乙酰辅酶 A、琥珀酸、丙酮酸等可以进入三羧酸循环，继续被微生物利用； 2. 通过厌氧微生物将苯酚羧化为 4- 羟基苯甲酸，然后经过相关酶的作用苯甲酸途径，生成乙酰辅酶 A，最终转化成乙酸，继续被微生物利用。从该途径分析可以看出，采用微生物降解污水中的酚可以在厌氧或有氧条件下进行，因此，微生物降酚从原理来说具备较广的工艺适应性。
     尽管如此，要建立一条高效的微生物含酚废水处理工艺，仍需要开展大量的前期工作，如何通过分离、筛选获得性状优良的驯化菌株，并进一步开发出适应生产工艺的微生物菌剂是关键。而目前，大多数报道的降酚菌可耐受酚的浓度大都较低（<1500mg/L）；降酚率一般不超过 90%，对于高浓度含酚废水微生物的研究报道则少之又少。
     发明内容本发明旨在筛选、驯化及研发出相关高效降解工业污水中酚类物质的微生物 phe-03 与 phe-05 的菌种、菌剂，并用于工业含酚废水的处理上，以实现处理上的高效率，低成本，污染小的效果。
     本发明是通过以下技术方案实现上述技术发明目的的。
     ⑴ . 利用化工环境废水及附近土样提取微生物细菌群，通过在只有苯酚为碳源的培养基上培养，再经过在高浓度工业含酚污水中数次筛选及驯化后获得菌株 Phe-03 与 Phe-05。经过分子生物学鉴定， Phe-03 被鉴定为 Agromyces soli 菌株； Phe-05 被鉴定为 Corynebacterium lubricantis 菌株。两株菌均已在 “中国典型培养物保藏中心” 进行了有效保藏。保藏编号分别为： Agromyces soli Phe-03 CCTCC NO: M 2012030、 Corynebacterium lubricantis Phe-05 CCTCC NO: M 2012031。保藏日期为： 2012 年 2 月 22 日。通过人工控制苯酚的含量，针对细菌 Agromyces soli Phe-03 与 Corynebacterium
     lubricantis Phe-05 降解苯酚能力、效率以及相关检测方法建立完善的实验模型。⑵ . 通过进一步采用实际工业含酚废水驯化，得到适宜污水环境的混和菌剂，并用于中试处理。以普通污水处理系统处理结果为空白对照，比较菌剂在工业含酚废水处理上的应用效果。
     4 具体实施方式实例 1.phe-03、 phe-05 的菌种选育及菌剂制备方法 ⑴无机盐培养基配制：将 0.5g KH2PO4、 0.5g K2HPO4、 0.2g MgSO4、 0.2g CaCL2 、 0.2g NaCl 、微量 FeSO4 和水置于烧杯中混合均匀，并用 NaoH 调整其 pH 至 7.4-7.6 之间，搅拌均匀即制得无机盐培养基。
     ⑵苯酚菌的初步筛选：将 1000ml 液态无机盐培养基以 200ml/ 瓶分装到 5 个 500ml 的三角瓶中（无需灭菌），并编号为： P5、P10、 P15、 P20、 P25，并向 P5、P10、 P15、 P20、 P25 中分别加入 0.5g/l、 1.0g/l、 1.5g/l、 2.0g/l、 2.5g/l 的苯酚，随后向每个三角瓶中加入 5ml 的污泥样，放置于 28℃、 210rmp 的摇床中培养 48h，然后分别从 P5、P10、 P15、 P20、 P25 各取一滴样涂于玻片上，经晾干后用亚甲基蓝进行染色，在显微镜下观察各三角瓶中细菌生长状况。观察结果表明：以苯酚浓度递增式观察， P10、 P15 细菌生长数量较多，且分布均匀；而 P25 上基本无细菌生长。
     ⑶ 含酚废水细菌的分离纯化将配制好的无机盐培养液及培养皿置于高压灭菌锅中 121℃下灭菌 30min，取出培养液与平皿，分别向 P10、 P15、 P20、 P25 加入 1ml、 1.5ml、 2ml、 2.5ml 50% 的苯酚溶液，并与培养液 P15、 P20、 P25 上的菌株进行分离纯化。用 200ml 无菌水分混匀，以 30ml/ 皿倒平皿，取出 P10、 -3 -4 别将 P10、 P15、 P20、 P25 菌液稀释到 10 、 10 、 10-5 三个浓度梯度，并按照每个浓度梯度 4 皿涂
     制平皿，共计 4×3×4=48 个平皿，在 28℃、 210rmp 温箱中培养 48h。经观察结果表明： ①菌株种类、长势、数量、颜色、形状都随着苯酚浓度及稀释倍数的不同而有所不同，随着苯酚浓度的升高，菌株种类越单一，数量越少；也随着稀释倍数的升高而菌株数量越少。
     ②通过分离培养基平皿观察记录，按苯酚浓度和稀释倍数的不同，选定 38 株菌落进行下一步分离纯化，其分别为苯酚浓度为 1.0mg/ml 下培养的 30 株，苯酚浓度为 1.5mg/ml 下培养的 3 株，苯酚浓度为 2.0mg/ml 下培养的 4 株，苯酚浓度为 2.5mg/ml 下培养的 1 株。
     ⑷含酚废水细菌的进一步优化筛选方法、器材、试剂及步骤与 “苯酚降解菌的分离纯化” 相同，对 “苯酚降解菌的分离纯化” 后选定的 38 株菌采用更高苯酚浓度培养基进行适应性驯化培养。经观察，结果表明： -3 -2 ①苯酚浓度在 2000mg/ml 时， P10 浓度梯度为 10 和 10 的菌株长势较其他浓度梯度好，且菌种相同，表观为桔黄成片，并统一命名为 phe-01 ； ②苯酚浓度在 2000mg/ml 时， p15 浓度梯度为 10-3 的菌株长势较其他浓度梯度好，表观为桔黄成片，命名为 phe-02 ；表观 ③苯酚浓度在 2500mg/ml 时， p20 浓度梯度为 10-2 的菌株长势较其他浓度梯度好，为白色微黄成片，命名为 phe-03 ； ④苯酚浓度在 2000mg/ml 时， P20 浓度梯度为 10-2 和 10-4 的菌株长势较其他浓度梯度好，且菌种相同，表观为白色颗粒成片，并统一命名为 phe-04 ；⑤苯酚浓度在 2000mg/ml 时， P20 浓度梯度为 10-2 的有一菌株与④中细菌不为同种，且长势较其他浓度梯度好，表观为白色微黄成片命名为 phe-05。
     （5）含酚废水细菌苯酚降解定量筛选 ①苯酚标准曲线建立用电子天枰称量 5.00g 苯酚置于 500ml 的容量瓶中，加纯净水稀释定溶到 500ml 作为母液，然后再用移液枪分别精确吸取母液 0.5ml、 1.0ml、 1.5ml、 2.0ml、 2.5ml、 3.0ml、 3.5ml、 4.0ml、 4.5ml、 5.0ml 加入到 10 支 50ml 洁净的容量瓶中，并用纯净水定溶至 50ml，编号为 100mg/ml、 200mg/ml、 300mg/ml、 400mg/ml、 500mg/ml、 600mg/ml、 700mg/ml、 800mg/ml、 900mg/ml、 1000mg/ml ；将定溶好的苯酚溶液置于冰箱中冷藏 24h 后用高效液相色谱仪测定，做苯酚浓度与峰面积关系的标准曲线。高效液相色谱的 HPLC 溶剂系统为乙睛：纯净水 =8 ： 2；色谱柱型号为日本 YMC 酚专用分析柱（hydrosphere C18。250×4.6 mmI.D. S-5um, 12nm），柱温为 37 ℃。结果得出标准曲线方程： y=4382.7X+24055,R2=0.9969 ； “y”为苯酚 HPLC 测定峰面积， “X” 为苯酚浓度。
     ② phe-01~phe-05 摇瓶培养定量降酚筛选无机盐培养基配制方法同上。培养基灭菌后添加苯酚母液，使培养体系中苯酚浓度达到 1500mg/ml。在无菌条件下，用接种针分别从保存好的斜面上挑起 phe-01~phe-05 细菌菌苔于摇瓶中，置于 28.5℃， 200rpm 的条件下培养。在此过程中，设置苯酚培养液空白对照（苯酚浓度为 1500mg/ml ；不接种细菌）。培养 8h 后开始采样，每次用标准取样器取样 100ul，再用 100ul 蒸馏水稀释， HPLC 定量测定培养体系中苯酚浓度，测定方法同上，并计算苯酚降解率。采样时间间隔 8h，即第 8h、第 16h、第 24h、第 32h、第 40h 以及第 48h 采样。采样测定结果表明：在 32h 内 phe-03 降酚率达到 81.08%， phe-05 降酚率达到 83.02% ； phe-01、 phe-02、 phe-04 降酚率分别为 37.06%、 36.51% 以及 48.13% ；空白对照的苯酚自然挥发率仅为 1.28%。通过以上工作，确定 phe-03 以及 phe-05 为最佳入选菌株。
     (6) 入选菌株电镜扫描观察用移液管向每只离心管中移取 5ml 戊二醛，并编号为 phe-03 以及 phe-05。在紫外线接种间中酒精灯消毒条件下挑取适量菌苔置于 2 支装有戊二醛的离心管中，并混匀，盖好盖子封存，待过夜后用移液管移取适量菌液至玻片上，待晾干后喷金处理 , 然后用电子显微镜观察。观察结果表明：两株菌均为球状菌。菌体直径大约 0.5um，长度 0.5-1.0um 不等。
     (7) Phe-03、 Phe-05 菌株鉴定菌株 phe-03 与 phe-05 通过总 DNA 提取，细菌 16S rDNA 通用引物扩增。扩增目的片段通过测序后利用 Blast 软件在 GenBank 等在 GenBank 数据库中进行相似性搜索，选用同 ] 源性比较高的典型菌株的 16S rDNA 序列作为参比对象，然后用 CLUSTAL X 软件进行多序列比对并计算试菌株与参比菌株之间的序列相似性，采用邻接法（Neighbor-joining ）用 MAGE 4 软件构建以 16S rDNA 序列为基础的供试菌与参比菌之间的系统发育树，分析结果表明： phe-03 属于 Agromyces soli 菌株， phe-05 为 Corynebacterium 属菌株。
     两株菌均已在 “中国典型培养物保藏中心” 进行了有效保藏。保藏编号分别为： Agromyces soli Phe-03 CCTCC NO: M 2012030、 Corynebacterium lubricantis Phe-05 CCTCC NO: M 2012031。保藏日期为： 2012 年 2 月 22 日。
     实例 2 phe-03、 phe-05 单一菌株在工业高浓度含酚废水上用⑴煤化工废水水质测定首先从煤化工废水源分别采水样共计 50L，混合后经高效液相色谱仪、重铬酸钾法等方法分别测定煤化工污水中的苯酚含量、 CODcr、氨氮、硫化物等指标，结果显示为： C（酚） =750.0mg/L、 CODcr=5035.10mg/L、 C( 氨氮 )= 800.0mg/L、 C（硫化物） =40.0mg/L、 ph=9.5、 SS=650.0mg/L、油类 =200 mg/L。
     ⑵ phe-03、 phe-05 单一菌株驯化煤化工废水 2000ml，采用无菌滤膜过滤后，分装成 20 瓶（100ml/ 瓶）。每 10 瓶按 10% 比例分别接入 phe-03 及 phe-05 菌株培养液（培养液预先培养 48h，成分为基础培养盐 +1000mg/ml 苯酚），并置于摇床， 28.5℃， 200rpm 的条件下培养。定时取样和观察。培养 24h 后开始采样，采样时间间隔 24h，即第 24h、第 48h、第 72h、第 96h、第 108h 以及第 132h 采样。观察及采样测定结果表明： phe-03 菌株在 96h 后长势很好，摇瓶底部出现大量絮状沉淀，菌液混浊， 108h~132h 内降酚率达从 32.34% 迅速提高至 87.15%。phe-05 菌株在 96h 后长势很好，菌液混浊， 96h~132h 内降酚率达从 24.51% 迅速提高至 90.05%。
     （3） phe-03、 phe-05 单一菌株进一步驯化煤化工废水 1000ml，采用无菌滤膜过滤后，分装成 10 瓶（100ml/ 瓶）。每 5 瓶按 10% 比例分别接入 phe-03 及 phe-05 菌株 96h 驯化液（驯化处理过程同上），按比例添加无机盐，置于摇床， 28.5℃， 200rpm 的条件下培养。定时取样和观察。培养 24h 后开始采样，采样时间间隔 24h，即第 24h、第 48h、第 72h、第 96h、第 108h 以及第 132h 采样。观察及采样测定结果表明： phe-03 菌株经过 7 代持续驯化，在 24h 后长势很好，菌液混浊， 48h 内降酚率达 86.15%。 phe-05 菌株经过 11 代持续驯化，在 24h 后长势很好，菌液混浊， 48h 内降酚率达 80.78%。
     （4） phe-03、 phe-05 单一菌株活性菌剂培养通过逐级放大的模式， phe-03、 phe-05 驯化菌液从 1000ml 培养量放大至 200l 开放式通气培养罐内。培养罐采用热水循环加热，通用鼓风机通风，通用电机搅拌。28℃、 120rpm 培养，通气量为 50L/min。培养时间 48h。
     实例 3 phe-03、 phe-05 混合菌株在工业高浓度含酚废水处理上应用（1）污水处理系统建立根据含酚废水产生企业生产区污水处理系统工艺流程建设一套日处理 5m3 的中试污水处理系统模型，即：生产污水经过格栅，进入混凝池，再到 MESB( 加酸 )，接着进入高效沉淀池，流入水解酸化池，再到 MBBR 池， PAC 池，然后流入氧化脱色池，最后出水。
     （2）含酚废水产生企业含酚废水水质测定选用煤化工废水源经高效液相色谱仪、重铬酸钾法等方法分别测定煤化工污水中的苯酚含量、 CODcr、氨氮、硫化物等指标，结果显示为： C（酚） =810.0mg/L、 CODcr=5416.05mg/L、 C( 氨氮 )= 810.21mg/L、 C（硫化物） =51 mg/L、 ph=9.13、 SS=712.0mg/L、油类 =152 mg/L。
     （3） phe-03、 phe-05 混合细菌的实际应用每 168h 将 phe-03、 phe-05 混合细剂（各 100L）加入到中试污水处理系统中的 MBBR 池，经过 30 天的细菌前期适应过程后，微生物定置于污水处理系统中。
     在微生物定置完成之后，进行混合菌剂降解苯酚试验。每 8h 取样一次。采样时间间隔 8h，即第 8h、第 16h、第 24h、第 32h、第 40h 以及第 48h 采样。与含酚废水产生企业实际污水系统的出水水质进行对比。结果表明： phe-03、 phe-05 混合细菌在中试模型中对含酚工艺废水中的酚类物质的降解达到了预计效果，中试模型 24h 的污水处理出水水质中含酚浓度为 0.05mg/l，酚去除率达到了 95% 以上，比对照提高 23%。污水系统水质从三级排放达到了一级污水排放标准。7

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1、(10)申请公布号 CN 102776137 A(43)申请公布日 2012.11.14CN102776137A*CN102776137A*(21)申请号 201210057537.2(22)申请日 2012.03.07CCTCC NO:M2012030 2012.02.22CCTCC NO:M2012031 2012.02.22C12N 1/20(2006.01)C02F 3/34(2006.01)C12R 1/15(2006.01)C12R 1/01(2006.01)C02F 101/34(2006.01)(71)申请人昆明金泽实业有限公司地址 650109 云南省昆明市西山区春雨路142。

2、6号申请人云南省微生物研究所玉溪山水生物科技有限责任公司(72)发明人李铭刚文孟良侯金荣黄伟初武仕敏滕峰周江东(54) 发明名称一种微生物菌剂在含酚废水生物处理中的应用(57) 摘要特效脱酚菌种AgromycessoliPhe-03(专利菌株保藏号为：CCTCCNO:M2012030)与CorynebacteriumlubricantisPhe-05（专利菌株保藏号为：CCTCCNO:M2012031）单一及混合菌剂可直接用于含酚工业污水处理，效率高，成本低，不会对环境造成二次污染。具体应用方式有：（1）为相关污水处理企业提供特效脱酚菌剂，培养出新型活性污泥，广泛用于各类水体处理，降。

3、低苯酚残留；（2）为相关污水产生企业提供特效脱酚菌剂，提高其污水处理系统内苯酚降解菌种群数量，实现高效率，低成本，简单操作，简单管理，不造成环境二次污染的含酚废水生物处理过程。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页说明书5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 5 页1/1页21.特效降解酚菌种phe-03(专利菌株保藏号为：CCTCC M 2012030 )与 phe-05（专利菌株保藏号为：CCTCC M 2012031），其特征是：利用化工环境废水及附近土样的微生物细菌群，通过以苯酚为唯一碳源的培养基筛选，再采用高浓度含酚。

4、工业污水驯化，菌株对苯酚具有优良降解性能。2.特效降解酚菌种phe-03(专利菌株保藏号为：CCTCC M 2012030 )与 phe-05（专利菌株保藏号为：CCTCC M 2012031）在含苯酚废水处理上的应用，其特征是：phe-03与phe-05单一及混合菌剂，适用于含苯酚废水的高效生物处理。权利要求书CN 102776137 A1/5页3一种微生物菌剂在含酚废水生物处理中的应用技术领域0001 本发明涉及两株高效苯酚降解菌在含酚废水处理上的应用，属于环境保护技术领域，也属于生物强化技术的范畴。背景技术0002 含酚废水是水体重要污染物之一。目前国内外工业上治理含酚废水的。

5、方法一般分为物化法、化学法、生化法三大类。根据长期试用效果表明，物化法、化学法及生化法在工业含酚废水的处理上取得了相当可观的理论成果及实效，如：汽提法、塔式萃取法、吸附法、化学沉淀法、普通活性污泥净化法、电解净化法等均对工业废水中的酚类物质具有去除作用。然而，也存在着不容忽视的诸多问题，物化法、化学法在处理污水的投入上往往成本较高，且会对环境造成二次污染；对于生化法，仅能处理含酚浓度较低的污水，故对高浓度的工业含酚废水现目前仍未实现投入少，效果好的处理目的。 0003 针对于以上问题，结合与物理、化学及生物处理含酚工业废水方法的优缺点，经过几十年研究表明在生物处理方法上具有广阔的开发空间。目前。

6、己基本了解微生物降解苯酚的生物学途径主要有两条：1. 好氧微生物利用苯酚羟化酶将苯酚氧化为邻苯二酚，乙酰辅酶A、琥珀酸、丙酮酸等可以进入三羧酸循环，继续被微生物利用；2. 通过厌氧微生物将苯酚羧化为4-羟基苯甲酸，然后经过相关酶的作用苯甲酸途径，生成乙酰辅酶A，最终转化成乙酸，继续被微生物利用。从该途径分析可以看出，采用微生物降解污水中的酚可以在厌氧或有氧条件下进行，因此，微生物降酚从原理来说具备较广的工艺适应性。 0004 尽管如此，要建立一条高效的微生物含酚废水处理工艺，仍需要开展大量的前期工作，如何通过分离、筛选获得性状优良的驯化菌株，并进一步开发出适应生产工艺的微生物菌剂是关键。而目前。

7、，大多数报道的降酚菌可耐受酚的浓度大都较低（1500mg/L）；降酚率一般不超过90%，对于高浓度含酚废水微生物的研究报道则少之又少。发明内容0005 本发明旨在筛选、驯化及研发出相关高效降解工业污水中酚类物质的微生物phe-03与phe-05的菌种、菌剂，并用于工业含酚废水的处理上，以实现处理上的高效率，低成本，污染小的效果。 0006 本发明是通过以下技术方案实现上述技术发明目的的。 0007 . 利用化工环境废水及附近土样提取微生物细菌群，通过在只有苯酚为碳源的培养基上培养，再经过在高浓度工业含酚污水中数次筛选及驯化后获得菌株Phe-03与Phe-05。经过分子生物学鉴定， Phe-0。

8、3 被鉴定为Agromyces soli菌株；Phe-05被鉴定为 Corynebacterium lubricantis菌株。两株菌均已在“中国典型培养物保藏中心”进行了有效保藏。保藏编号分别为：Agromyces soli Phe-03 CCTCC NO: M 2012030、Corynebacterium lubricantis Phe-05 CCTCC NO: M 2012031。保藏日期为：2012年2月22日。通过人工控制苯酚的含量，针对细菌Agromyces soli Phe-03与Corynebacterium 说明书CN 102776137 A2/5页4lubricant。

9、is Phe-05降解苯酚能力、效率以及相关检测方法建立完善的实验模型。 0008 .通过进一步采用实际工业含酚废水驯化，得到适宜污水环境的混和菌剂，并用于中试处理。以普通污水处理系统处理结果为空白对照，比较菌剂在工业含酚废水处理上的应用效果。 0009 4具体实施方式实例1.phe-03、phe-05的菌种选育及菌剂制备方法无机盐培养基配制：将0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.2g MgSO4、0.2g CaCL2、0.2g NaCl 、微量FeSO4和水置于烧杯中混合均匀，并用NaoH调整其pH至7.4-7.6之间，搅拌均匀即制得无机盐培养基。0010 苯酚菌的初步筛选。

10、：将1000ml液态无机盐培养基以200ml/瓶分装到5个500ml的三角瓶中（无需灭菌），并编号为：P5、P10、P15、P20、P25，并向P5、P10、P15、P20、P25中分别加入0.5g/l、1.0g/l、1.5g/l、2.0g/l、2.5g/l的苯酚，随后向每个三角瓶中加入5ml的污泥样，放置于28、210rmp的摇床中培养48h，然后分别从P5、P10、P15、P20、P25各取一滴样涂于玻片上，经晾干后用亚甲基蓝进行染色，在显微镜下观察各三角瓶中细菌生长状况。观察结果表明：以苯酚浓度递增式观察，P10、P15细菌生长数量较多，且分布均匀；而P25上基本无细菌生长。0011 。

11、含酚废水细菌的分离纯化将配制好的无机盐培养液及培养皿置于高压灭菌锅中121下灭菌30min，取出培养液与平皿，分别向P10、P15、P20、P25加入1ml、1.5ml、2ml、2.5ml 50%的苯酚溶液，并与培养液混匀，以30ml/皿倒平皿，取出P10、P15、P20、P25上的菌株进行分离纯化。用200ml无菌水分别将P10、P15、P20、P25菌液稀释到10-3、10-4、10-5三个浓度梯度，并按照每个浓度梯度4皿涂制平皿，共计434=48个平皿，在28、210rmp温箱中培养48h。经观察结果表明：菌株种类、长势、数量、颜色、形状都随着苯酚浓度及稀释倍数的不同而有所不同，随。

12、着苯酚浓度的升高，菌株种类越单一，数量越少；也随着稀释倍数的升高而菌株数量越少。0012 通过分离培养基平皿观察记录，按苯酚浓度和稀释倍数的不同，选定38株菌落进行下一步分离纯化，其分别为苯酚浓度为1.0mg/ml下培养的30株，苯酚浓度为1.5mg/ml下培养的3株，苯酚浓度为2.0mg/ml下培养的4株，苯酚浓度为2.5mg/ml下培养的1株。 0013 含酚废水细菌的进一步优化筛选方法、器材、试剂及步骤与“苯酚降解菌的分离纯化”相同，对“苯酚降解菌的分离纯化”后选定的38株菌采用更高苯酚浓度培养基进行适应性驯化培养。经观察，结果表明：苯酚浓度在2000mg/ml时，P10浓度梯度为10。

13、-3和10-2的菌株长势较其他浓度梯度好，且菌种相同，表观为桔黄成片，并统一命名为phe-01；苯酚浓度在2000mg/ml时，p15浓度梯度为10-3 的菌株长势较其他浓度梯度好，表观为桔黄成片，命名为phe-02；苯酚浓度在2500mg/ml时，p20浓度梯度为10-2的菌株长势较其他浓度梯度好，表观为白色微黄成片，命名为phe-03；苯酚浓度在2000mg/ml时，P20浓度梯度为10-2和10-4的菌株长势较其他浓度梯度好，且菌种相同，表观为白色颗粒成片，并统一命名为phe-04；说明书CN 102776137 A3/5页5苯酚浓度在2000mg/ml时，P20浓度梯度为10-2的。

14、有一菌株与中细菌不为同种，且长势较其他浓度梯度好，表观为白色微黄成片命名为phe-05。0014 （5）含酚废水细菌苯酚降解定量筛选苯酚标准曲线建立用电子天枰称量5.00g苯酚置于500ml的容量瓶中，加纯净水稀释定溶到500ml作为母液，然后再用移液枪分别精确吸取母液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml加入到10支50ml洁净的容量瓶中，并用纯净水定溶至50ml，编号为100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、700mg/ml、800mg/ml。

15、、900mg/ml、1000mg/ml；将定溶好的苯酚溶液置于冰箱中冷藏24h后用高效液相色谱仪测定，做苯酚浓度与峰面积关系的标准曲线。高效液相色谱的 HPLC溶剂系统为乙睛：纯净水=8：2；色谱柱型号为日本YMC酚专用分析柱（hydrosphere C18。2504.6 mmI.D. S-5um, 12nm），柱温为37。结果得出标准曲线方程：y=4382.7X+24055,R2=0.9969；“y”为苯酚HPLC测定峰面积，“X”为苯酚浓度。0015 phe-01phe-05摇瓶培养定量降酚筛选无机盐培养基配制方法同上。培养基灭菌后添加苯酚母液，使培养体系中苯酚浓度达到1500mg/ml。

16、。在无菌条件下，用接种针分别从保存好的斜面上挑起phe-01phe-05细菌菌苔于摇瓶中，置于28.5，200rpm的条件下培养。在此过程中，设置苯酚培养液空白对照（苯酚浓度为1500mg/ml；不接种细菌）。培养8h后开始采样，每次用标准取样器取样100ul，再用100ul蒸馏水稀释， HPLC定量测定培养体系中苯酚浓度，测定方法同上，并计算苯酚降解率。采样时间间隔8h，即第8h、第16h、第24h、第32h、第40h以及第48h采样。采样测定结果表明：在32h内phe-03降酚率达到81.08%，phe-05降酚率达到83.02%；phe-01、phe-02、phe-04降酚率分别为37.。

17、06%、36.51%以及48.13%；空白对照的苯酚自然挥发率仅为1.28%。通过以上工作，确定phe-03以及phe-05为最佳入选菌株。0016 (6)入选菌株电镜扫描观察用移液管向每只离心管中移取5ml戊二醛，并编号为phe-03以及phe-05。在紫外线接种间中酒精灯消毒条件下挑取适量菌苔置于2支装有戊二醛的离心管中，并混匀，盖好盖子封存，待过夜后用移液管移取适量菌液至玻片上，待晾干后喷金处理,然后用电子显微镜观察。观察结果表明：两株菌均为球状菌。菌体直径大约0.5um，长度0.5-1.0um不等。0017 (7) Phe-03、Phe-05菌株鉴定菌株phe-03 与phe-05。

18、通过总DNA提取，细菌16S rDNA通用引物扩增。扩增目的片段通过测序后利用Blast软件在GenBank等在GenBank数据库中进行相似性搜索，选用同源性比较高的典型菌株的16S rDNA序列作为参比对象，然后用CLUSTAL X软件进行多序列比对并计算试菌株与参比菌株之间的序列相似性，采用邻接法（Neighbor-joining）用MAGE 4软件构建以16S rDNA序列为基础的供试菌与参比菌之间的系统发育树，分析结果表明：phe-03属于Agromyces soli菌株，phe-05为Corynebacterium属菌株。0018 两株菌均已在“中国典型培养物保藏中心”进行了有效保。

19、藏。保藏编号分别为：Agromyces soli Phe-03 CCTCC NO: M 2012030、Corynebacterium lubricantis Phe-05 CCTCC NO: M 2012031。保藏日期为：2012年2月22日。 0019 实例2 phe-03、phe-05单一菌株在工业高浓度含酚废水上用说明书CN 102776137 A4/5页6煤化工废水水质测定首先从煤化工废水源分别采水样共计50L，混合后经高效液相色谱仪、重铬酸钾法等方法分别测定煤化工污水中的苯酚含量、CODcr、氨氮、硫化物等指标，结果显示为：C（酚）=750.0mg/L、CODcr=5035。

20、.10mg/L、C(氨氮)= 800.0mg/L、C（硫化物）=40.0mg/L、ph=9.5、SS=650.0mg/L、油类=200 mg/L。0020 phe-03、phe-05单一菌株驯化煤化工废水2000ml，采用无菌滤膜过滤后，分装成20瓶（100ml/瓶）。每10瓶按10%比例分别接入phe-03及phe-05菌株培养液（培养液预先培养48h，成分为基础培养盐+1000mg/ml苯酚），并置于摇床，28.5，200rpm的条件下培养。定时取样和观察。培养24h后开始采样，采样时间间隔24h，即第24h、第48h、第72h、第96h、第108h以及第132h采样。观察及采样测定结果。

21、表明：phe-03菌株在96h后长势很好，摇瓶底部出现大量絮状沉淀，菌液混浊，108h132h内降酚率达从32.34%迅速提高至87.15%。phe-05菌株在96h后长势很好，菌液混浊，96h132h内降酚率达从24.51%迅速提高至90.05%。0021 （3）phe-03、phe-05单一菌株进一步驯化煤化工废水1000ml，采用无菌滤膜过滤后，分装成10瓶（100ml/瓶）。每5瓶按10%比例分别接入phe-03及phe-05菌株96h驯化液（驯化处理过程同上），按比例添加无机盐，置于摇床，28.5，200rpm的条件下培养。定时取样和观察。培养24h后开始采样，采样时间间隔24h，。

22、即第24h、第48h、第72h、第96h、第108h以及第132h采样。观察及采样测定结果表明：phe-03菌株经过7代持续驯化，在24h后长势很好，菌液混浊，48h内降酚率达86.15%。phe-05菌株经过11代持续驯化，在24h后长势很好，菌液混浊，48h内降酚率达80.78%。0022 （4）phe-03、phe-05单一菌株活性菌剂培养通过逐级放大的模式，phe-03、phe-05驯化菌液从1000ml培养量放大至200l开放式通气培养罐内。培养罐采用热水循环加热，通用鼓风机通风，通用电机搅拌。28、120rpm培养，通气量为50L/min。培养时间48h。0023 实例3 phe。

23、-03、phe-05混合菌株在工业高浓度含酚废水处理上应用（1）污水处理系统建立根据含酚废水产生企业生产区污水处理系统工艺流程建设一套日处理5m3的中试污水处理系统模型，即：生产污水经过格栅，进入混凝池，再到MESB(加酸)，接着进入高效沉淀池，流入水解酸化池，再到MBBR池，PAC池，然后流入氧化脱色池，最后出水。0024 （2）含酚废水产生企业含酚废水水质测定选用煤化工废水源经高效液相色谱仪、重铬酸钾法等方法分别测定煤化工污水中的苯酚含量、CODcr、氨氮、硫化物等指标，结果显示为：C（酚）=810.0mg/L、CODcr=5416.05mg/L、C(氨氮)= 810.21mg/L、。

24、C（硫化物）=51 mg/L、ph=9.13、SS=712.0mg/L、油类=152 mg/L。0025 （3）phe-03、phe-05混合细菌的实际应用每168h将phe-03、phe-05混合细剂（各100L）加入到中试污水处理系统中的MBBR池，经过30天的细菌前期适应过程后，微生物定置于污水处理系统中。0026 在微生物定置完成之后，进行混合菌剂降解苯酚试验。每8h取样一次。采样时间间隔8h，即第8h、第16h、第24h、第32h、第40h以及第48h采样。与含酚废水产生企业实际污水系统的出水水质进行对比。结果表明：phe-03、phe-05混合细菌在中试模型中对含酚说明书CN 102776137 A5/5页7工艺废水中的酚类物质的降解达到了预计效果，中试模型24h的污水处理出水水质中含酚浓度为0.05mg/l，酚去除率达到了95%以上，比对照提高23%。污水系统水质从三级排放达到了一级污水排放标准。说明书CN 102776137 A。

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