造血祖细胞群体和富集其干细胞的方法
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本申请要求2011年11月21日提交的美国临时专利申请号61/562,094的优先权，所述文献的内容完整地并入本文。
技术领域
本发明涉及造血祖细胞群体和富集造血祖细胞的干细胞群体的方法。
背景技术
从人多潜能干细胞(PSC)、胚胎(hESC)干细胞和诱导型多潜能干细胞(hiPSC)生成造血干细胞(HSC)的能力将使得产生数目不受限制的患者匹配的干细胞用于移植和衍生研究人造血发育和疾病的新体外模型成为可能。众多研究已经显示可以从hPSC通过将它们与间质细胞在基于血清的培养基中共培养或通过在成分确定的无血清培养基中用特定形态发生素指导它们的分化衍生出造血谱系细胞(Chadwick等人，2003；Davis等人，2008；Kaufman等人，2001；Kennedy等人，2007；Ledran等人，2008；Ng等人，2005；Pick等人，2007；Vodyanik等人，2006；Yu等人，2010；Zambidis等人，2005)。尽管这些方法产生广泛类型的造血祖细胞，但是移植来自这类培养物的子代至免疫受损小鼠中一般导致经常受限于髓样谱系的低水平植入(Lu等人，2009；Tian等人，2006；Wang等人，2005)。这些研究结果表明用于造血性分化的条件不支持HSC的发育。造成无法从hPSC生成HSC的主要因素是胚胎造血系统的复杂性，该系统由至少两种不同程序组成，仅其中之一产生HSC。
HSC从终末造血程序生成并从称作生血内皮(HE；(Dzierzak和Speck， 2008))的特化内皮细胞群体形成。在小鼠中，HE在正在形成的脉管系统内部的不同部位特化，其中最充分表征的是在胚胎尾部分中存在的副主动脉脏壁层(P-Sp)/主动脉-性腺-中肾(AGM)区。小鼠HE特征在于表达一组造血标志物和内皮标志物，包括VE-钙黏着蛋白(VE-cad)、Sca-1、c-Kit、CD34、Runx1、Scl、Gata2和Lmo2(综述于(Dzierzak和Speck，2008)中)。HSC首先在E10.5于AGM区内可检测并且特征在于除了上述标志物集合之外，还获得低CD45表达(Bertrand等人，2005；Taoudi和Medvinsky，2007；Yokomizo和Dzierzak，2010)。人P-Sp/AGM区也是终末造血部位，因为它含有表达指示HE和造血形成的标志物的祖细胞，所述标志物包括CD31，CD34，CD45，C-KIT，SCL，C-MYB，GATA2和GATA3(Labastie等人，1998；Marshall等人，1999；Oberlin等人，2002；Tavian等人，2001)并且截止妊娠第32日具有体内多谱系再定居能力(Ivanovs等人，2012)。
终末造血之前是一个更早的卵黄囊(YS)限制型程序，称作原始造血，其特征在于产生原始红细胞、巨噬细胞和巨核细胞(综述于(Palis等人，2010)中)。大部分证据表示原始造血在潜能方面受限并不具有生成HSC或淋巴样细胞的能力，但是最近的研究已经显示YS可以在循环之前或在循环不存在的情况下生成淋巴样祖细胞(Rhodes等人，2008；Yoshimoto等人，2011；Yoshimoto等人，2012)。然而，进一步表征这些卵黄囊群体揭示了从区别于VE-cad-CD41+原始造血祖细胞的VE-cad+CD41-HE样祖细胞发育而来的淋巴样细胞(Yoshimoto等人，2011；Yoshimoto等人，2012)。这些发现表明YS显示原始造血潜能和终末造血潜能并且两个群体从不同的祖细胞形成。
迄今大多数研究支持以下解释：来自PSC的谱系发育概括了胚胎中的谱系定型(Murry和Keller，2008)。因而，HSC从PSC生成将不仅取决于建立促进HE发育的培养条件，还取决于在这些祖细胞特化时鉴定它们的方法。在一项较早研究中，我们使用T细胞潜能来定位小鼠ESC分化培养物中终末造血的启动，并且展示这种程序从原始造血启动后48小时出现 的Flk-1+Sox17+祖细胞开启(Irion等人，2010)。几项研究已经展示可以从hESC生成T淋巴细胞(Galic等人，2006；Timmermans等人，2009)。
发明简述
本文描述了T细胞潜能从采用特定形态发生素在无血清培养物中所诱导的hESC和hiPSC定位终末造血程序启动的用途。
在一个实施方案中，鉴定了候选终末造血祖细胞群体，所述群体在培养第6日和第9日出现，表达指示HE/终末造血祖细胞的表面标志物和基因并且在OP9-DL4间质细胞上培养后显示T细胞潜能。除T细胞祖先之外，与间质细胞共培养后，这个群体还产生红细胞样祖先和髓样祖先。这个群体的特征表明它可以代表人P-Sp-衍生的终末造血程序的体外等同物并且因而代表人HSC的祖先。
在一个方面，提供一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，所述方法包括：在人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞的群体中诱导造血性分化；基于CD43和CD34、CD31和CD144中至少一者的表达分选该群体；并且选择作为CD34+CD43-、CD31+CD43-和CD144+CD43-中至少一者的级分。
在又一个方面，提供了使用本文所述方法获得造血祖细胞群体。
在又一个方面，提供一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，所述方法包括在造血性分化期间抑制活化素/nodal信号传导。在一个实施方案中，抑制活化素/nodal信号传导包括将群体与活化素/nodal抑制剂、优选地SB-431542一起培养。
在又一个方面，提供活化素/nodal抑制剂用于富集造血祖细胞的正在经历造血性分化的干细胞群体的用途。在一个实施方案中，活化素/nodal抑制剂是SB-431542。
附图简述
本发明的优选实施方案的这些特征和其他特征将在其中参考附图的以下详细说明中更明显，其中：
图1显示用活化素A和BMP4对hESC的造血性诱导。(A)用于造血性诱导人多潜能干细胞的分化方案。EB在BMP-4存在的情况下在培养的前24小时期间生成，随后在BMP-4和bFGF存在的情况下培养下一个24小时并且随后在BMP4，bFGF和活化素A存在的情况下接着培养48小时(第2-4日)。对于一些实验，添加SB-431542(SB)替代活化素A。在第4日，将BMP4和活化素A(或SB)移除并代之以如所示的VEGF、IL-6、IL-11、IGF-1、SCF、EPO、TPO、Flt-3、IL-3和DKK1。(B)随时间推移在EB中检测到的造血祖细胞的频率。Ery：红细胞样集落；Ery/髓样：由红细胞和少数髓样细胞组成的集落；和髓样：由巨噬细胞或肥大细胞组成的集落。(C)第13日EB中活化素A刺激或抑制对造血祖细胞形成的影响。(D)在所示日EB中CD34、CD43、CD41和CD45表达的流式细胞计数分析，所述EB用0.3ng/ml活化素A外加(A)中所示的细胞因子处理。
图2显示第9日CD34/CD43群体的原始造血潜能。(A)显示从第9日EB分离的CD34和CD43级分的流式细胞计数分析；P1：10％±3％，P2：1.5％±0.7％，P3：12.5％±-4％，P4：21％±8％和P5：35％±9％(±SD，n＝5)，(B)CD34/CD43级分的红细胞样和髓样祖细胞潜能，(C)显示CD41a、CD235a和CD45在(A)中所示的级分上表达的流式细胞计数分析。(D)第6日CD34+CD43-和CD34+CD43+群体的造血潜能。第6日6分选(上半小图)：显示为造血研究所分离的群体的流式细胞计数分析。将细胞分离，作为聚集物培养3日并分析。第9日再聚集(中部小图和下半小图)：显示培养3日后CD34、CD43、CD41a、CD235a和CD45在从所示的分选级分中生成的群体上表达的流式细胞计数分析。(E)从P1和P2第6日级分生成的第9日聚集群体的原始红细胞样/髓样潜能。左图指示从源自P1和P2级分的整个CD34+群体生成的总集落的比例。右图显示从2个不同级分生成的不同类型集落的比例。(F)不同CD34/CD43级分就所示基因而言的RT-qPCR表达分析。标度代表来自三次独立实验的样品均值±均值的标准差。星号表示如通过t-检验所确定的统计显著性；*(p≤0.05)，**(p≤0.01)。
图3显示CD34/CD43群体的T细胞潜能。(A)流式细胞计数分析，其 显示在OP9-DL4上共培养14日后从级分P1-P4生成的CD45+细胞的比例和在共培养第28日从级分P1生成的CD7+CD5+T-淋巴样祖细胞的比例。(B)来自CD34+CD43-级分的T细胞发育的动力学。培养物如所示那样收获并通过流式细胞术分析。(C)在共培养第42日TCRαβ和TCRγδT细胞从CD34+CD43+祖细胞发育。(D)第6日CD34+CD43-祖细胞的T细胞潜能。在第28日收获培养物并分析CD4表达和CD8表达。(E)从第11日EB分离的CD34+CD43-和CD43+CD43low祖细胞的T细胞潜能。在第31日收获培养物并分析细胞。
图4显示从SB-431542处理的EB分离的CD34+祖细胞的潜能。(A)显示在所示的时间期间添加SB(SB)后CD34+KDR+群体在分化第5日形成的流式细胞分析，Act：在分化第1-4日之间用活化素A处理的EB，(B)来自EB的细胞裂解物的Smad2和磷酰-SMAD2表达的免疫印迹分析，其中所述EB在分化第2日用DMSO、活化素-A和/或SB处理30分钟；进行光密度测定并且将其结果绘制为磷酰-SMAD2水平(作为对照表达的％)曲线(DMSO)。(C)流式细胞计数分析，其显示在分化第9、12和16日，在活化素A诱导并SB处理的EB中CD43+群体上CD41a、CD235a和CD45的共表达。(D)在所述分化日活化素A诱导并SB处理的EB的祖细胞潜能。(E)基于CD34+级分的表达分析的qPCR，所述CD34+级分从第9日活化素A诱导并SB处理的EB分离。标度代表来自三次独立实验的样品均值±均值的标准差。星号表示如通过t-检验所确定的统计显著性；*(p≤0.05)。
图5显示SB处理的CD34+群体的淋巴样潜能。(A)SB处理的EB的流式细胞计数分析，其显示CD7+CD5+、CD4+CD8+和CD3+TCRαβ+群体在共培养第28日和第42日形成。(B)hESC衍生的T细胞的功能分析。显示前向散射(FSC)参数和侧向(SSC)散射参数以及用α-CD3和α-CD28抗体刺激4日后hESC衍生的T细胞上CD25、CD38和CD45RO表达的流式细胞计数分析。对照细胞仅用细胞因子处理。
图6显示CD34+祖细胞的造血潜能。(A)来自第8日SB处理的EB的CD34+群体的流式细胞计数分析。(B)在OP9-DL1间质细胞上共培养7日 后SB处理和活化素A诱导的CD34+群体的流式细胞计数分析。将培养物在24孔平板的板孔中用每种群体20,000个细胞启动。(C)在共培养7日后两个CD34+群体的祖细胞潜能。计算每孔集落数目。标度代表单次实验(代表5个独立实验)的培养物的均值的标准差。星号表示如通过t-检验所确定的统计显著性；*(p≤0.015)**(p≤0.001)。(D)显示集落(和来自它们的细胞)的形态和相对大小的照片，所述集落在共培养7日后从SB处理的CD34+祖细胞和从第9日EB群体分选后直接铺板的CD43+原始祖细胞(CD43+)生成。箭头指示小的、原始红细胞样集落。原始放大率：集落×100；细胞×1000。(E).RT-qPCR-分析CD34+-和CD34-CD43+-衍生的红细胞样集落的汇集物中β-和ε-珠蛋白表达。标度代表样品均值±均值的标准差，所述样品来自n≥7单独分离的集落。星号表示如通过t-检验所确定的统计显著性；*(p≤0.05)**(p≤0.01)。
图7显示hiPSC衍生的CD34/CD43群体的造血潜能。(A)hiPSC衍生的SB处理和活化素A诱导的CD34+群体的流式细胞计数分析。(B)在分化第9日和第11日2种hiPSC CD34+群体的祖细胞潜能。(C)SB处理和活化素A诱导的群体的流式细胞计数分析，其显示CD4+细胞和CD8+细胞在所示的时间出现。在第28日，CD8+CD4+群体共表达CD3。(D)显示hESC分化培养物中出现原始造血和终末造血的模型。原始造血在分化第2日和第4日之间依赖于活化素/nodal信号传导并且在分化第6日从CD34+CD43+祖细胞发育。原始造血程序作为截止分化第9日可以检测到的CD43+CD41a+CD235a+群体形成。终末造血在分化第2日和第4日之间不依赖于活化素/nodal信号传导，在早至第6日特化，但是不扩充直至第12日，在此阶段，将它作为不表达CD41a和CD235a的CD43+CD45+群体检测到。
图8显示PSC衍生的T细胞群体中的TCR Dβ2-Jβ2重排。基于PCR的分析显示hESC和iPSC衍生的T细胞群体中的TCR Dβ2-Jβ2重排。分别使用人出生后胸腺细胞和293T成纤维细胞作为重排的和未重排的种系对照。箭头–种系PCR产物。星号–源自TCR重排的PCR产物。
图9显示CD34+祖细胞的造血潜能。在诱导第2日或第3日用活化素A或SB处理的第9日EB上CD34和CD43表达的流式细胞分析。
图10显示在OP9-DL1共培养后SB处理的CD34+群体的髓样潜能。显示不同类型髓样集落的照片，其中所述髓样集落在OP9-DL1细胞上共培养7日后从SB处理的CD34+细胞生成。Mast：由具有嗜碱性颗粒的细胞组成的集落，GM：由巨噬细胞和嗜中性粒细胞组成的集落，嗜中性粒细胞：由嗜中性粒细胞组成的集落。原始放大率：集落×100，细胞×1000。
详细说明
从人多潜能干细胞(PSC)高效生成造血干细胞依赖于分化期间终末造血程序的适宜特化。我们使用T淋巴细胞潜能追踪无血清和无间质培养物中终末造血从人胚胎PSC和用特定形态发生素诱导的诱导型PSC中的启动。我们显示这种程序从具有生血内皮特征的祖细胞群体形成，所述特征包括CD34、VE-钙黏着蛋白、GATA2、LMO2和RUNX1的表达。与T细胞一起，这些祖细胞显示生成髓样细胞和红细胞样细胞的能力。在分化早期期间操纵活化素/nodal信号传导揭示，终末造血祖细胞群体的形成不依赖于这个途径，从而使其与原始造血区分。总体上，这些研究结果显示可以从PSC生成T淋巴样祖细胞并且这种谱系从一个群体形成，所述群体的出现标志人终末造血的启动。
在一个方面，提供一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，所述方法包括：在人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞的群体中诱导造血性分化；基于CD43和CD34、CD31和CD144中至少一者的表达分选该群体；并且选择作为CD34+CD43-、CD31+CD43-和CD144+CD43-中至少一者的级分。在一些实施方案中，在约第6日和约第13日之间进行分选。在一些实施方案中，在约第10日进行分选。
如本文所用，“干细胞”指可以分裂(通过有丝分裂)并分化成多样性特化细胞类型并且可以自我更新以产生更多干细胞的细胞。干细胞包括而不限于全能、多潜能、多能、寡能和/或单潜能干细胞。
如本发明上下文中所用，术语“富集”包括增加细胞群体中一种或多种 所希望的细胞类型的相对丰度的任何分离或分选过程。在一个实施方案中，富集的细胞群体是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所希望细胞类型。
如本文所用，“胚胎干细胞”或“ES细胞”是从胚泡(早期胚胎)的内部细胞团衍生的多潜能干细胞。ES细胞是多潜能的，即，而不限于，它们能够分化成三种原胚层：外胚层、内胚层和中胚层的全部衍生物。这些原胚层包括成人身体中每种多于220个细胞类型。多能性使胚胎干细胞与成人中存在的成人干细胞区分；胚胎干细胞可以生成全部胚层的细胞，而成人干细胞是多能的并且可以仅产生有限数目的细胞类型。人ES细胞大约测量为14μm而小鼠ES细胞接近于8μm。另外，在限定条件下，胚胎干细胞能够无限自我增殖。在一些例子中，将胚胎干细胞作为胚胎干细胞系维持。
如本文所用，“诱导型多潜能干细胞”指通过诱导特定基因“受迫”表达而从非多潜能细胞、一般成体体细胞人工衍生的任何多潜能干细胞。
如本文所用，“造血干细胞”和/或“造血祖细胞”指能够形成任何成熟髓样和/或淋巴样细胞的细胞。造血干细胞可以源自骨髓、肝、脾、动员的外周血或脐带血。
在人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞群体中诱导造血性分化的方法是本领域技术人员已知的，例如，如描述于1)Kennedy,M.,D’Souza,S.L.,Lynch-Kattman,M.,Schwantz,S.和Keller,G.(2007).Development of the hemangioblast defines the onset of hematopoiesis in human ES cell differentiation cultures.Blood109,2679-2687；2)Chadwick,K.,Wang,L.,Li,L.,Menendez,P.,Murdoch,B.,Rouleau,A.和Bhatia,M.(2003).Cytokines and BMP-4promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells.Blood102,906-915；3)Ng,E.S.,Davis,R.P.,Azzola,L.,Stanley,E.G.和Elefanty,A.G.(2005).Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust,reproducible hematopoietic differentiation.Blood106,1601-1603.)；4)Davis,R.P.,Ng,E.S.,Costa,M.,Mossman,A.K.,Sourris,K.,Elefanty, A.G.和Stanley,E.G.(2008).Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors.Blood 111,1876-1884；5)Vodyanik,M.A.,Thomson,J.A.和Slukvin,II(2006).Leukosialin(CD43)defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.Blood108,2095-2105；6)Yu,C.,Liu,Y.,Miao,Z.,Yin,M.,Lu,W.,Lv,Y.,Ding,M.和Deng,H.(2010).Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors.Blood116,4786-4794；和7)Zambidis,E.T.,Peault,B.,Park,T.S.,Bunz,F.和Civin,C.I.(2005).Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial,primitive,and definitive stages resembling human yolk sac development.Blood106,860-870。
如本文所用，细胞“分选”指根据如本领域技术人员将已知的指定标准(包括但不限于差异性染色和标志物表达)将细胞分选成组的操作，例如，使用FACS分选。可以使用任何数目的区分特化标准的方法，包括但不限于标志物抗体和染色染料。
如本文所用，“表达”或“表达水平”指表达产物的可度量水平，如，而不限于，表达的信使RNA转录物的水平或特定外显子或转录物其他部分的水平、表达的蛋白质或其部分的水平、生物标记的DNA多态性的数目或存在、生物标记的酶促活性或其他活性和特定代谢物的水平。
在优选的实施方案中，诱导造血性分化在无血清条件下实施。
在一些实施方案中，诱导造血性分化在无间质条件下实施。
如本文所用“间质”指支持组织或基质。例如，间质可以用于扩充细胞群体。本领域技术人员将理解基质类型适于扩充特定的细胞类型。基质的例子包括MS-5、OP9、S17、HS-5、AFT024、SI/SI4、M2-10B4。
在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与BMP4一起培养， 优选地在第0日和第4日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约10ng/ml BMP4一起培养。
在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与bFGF一起培养，优选地在第1日和第8日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约5ng/ml bFGF一起培养。
在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与VEGF、IL-6和IL-11和/或它们的组合中至少一者一起培养，优选地在第3日和第13日之间，进一步优选地在第4日和第9日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约15ng/ml VEGF一起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约10ng/ml IL-6一起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约5ng/ml IL-11一起培养。
在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与SCF和EPO至少一者一起培养，优选地在第4日和第13日之间，进一步优选地在第6日和第9日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约50ng/mlSCF一起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约2U/mlEPO一起培养。
在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与TPO、Flt-3和IL-3和/或它们的组合中至少一者一起培养，优选地在第6日和第13日之间，进一步优选地在第8日和第9日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约30ng/ml TPO一起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约10ng/ml FLT-3一起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约30ng/ml IL-3一起培养。
在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与高达1ng/ml、优选地约0.3ng/mL和进一步优选地约0ng/mL活化素A一起培养。
在一些实施方案中，诱导造血性分化包括抑制活化素/nodal信号传导。在优选的实施方案，抑制活化素/nodal信号传导包括将群体与活化素/nodal抑制剂、优选地SB-431542一起培养。在一些实施方案中，用约6μMSB431542抑制活化素/nodal信号传导。在另一个实施方案中，“Lefty”用 来抑制nodal。在一些实施方案中，将抑制剂在分化第1.5日和第5日之间或在第2日和第4日之间或约第1.75日添加至细胞培养物。
“Lefty”指TGF-β生长因子家族的蛋白质成员；例如Lefty1和Lefty2。
TGF-β信号传导途径的其他抑制剂是本领域已知的，例如并且不限于TGF-βRI抑制剂SD208、D4476、SB505124、GW788388和SJN2511和活化素A抑制剂卵泡抑素。
在一些实施方案中，在分化约第6日和约第13日之间、优选地在分化约第7日和约第10日之间进行分选。
在一些实施方案中，基于CD43和CD34的表达分选群体并且选择的级分是CD34+CD43-。
在一些实施方案中，基于CD43和CD31的表达分选群体并且选择的级分是CD31+CD43-。
在一些实施方案中，基于CD43和CD144的表达分选群体并且选择的级分是CD144+CD43-。
在又一个方面，提供了使用本文所述方法获得造血祖细胞群体。
在又一个方面，提供一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，所述方法包括在造血性分化期间抑制活化素/nodal信号传导。在一个实施方案中，抑制活化素/nodal信号传导包括将群体与活化素/nodal抑制剂SB-431542一起培养。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第1日和约第5日之间添加至群体。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第2日和约第4日之间添加至群体。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第1.75日添加至群体。在一些实施方案中，在约第6日和约第13日之间分选细胞。在一些实施方案中，在约第7日和约第10日之间分选细胞。在一些实施方案中，将细胞分选并且选择的细胞是CD34+CD43-、CD31+CD43-和/或CD144+CD43-。在一些实施方案中，将造血祖细胞的干细胞群体富集大于约以下任一个百分数：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％。
在又一个方面，提供活化素/nodal抑制剂用于富集造血祖细胞的正在 经历造血性分化的干细胞群体的用途。在一个实施方案中，活化素/nodal抑制剂是SB-431542。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第1日和约第5日之间添加至群体。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第2日和约第4日之间添加至群体。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第1.75日添加至群体。在一些实施方案中，在约第6日和约第13日之间分选细胞。在一些实施方案中，在约第7日和约第10日之间分选细胞。在一些实施方案中，将细胞分选并且选择的细胞是CD34+CD43-、CD31+CD43-和/或CD144+CD43-。在一些实施方案中，将造血祖细胞的干细胞群体富集大于约以下任一个百分数：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％。
在一个实施方案中，将群体与1μM至10mM之间、1μM至1mM或约6μM的活化素/nodal抑制剂一起培养。
本发明的优点由以下实施例进一步说明。提出本文中所述的实施例及其具体细节仅在于说明并且不应当解释为限制本发明的权利要求。
实施例
材料和方法
人ES和iPS细胞的维持和分化
这项研究中使用hESC系H1(Thomson等人，1998)和再编程的人iPS细胞系(MSC-iPS1；(Park等人，2008))。如先前所描述，将它们在hESC培养基中的照射的小鼠胚胎成纤维细胞上维持(Kennedy等人，2007)。在分化之前，通过在hESC培养基中基质胶(BD Biosciences，Bedford，MA)上培养24至48小时，使细胞耗尽饲养细胞。为生成EB，将hPSC用胶原蛋白酶B(1mg/ml；Roche，印第安纳波利斯，IN)处理20分钟，接着是一个短暂的胰蛋白酶-EDTA(0.05％)步骤。用细胞刮刀温和地刮取细胞以形成小聚集物(10-20个细胞)。使聚集物重悬于补充有青霉素/链霉素(10ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)，抗坏血酸(1mM)、硫代甘油(MTG，4×10-4M；Sigma)和转铁蛋白(150μg/ml)的StemPro-34(Invitrogen)中。如所示添加 BMP-4(10ng/mL)、bFGF(5ng/mL)、活化素A、6μM SB-431542、VEGF(15ng/mL)、Dkk(150ng/mL)、IL-6(10ng/mL)、IGF-1(25ng/mL)、IL-11(5ng/mL)、SCF(50ng/mL)、EPO(2U/mL终浓度)、TPO(30ng/mL)、IL-3(30ng/mL)和Flt-3L(10ng/mL)。将培养物在5％CO2/5％O2/90％N2环境中维持前8日并且随后转移至5％CO2/空气环境。全部重组因子是人的并且从R&D Systems(Minneapolis，MN)购买。
用于T-谱系分化的OP9-DL4共培养物
生成经逆转录病毒转导以表达δ样4的OP9细胞(OP9-DL4)并在如先前所描述的补充有青霉素/链霉素和20％FBS的α-MEM培养基(OP9培养基)(La Motte-Mohs等人，2005；Schmitt等人，2004)中维持。将5-10×104个分选的人EB衍生的子集添加至含有OP9-DL4细胞的6孔平板的各个孔，并且在补充有rhFlt-3L(5ng/ml)和rhIL-7(5ng/mL)的OP9-培养基(Peprotech，Rocky Hill，NJ)中培养。仅前8日添加rhSCF(100ng/mL)。每5天，通过剧烈抽吸并穿过40μm细胞滤网以移除间质细胞，将共培养物转移到新鲜的OP9-DL4细胞上。
用于红细胞样/髓样分化的OP9-DL1共培养物
将分选的细胞以每孔2×104个细胞的浓度在24孔平板中OP9培养基内的照射的OP9-DL1单层上培养7日，所述OP9培养基具有VEGF(5ng/ml)、TPO(30ng/mL)、SCF(50ng/mL)、Flt3(10ng/mL)、IL-11(5ng/mL)和BMP-4(10ng/mL)。如上文那样收获细胞。
再聚集测定法
将分选的群体以25×104个细胞/ml重悬于第6日培养基中(图1A)并将50uL添加至低簇集96孔板中的板孔。次日，汇集2孔/条件并转移至添加1mL培养基的低簇集24孔平板中。24小时后，添加第8日培养基至所述孔并移至常氧条件。
T细胞活化
将SB处理的CD34++CD43-细胞在OP9-DL4细胞上共培养37-40日。在刺激时，将共培养物接种到12孔平板的各个孔中的新鲜OP9-DL4细胞 上。全部孔均接受补充有2ng/ml rhIL-7和rhIL-2的OP9培养基并且受刺激的孔接受添加5μg/mlα-CD3(克隆HIT3a)mAb和1μg/mlα-CD28(克隆28.2)mAb。在4日后，进行流式细胞术。
流式细胞术和细胞分选
以下抗体用于这些研究：CD3-APC(克隆UCHT1)、CD4-APC-EFluor750(克隆RPA-T4)、CD5-PE-Cy7(克隆L17F12)、CD7-FITC(克隆M-T701)、CD8-eFluor-650NC(克隆RPA-T8)、CD31-FITC(克隆WM59)、CD33-FITC(克隆HIM3-4)、CD34-APC(克隆8G12)、CD34-PE-CY7(克隆4H11)、CD41-APC(克隆HIP8)、CD42b-PE(克隆HIP1)、CD43-PE(克隆1G10)、CD45-APC-eFluor750(克隆2D1)或CD45-PacificBlue(克隆H130)、CD56-PE-Cy7(克隆B159)、CD90-APC(克隆5E10)、CD117-APC(克隆104D2)、CD144-PE(克隆123413)、KDR-PE(克隆89106)、TCRγδ-FITC(克隆11F2)、TCRαβ-PE(克隆T10B9.1A-31)。使用LSRII(BD Biosciences)流式细胞仪在所示的时间点分析染色的细胞。使用FlowJo软件执行数据分析。对于T淋巴样研究，通过以下方式实施分析：在活细胞上门控并缺少6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)摄入，随后在表达CD45的细胞上门控。全部抗体均从BDBiosciences(San Diego，CA)购买，例外为：CD8eFluor-650NC和CD34-PE-CY7从Bioscience(San Diego，CA)购买并且KDR从R&DSystems购买。将细胞用FACSAriaTMII(BD)细胞分选仪在Sick Kids/UHN流式细胞术设施分选。
T淋巴样前体频率分析
通过连续稀释，进行活化素A诱导或SB处理的EB分离的CD34+CD43-细胞的有限稀释法测定法(LDA)。使用FACSAria细胞分选仪从EB群体分选CD34+CD43-，并且将活化素A处理的子集的10000个(n＝22)、3000个(n＝54)、1000个(n＝57)、300个(n＝84)或100个(n＝90)细胞或SB处理的子集的10000个(n＝21)、3000个(n＝54)、1000个(n＝60)、300个(n＝83)、100个(n＝114)或30个(n＝48)细胞沉积到96孔平板的含 有OP9-DL4细胞的各个孔中。在收获和流式细胞分析之前16日培养祖细胞。对CD45+CD7+CD43+CD5+细胞的存在打分。通过适用于泊松模型(Groth，1982)的最大可能性方法确定祖细胞频率。
造血集落测定法
如先前详述(Kennedy等人，2007)，通过在含有特定细胞因子的1％甲基纤维素中铺种5×103-2.5×104分选的细胞或2.5×104-5.0×104未分级分离的EB群体，进行造血集落潜能的分析。在10-14日后定量由红细胞样细胞、红细胞样/髓样细胞和髓样细胞(巨噬细胞或肥大细胞)组成的集落。
定量实时PCR
用RNAqueous RNA分离试剂盒(Ambion)制备总RNA并用无RNA酶的DNA酶(Qiagen)处理。使用随机六聚物和寡聚dT连同Superscript III逆转录酶(Invitrogen)将100ng至1ug RNA转录成cDNA。在MasterCycler EP RealPlex(Eppendorf)上进行实时定量PCR。使用SYBR绿色JumpStart Taq ReadyMix(Sigma)，全部实验均一式三份实施。当需要时，可获得寡核苷酸序列。将基因表达评价为相对于对照的ΔCt(ACTB)。
蛋白质印迹
在分化第2日添加DMSO、活化素A和/或SB后30分钟，将孔收获并使用RIPA缓冲液在冰上裂解。将蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上并用Smad2(Cell Signaling，1:1000)和磷酰-SMAD2抗体(Millipore，1:1000，Ser465/467)探测过夜。使用LI-COR BiosciencesOdyssey成像系统扫描该膜。
T细胞受体重排的PCR分析
使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒从活化素A或SB处理的CD34+CD43-/OP9-DL4共培养物分离基因组DNA。在含有1.5mM MgCl2，1U Taq聚合酶，10mM dNTP和400nM每种先前公开的引物(Timmermans等人，2009)的25μL反应缓冲液中通过聚合酶链反应(PCR)持续30个循环(95℃1分钟；66℃2分钟；和72℃5分钟)扩增基因组 DNA(200ng)，检测Dβ2-Jβ2T细胞受体基因重排。使用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，分别使用293T成纤维细胞和人出生后胸腺细胞(PNT)作为种系对照和重排对照。
结果和讨论
hESC的无血清和无间质造血性分化
为了在无血清和无间质条件下生成终末造血程序的祖细胞，我们在化学上确定成分的培养基中用优化的时期特异的BMP-4、活化素A、bFGF和VEGF组合连同造血细胞因子一起诱导H1hESC分化作为胚状体(EBs)(图1A)。采用这种诱导方案，早至分化第6日即检测到集落形成细胞。它们的数目在接下来的3日内适度增加并且随后到分化第11日大幅度增加，此后到第15日下降至低水平(图1B)。在这些时期检测到的大部分祖细胞是红细胞样限制的，不过也存在少数多能红细胞样-髓样细胞和髓样集落形成细胞。红细胞样祖细胞的优势及它们的短暂发育样式表明这种早期造血群体可以代表人原始造血。
由于活化素/nodal信号传导是mESC培养物中原始造血形成所需要的(Nostro等人，2008；Pearson等人，2008)，我们接着变动活化素A浓度以确定这个途径是否影响hESC衍生的造血(图1C)。渐增浓度的活化素A导致第13日EB中检测到的髓样祖细胞减少和红细胞样祖细胞增加。与之相反，通过添加活化素/nodal抑制剂SB-431542(SB；(Inman等人，2002))抑制该途径消除了几乎全部红细胞样祖细胞(图1C)。这些观察结果表明这种早期红细胞样祖细胞群体的发育受分化第2日和第4日之间活化素/nodal信号传导的水平影响。鉴于0.3ng/ml活化素A有效地诱导髓样细胞和红细胞样祖细胞，除非另外说明，否则我们将这个浓度用于后续研究。
在限定的时间点对EB分析先前显示在hESC-分化培养物中所发育的最早造血细胞上表达的CD34、CD43、CD41和CD45细胞表面标记物表达(Vodyanik等人，2006)。截止分化第6日检测到庞大的CD34+细胞群体。这个群体在尺寸上在后续9日内稳定缩减并且截止第15日不再可检测到(图1D)。截止第9日，CD43+细胞出现，此时CD34和CD43表达模式与 其他人报道的表达模式相似(Timmermans等人，2009；Vodyanik等人，2006)。CD34+CD43+群体随时间推移缩减，而CD34-CD43+群体增加。截止分化第9日，CD41+细胞出现，而未以显著水平检测到CD45+细胞直至第13日。
CD34/CD43群体的造血潜能
由于在分化第9日观察到的曲线(图2A)最类似于Timmermans等人(2009)鉴定T细胞祖细胞的阶段，我们接着通过集落测定法和表面标志物表达，分析来自这个阶段的不同CD34/CD43级分的造血潜能。将全部红细胞样细胞、髓样细胞和红细胞样/髓样祖细胞均分裂成CD43+级分(图2B)分离，从而证实来自早期研究的发现(Timmermans等人，2009；Vodyanik等人，2006)。P1(CD34+CD43-)和P5(CD34-CD43-)均不含有任何集落形成细胞。大部分从CD43+祖细胞生成的红细胞样集落是小的，形态紧密，并且含有表达高水平ε-珠蛋白和很低水平β-珠蛋白的有核大细胞(图6D，E)，这表明它们是原始成红细胞。
先前研究已经显示CD41a和CD235a的共表达鉴定了含有原始红细胞样细胞和巨核细胞祖细胞的hESC培养物中早期正在形成的群体(Klimchenko等人，2009；Vodyanik等人，2006)。流式细胞计数分析显示CD41a和CD235a在还排他性含有红细胞样祖细胞的CD43+P3和P4群体上广泛地表达。CD45表达限于P2和P3级分的小子集并且从未与CD235a共表达(图2C并且数据未显示)。P1和P5级分中的细胞不表达这些标志物的任一者。总之，这些观察结果与先前描述的那些一致并且支持如下解释：CD41a和CD235a的早期表达标志着人原始造血的出现。
CD43+CD41a+CD235a+群体从CD34+祖细胞形成
我们接下来致力于确定在限定条件下生成的原始红细胞样群体是否源自CD34+中间体，因为一项早先研究已经显示在血清诱导的培养物中hESC衍生的最早造血细胞从CD34+祖细胞形成(Vodyanik等人，2006)。为解决这个问题，我们在分化第6日(一个在CD43+CD41a+CD235a+原始群体扩充之前的阶段)分析祖细胞。将这个时期时检测到CD34+CD43-群体和 较小CD34+CD43+群体(图2D)分选、再聚集、培养额外3日(总计9日)并且随后分析。整个CD34+CD43+衍生的群体表达CD43并且大部分的这些细胞共表达CD41a和CD235a(图2D，下半小图)。与之相反，仅50％的CD34+CD43-衍生群体表达CD43并且这些群体中，大约60％共表达的CD41a和CD235a(中部小图)。与这些差异一致，CD34+CD43+群体生成比CD34+CD43-群体生成多13倍的祖细胞(图2E)，其中大部分是原始红细胞样细胞。CD34+CD43-群体产生优势髓样的祖细胞。总之，这些数据清晰地显示人原始造血从分化培养物中早至第6日出现并且可以通过共表达CD43予以鉴定的CD34+祖细胞形成。
CD34/CD43级分的终末造血潜能
RT-qPCR分析揭示确定小鼠ESC分化模型中出现终末造血(Irion等人，2010)的SOX17在P1细胞中以最高水平表达，在P2细胞中以较低的程度表达并且在P3和P4原始群体中完全不表达(图2F)。LMO2和GATA2在全部群体中均表达，而GATA1表达在含有最高频率红细胞样祖细胞的P4衍生群体中最高。
为进一步评估第9日CD34+/CD43+群体的永久潜能，通过在OP9-DL4上共培养这些群体，测定每个群体的T细胞潜能(Schmitt等人，2004)。仅在P1中检测到T细胞祖细胞(图3A)，这与这些细胞表达最高水平SOX17的观察结果一致。在OP9-DL4间质上培养2周后，P3和P4级分未能生成任何CD45+细胞，而P2细胞在2周时产生可检测但未发生T-淋巴细胞生成的短暂CD45+群体(图3A)。P1细胞在早至培养第14日生成CD5+CD7+T细胞祖细胞，截止第28日生成CD4+CD8+T细胞并且在第42日生成表达TCRαβ+或TCRγδ+的CD3+T细胞(图3B、C)。为进一步表征T细胞发育的程度，我们对来自共培养的细胞的基因组DNA分析TCR Dβ2-Jβ2重排的存在。如图8中所示，hESC衍生的T细胞含有多种PCR产物，从而表明多克隆性Dβ2-Jβ2重排。本文描述的来自hESC衍生的CD34+/OP9-DL4培养物的早期和晚期T-谱系分化标志物的表达模式与一般使用脐带血衍生的HSC所观察到的表达模式相似(Awong等人，2009)。
EB发育的时间分析揭示在分化第6日的CD34+群体还含有具有T细胞潜能的祖细胞(图3D)，在第11日的CD34+CD43-和CD34+CD43low群体也是如此(图3E)。在这个阶段鉴定到的CD34+CD43low群体可能类似于先前描述的T祖细胞群体(Timmermans等人，2009)。与之相反，第3日KDR+血液血管母细胞群体不产生T细胞，这表明具有淋巴样潜能的祖细胞有时在分化第3日和第6日之间形成(数据未显示)。
来自这些分析的研究结果一起显示在分化第9日，终末造血祖细胞(如通过T细胞潜能所定义)限于CD34+CD43-群体并且区别于CD43+原始造血群体。
对活化素/nodal信号传导的要求区分原始造血和终末造血
由于已知活化素/nodal信号传导在mESC分化培养物中的原始造血方面发挥作用(Nostro等人，2008；Pearson等人，2008)并且我们在此的较早研究结果显示红细胞样祖细胞的早期波需要它(图1C)，我们接着致力于确定我们是否可能通过适当分期的途径抑制作用选择性阻断整个CD43+/CD41a+/CD235a+群体的形成。分化前24小时内添加时，活化素/nodal抑制剂SB彻底阻断对分化第5日检测到的KDR+CD34+造血中胚层群体的诱导(图4A)，这与已知原条/中胚层形成需要这个途径一致(Conlon等人，1994)。然而，如果推迟添加SB并且在分化第2日和第4日之间添加，则KDR+和CD34+群体正常形成并且在大小方面类似于活化素A诱导的群体中的那些群体(图4C)。蛋白质印迹分析显示在第2日EB中存在磷酸-SMAD2，这表明内源性活化素/nodal信号传导在这个阶段有活性(图4B)。光密度测定法证实磷酸-SMAD2的水平在SB处理后显著地降低，这表明SB阻断活化素/nodal信号传导。第9日EB的分析揭示在第2日和第4日之间抑制该途径彻底阻断CD43+群体形成，但是似乎不影响CD34+细胞(图4C)。在第9日彻底抑制CD43+群体依赖于在分化第2日添加SB，因为推迟直至第3日导致一些CD43+细胞形成(图9)。截止培养第12日，一个巨大的CD43+群体从SB处理的EB形成。然而，与从活化素A诱导的EB衍生的那些细胞相反，这些细胞不表达CD41a或CD235a，但是表 达CD45(图4C)。SB处理的CD43+群体的标志物谱在培养的第12日和第16日之间不变化。如预期，在第9日，大部分活化素A诱导的群体共表达CD41a和CD235a。
与不存在CD43+CD41a+CD235+群体一致并与我们的较早观察结果一致，在此分析的任何时间点在SB处理的EB中均未检测到红细胞样祖细胞(图4D)。RT-qPCR分析揭示从SB处理的EB分离的CD34+群体比活化素A诱导的EB中生成的CD34+CD43-群体表达更高水平的SOX17和AML1C(图4E)。这两个群体中MO2、GATA1、GATA2和HOXB4的表达水平是可比较的。
与活化素A诱导的CD34+细胞相似，在OP9-DL4细胞上培养时，SB处理的第9日CD34+祖细胞生成T细胞(图5A)。有趣地，有限稀释分析揭示SB处理的CD34+群体中T细胞祖细胞的频率比活化素A诱导的CD34+CD43-群体中高3倍(表1)，这表明早期抑制分化培养物中的原始造血程序与富集第9日CD34+群体中的T细胞祖细胞重合。如采用从活化素A诱导的祖细胞生成的T细胞所观察到，从SB处理的CD34+细胞衍生的T细胞还显示多克隆性Dβ2-Jβ2重排(图8)。截止共培养第36-43日，大部分细胞显示出TCRβ重排，如种系条带丢失所显示。
表1.活化素A处理或SB处理的CD34+细胞的祖细胞频率分析
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a从用活化素A或B处理的EB培养物所获得的分选的CD34++CD43-置于含有OP9-DL4细胞96孔/平板的孔中，并且在收获用于流式细胞分析之前培养16日。
b基于CD45+CD43+CD7++CD5+染色评定各个孔的T细胞存在。借助 适用于泊松模型的最大可能性方法进行统计分析。
为了确定这些T细胞是否有功能，将培养35-40日的细胞用可溶性α-CD3和α-CD28抗体刺激4日。如图5B中所示，与对照细胞相比，刺激的CD3+T细胞显示前向散射增加，所述前向散射增加反映指示活化早期的大小增加(June等人，1990)。α-CD3/α-CD28诱导的细胞还表达显著更高水平的CD25和CD38(在活化的人T细胞上经典上调的两种标志物)(P≤0.01)(Funaro等人，1990；Schuh等人，1998)。而且，与正常人T细胞活化一致，在刺激的hESC衍生的T细胞上观察到CD45RO同工型的增加(图5B)。活化标志物表达的这些变化显示hESC衍生的T细胞携带能够感知并响应于刺激的功能性T细胞受体。与展示广泛TCR重排一起，功能性T细胞受体的存在表明hESC衍生的T细胞正在经历正常成熟。
总之，来自这些研究的发现显示早期抑制活化素/nodal途径阻断原始造血，同时增强终末CD34+群体的T细胞潜能。它们还显示在SB处理的EB中形成的CD43+群体在CD41a和CD235a表达方面不同于第9日活化素A诱导的群体，并且因而允许我们确定CD43形成的不同原始阶段和确定阶段。
CD34+群体的造血潜能
活化素A诱导的(未显示))和SB处理的终末CD34+群体共表达CD31、KDR和VE-CAD(HE上存在的标志物)(综述见(Tavian等人，2010))以及CD90和CD117(在CD34+脐带血衍生的HSC上存在的标志物)(图6A；(Doulatov等人，2010；Notta等人，2011))。然而，这些群体不表达CD45。为确定该群体除T细胞潜能之外是否还展示髓样潜能和红细胞样潜能，将细胞在OP9-DL1间质细胞上在造血细胞因子存在的情况下培养。使用OP9-DL1细胞而不是正常情况下用于扩充造血细胞的野生型OP9细胞(Feugier等人，2005)，因为我们发现它们支持更高数目的红细胞样祖细胞的发育(未显示)。在共培养7日后，活化素A诱导的CD34+细胞生成CD43+CD45+群体，以及小的CD41a+群体。CD42b在这些CD41a+细胞的一些细胞上的共表达表明它们代表正在发育的巨核细胞。SB处理的CD34+ 细胞产生不表达显著水平的CD41a或CD235a的CD43+CD45+群体(图6B)。
在共培养7日后，CD34+CD43-群体还获得红细胞样潜能和髓样祖细胞潜能(图6C)。有趣地，SB处理的细胞比活化素A诱导的祖细胞生成显著更高数目的红细胞样祖细胞和红细胞样-髓样祖细胞，表明除T细胞祖细胞之外，这个群体还在红细胞样/髓样潜能方面富集。从共培养物生成的红细胞样祖细胞产生了实质上大于第9日CD43+衍生的原始红细胞样集落的集落(图6D)。虽然两种集落类型均含有有核的红细胞(图6D，下半小图)但是CD34+-OP9-DL1共培养衍生的集落表达比CD43衍生的原始集落显著更高量的β-珠蛋白(图6E)。观察到ε-珠蛋白表达的相反模式，不过大集落仍表达显著水平的这种珠蛋白。CD34+衍生的髓样群体由巨噬细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞谱系的祖细胞组成(图10)。总体上，来自这些共培养研究的研究结果清晰地显示除T细胞潜能之外，CD34+终末群体还显示红细胞样潜能和髓样潜能。
来自iPSC的终末造血发育
为了确定上文描述的定向分化过程是否可以适用于其他人多潜能干细胞系，我们诱导如图1A中的iPSC系MSC-iPS1(Park等人，2008)。如图7(A、B)中所示，分化导致形成预期的CD34+/CD43+群体和CD34+/CD41+群体，以及一系列红细胞样、红细胞样/髓样和髓样祖细胞。在第2日至第4日之间添加SB抑制了CD41+/CD43+群体和红细胞样祖细胞及红细胞样-髓样祖细胞的形成，如采用hESC系观察到的。另外，通过活化素A或SB分化条件产生的CD34+细胞生成了共表达CD3(图7C)并显示Dβ2-Jβ2TCR重排(图8)的CD4+CD8+T细胞。总之，这些观察结果显示T细胞发育和分级操作活化素/nodal信号传导的组合可以用来在hiPSC培养物中鉴定并富集终末造血祖细胞并且将它们与原始造血祖细胞区分。
从hPSC衍生出HSC将需要确立发育程序的策略，所述发育程序在早期胚胎中产生这个群体。来自使用不同模式生物的研究的深刻理解勾勒了导致HSC生成的发育进程，所述发育进程包括诱导称作HE的终末造血祖 细胞群体和这个群体随后向造血命运特化，产生多能祖细胞和可移植的细胞。在PSC分化培养物中恢复胚胎造血作用的主要挑战是两种造血程序不是空间上分离的，并且因此，早期原始造血的优势造成难以在终末造血祖细胞形成时鉴定它们。在这项研究中，我们使用T细胞潜能追踪来自hPSC的终末造血启动，并且与此同时，基于发育潜能、细胞表面标记物和活化素/nodal信号传导依存关系鉴定可以与原始造血程序区别的终末造血程序。
终末CD34+群体的表达谱(其包括转录因子GATA2、LMO2、AML1C以及内皮表面标志物(KDR、CD31、VE-CAD)、但不包括造血(CD45或CD43)表面标志物)表明它代表人HE的等同物。生成带这些特征的拥有T细胞潜能的群体是独一无二的并且代表生成HSC中的关键第一步骤。一些其他研究已经描述了显示造血潜能的hESC衍生的内皮祖细胞群体(Choi等人，2012；Hong等人，2011；Wang等人，2004；Zambidis等人，2005)。在更新近的这些报道中，Choi等人(2012)鉴定了似乎区别于原始造血程序的祖细胞BL-CFC(血管母细胞)的生血内皮祖细胞(HEP)。然而由于在这项研究或任何其他研究中未评价淋巴样潜能，不清楚这些群体是否代表终末造血程序的祖细胞。
在OP9-DL1上共培养7日后，CD34+群体上调CD43和CD45的表达并且获得红细胞样和髓样祖细胞潜能(可以代表HE向造血命运特化的等同物的转变)。我们的研究已经显示OP9-DL1间质在促进红细胞样祖细胞发育方面比OP9间质更高效，显示Notch信号传导可能是这个特化步骤需要的。CD34+衍生的红细胞样祖细胞生成与活化素诱导的CD43+衍生原始红细胞样集落在形态学不同并且表达较之显著更高水平β-珠蛋白的巨大红细胞样集落。这些观察结果连同它们从表型和时间上不同的群体发育的事实清楚地显示这些红细胞样祖细胞不是相同的。先前研究已经描述不同红细胞样祖细胞随时间推移在血清诱导的EB中出现并且提出它们代表原始造血和终末造血的子代(Chadwick等人，2003；Zambidis等人，2005)。本文描述的CD34+衍生的红细胞样祖细胞区别于CD43+衍生的原始祖细 胞，但是它们仍表达高水平的ε-珠蛋白。CD34+衍生的祖细胞可能代表原始程序之外的一个步骤：在原始红细胞生成和终末红细胞生成之间的转变。
随着在第9日EB中鉴定CD34+永久祖细胞，我们首次能够确定显示以下特征的不同人终末造血群体和原始造血群体(模型；图7D)。首先，在第9日出现的原始造血的群体表达CD43连同CD41a和CD235a，而在第9日后形成的终末群体表达CD43连同CD45，但是不表达CD41a或CD235a。CD41a和CD235a在终末程序中较晚表达，而它们分别限于巨核细胞和红细胞样谱系(Andersson等人，1981；Phillips等人，1988)。其次，人原始造血程序的形成依赖于活化素/nodal信号传导超出分化第2日。相比，终末造血在分化第2日和第4日之间不需要这个途径。第三，原始造血和终末造血均从CD34+祖细胞发育。CD43+与CD34在第6日的共表达似乎限定原始程序的启动，因为大部分原始红细胞样祖细胞衍生自这个群体。两种程序均从CD34+祖细胞发育的事实清楚地表示，这种标志物不足以监测PSC分化培养物中的造血形成并凸显了需要鉴定在最早发育阶段区分原始祖细胞和终末祖细胞的新表面标志物。
在这项研究中用小分子SB-431542操作活化素/nodal信号传导途径为该途径在hESC培养物中建立造血系的作用以及人终末造血起源提供了新的深入了解。已经鉴定SB-431542为活化素/nodal途径的高度强力和选择性抑制剂，同时未观察到对其他途径或激酶(包括BMP4、ERK、JNK或p38MAPK)的抑制{Inman，2002#48}。我们展示SB降低第2日EB中的磷酸-SMAD2水平(图4B)以及它对红细胞样集落形成具有与活化素A相反的作用(图1B)，这提供强有力的以下证据：SB对原始红细胞样谱系的作用通过抑制活化素/nodal途径来介导并且没有通过未知靶介导。先前研究已经展示活化素/nodal以及BMP-4途径和Wnt途径均在hPSC培养物中的早期诱导步骤中发挥作用，所述早期诱导步骤包括原条形成、中胚层诱导和造血特化(Davis等人，2008；Jackson等人，2010；Kennedy等人，2007；Kroon等人，2008；Sumi等人，2008；Vijayaragavan等人，2009)。 在这份报告中活化素/nodal途径抑制剂的分期添加强化了这个途径在发育早期中的作用，因为在分化第1日和第2日之间添加阻止任何KDR+细胞的发育，表明缺少中胚层形成。额外地，我们的研究记录了先前未鉴定的在人原始造血形成最早期对活化素/nodal信号传导的需求。在这个方面，小鼠和人原始造血似乎相似地受到调节，如先前研究已经表明小鼠原始造血发育还需要这个途径(Nostro等人，2008，Pearson等人，2008)。尽管我们的蛋白质印迹分析显示在第2日EB中存在表明活化素/nodal信号传导的磷酸-SMAD2，但是目前未知介导这种作用的相互作用和/或下游途径。在分化第2日和第4日之间与SB一起添加其他途径的激动剂和/或拮抗剂(包括Wnt、Notch和SHH)对抑制性作用具有很小影响，显示它们未直接参与介导这种作用(数据未显示)。
除阻断原始造血之外，在分化早期添加SB还似乎影响CD34+群体的潜能。与相应的活化素A诱导的群体相比，SB处理的CD34+群体表达更高水平的SOX17和AML1C并且含有更高频率的红细胞样祖细胞和T细胞祖细胞。这些观察结果清晰地显示在分化早期操作信号传导途径可以影响晚期细胞的潜能并且因而凸显对这类研究使用确定的诱导条件和精确的时期特异性方案的重要性。
总之，这里报告的研究结果已经鉴定了显示T-淋巴样、髓样和红细胞样潜能以及表示前HSC群体的表面标志物和基因表达模式的终末造血祖细胞群体。我们假设这里鉴定的终末祖细胞代表从hPSC生成HSC中的第一步骤并且因而提供用于确定调节途径的轻易可用靶群体，所述调节途径控制该群体特化成最早的造血祖细胞和成熟为可移植干细胞。除提供终末造血的标志物之外，在确定的诱导条件下从hPSC生成T细胞的能力为研究这个谱系的发育起源以及这些细胞在体外和体内模型中的功能性潜能提供独特的机会。
虽然本文中已经描述本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将理解，可以对其产生变型而不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围。本文中公开的全部文献均通过引用的方式并入。
参考文献：
Andersson,L.C.,von Willebrand,E.,Jokinen,M.,Karhi,K.K.和Gahmberg,C.G.(1981).Glycophorin A as an erythroid marker in normal and malignant hematopoiesis.Haematology and blood transfusion26,338-344.
Awong,G.,Herer,E.,Surh,C.D.,Dick,J.E.,La Motte-Mohs,R.N.和Zuniga-Pflucker,J.C.(2009).Characterization in vitro and engraftment potential in vivo of human progenitor T cells generated from hematopoietic stem cells.Blood114,972-982.
Bertrand,J.Y.,Giroux,S.,Golub,R.,Klaine,M.,Jalil,A.,Boucontet,L.,Godin,I.和Cumano,A.(2005).Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America102,134-139.
Chadwick,K.,Wang,L.,Li,L.,Menendez,P.,Murdoch,B.,Rouleau,A.和Bhatia,M.(2003).Cytokines and BMP-4promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells.Blood102,906-915.
Choi,K.D.,Vodyanik,M.A.,Togarrati,P.P.,Suknuntha,K.,Kumar,A.,Samarjeet,F.,Probasco,M.D.,Tian,S.,Stewart,R.,Thomson,J.A.等人(2012).Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.Cell reports2,553-567.
Conlon,F.L.,Lyons,K.M.,Takaesu,N.,Barth,K.S.,Kispert,A.,Herrmann,B.和Robertson,E.J.(1994).A primary requirement for nodal in the formation and maintenance of the primitive streak in the mouse.Development(Cambridge,England)120,1919-1928.
Davis,R.P.,Ng,E.S.,Costa,M.,Mossman,A.K.,Sourris,K.,Elefanty, A.G.和Stanley,E.G.(2008).Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors.Blood111,1876-1884.
Doulatov,S.,Notta,F.,Eppert,K.,Nguyen,L.T.,Ohashi,P.S.和Dick,J.E.(2010).Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.Nat Immunol11,585-593.
Dzierzak,E.和Speck,N.A.(2008).Of lineage and legacy:the development of mammalian hematopoietic stem cells.Nat Immunol9,129-136.
Feugier,P.,Li,N.,Jo,D.Y.,Shieh,J.H.,MacKenzie,K.L.,Lesesve,J.F.,Latger-Cannard,V.,Bensoussan,D.,Crystal,R.G.,Rafii,S.等人(2005).Osteopetrotic mouse stroma with thrombopoietin,c-kit ligand,and flk-2ligand supports long-term mobilized CD34+hematopoiesis in vitro.Stem cells and development14,505-516.
Funaro,A.,Spagnoli,G.C.,Ausiello,C.M.,Alessio,M.,Roggero,S.,Delia,D.,Zaccolo,M.和Malavasi,F.(1990).Involvement of the multilineage CD38molecule in a unique pathway of cell activation and proliferation.J Immunol145,2390-2396.
Galic,Z.,Kitchen,S.G.,Kacena,A.,Subramanian,A.,Burke,B.,Cortado,R.和Zack,J.A.(2006).T lineage differentiation from human embryonic stem cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America103,11742-11747.
Groth,F.d.S.(1982).The evaluation of limiting dilution assays.Journal of Immunological Methods49,R11-23.
Hong,S.H.,Lee,J.H.,Lee,J.B.,Ji,J.和Bhatia,M.(2011).ID1and ID3represent conserved negative regulators of human embryonic and induced pluripotent stem cell hematopoiesis.J Cell Sci124,1445-1452.
Inman,G.J.,Nicolas,F.J.,Callahan,J.F.,Harling,J.D.,Gaster,L.M.,Reith,A.D.,Laping,N.J.和Hill,C.S.(2002).SB-431542is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase(ALK)receptors ALK4,ALK5,and ALK7.Mol Pharmacol62,65-74.
Irion,S.,Clarke,R.L.,Luche,H.,Kim,I.,Morrison,S.J.,Fehling,H.J.和Keller,G.M.(2010).Temporal specification of blood progenitors from mouse embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.Development(Cambridge,England)137,2829-2839.
Ivanovs,A.,Rybtsov,S.,Welch,L.,Anderson,R.A.,Turner,M.L.和Medvinsky,A.(2012).Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region.Journal of Experimental Medicine208,2417-2427
Jackson,S.A.,Schiesser,J.,Stanley,E.G.和Elefanty,A.G.(2010).Differentiating embryonic stem cells pass through‘temporal windows’that mark responsiveness to exogenous and paracrine mesendoderm inducing signals.PLoS One5,e10706.
June,C.H.,Ledbetter,J.A.,Linsley,P.S.和Thompson,C.B.(1990).Role of the CD28receptor in T-cell activation.Immunology today11,211-216.
Kaufman,D.S.,Hanson,E.T.,Lewis,R.L.,Auerbach,R.和Thomson,J.A.(2001).Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America98,10716-10721.
Kennedy,M.,D’Souza,S.L.,Lynch-Kattman,M.,Schwantz,S.和Keller,G.(2007).Development of the hemangioblast defines the onset of hematopoiesis in human ES cell differentiation cultures.Blood109, 2679-2687.
Klimchenko,O.,Mori,M.,Distefano,A.,Langlois,T.,Larbret,F.,Lecluse,Y.,Feraud,O.,Vainchenker,W.,Norol,F.和Debili,N.(2009).A common bipotent progenitor generates the erythroid and megakaryocyte lineages in embryonic stem cell-derived primitive hematopoiesis.Blood 114,1506-1517.
Kroon,E.,Martinson,L.A.,Kadoya,K.,Bang,A.G.,Kelly,O.G.,Eliazer,S.,Young,H.,Richardson,M.,Smart,N.G.,Cunningham,J.等人(2008).Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.Nature biotechnology26,443-452.
La Motte-Mohs,R.N.,Herer,E.和Zuniga-Pflucker,J.C.(2005).Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like1in vitro.Blood105,1431-1439.
Labastie,M.C.,Cortes,F.,Romeo,P.H.,Dulac,C.和Peault,B.(1998).Molecular identity of hematopoietic precursor cells emerging in the human embryo.Blood92,3624-3635.
Ledran,M.H.,Krassowska,A.,Armstrong,L.,Dimmick,I.,Renstrom,J.,Lang,R.,Yung,S.,Santibanez-Coref,M.,Dzierzak,E.,Stojkovic,M.等人(2008).Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches.Cell stem cell3,85-98.
Lu,M.,Kardel,M.D.,O’Connor,M.D.和Eaves,C.J.(2009).Enhanced generation of hematopoietic cells from human hepatocarcinoma cell-stimulated human embryonic and induced pluripotent stem cells.Experimental hematology37,924-936.
Marshall,C.J.,Moore,R.L.,Thorogood,P.,Brickell,P.M.,Kinnon,C.和Thrasher,A.J.(1999).Detailed characterization of the human aorta-gonad-mesonephros region reveals morphological polarity resembling a hematopoietic stromal layer.Dev Dyn215,139-147.
Murry,C.E.和Keller,G.(2008).Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations:lessons from embryonic development.Cell132,661-680.
Ng,E.S.,Azzola,L.,Sourris,K.,Robb,L.,Stanley,E.G.和Elefanty,A.G.(2005).The primitive streak gene Mixl1is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells.Development(Cambridge,England)132,873-884.
Nostro,M.C.,Cheng,X.,Keller,G.M.和Gadue,P.(2008).Wnt,activin和BMP signaling regulate distinct stages in the developmental pathway from embryonic stem cells to blood.Cell stem cell2,60-71.
Notta,F.,Doulatov,S.,Laurenti,E.,Poeppl,A.,Jurisica,I.和Dick,J.E.(2011).Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.Science(New York,NY333,218-221.
Oberlin,E.,Tavian,M.,Blazsek,I.和Peault,B.(2002).Blood-forming potential of vascular endothelium in the human embryo.Development (Cambridge,England)129,4147-4157.
Palis,J.,Malik,J.,McGrath,K.E.和Kingsley,P.D.(2010).Primitive erythropoiesis in the mammalian embryo.The International journal of developmental biology54,1011-1018.
Park,I.H.,Zhao,R.,West,J.A.,Yabuuchi,A.,Huo,H.,Ince,T.A.,Lerou,P.H.,Lensch,M.W.和Daley,G.Q.(2008).Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.Nature451,141-146.
Pearson,S.,Sroczynska,P.,Lacaud,G.和Kouskoff,V.(2008).The stepwise specification of embryonic stem cells to hematopoietic fate is driven by sequential exposure to Bmp4,activin A,bFGF and VEGF. Development(Cambridge,England)135,1525-1535.
Phillips,D.R.,Charo,I.F.,Parise,L.V.和Fitzgerald,L.A.(1988).The platelet membrane glycoprotein IIb-IIIa complex.Blood71,831-843.
Pick,M.,Azzola,L.,Mossman,A.,Stanley,E.G.和Elefanty,A.G.(2007).Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein4,vascular endothelial growth factor,stem cell factor和fibroblast growth factor2in hematopoiesis.Stem Cells25,2206-2214.
Rhodes,K.E.,Gekas,C.,Wang,Y.,Lux,C.T.,Francis,C.S.,Chan,D.N.,Conway,S.,Orkin,S.H.,Yoder,M.C.和Mikkola,H.K.(2008).The emergence of hematopoietic stem cells is initiated in the placental vasculature in the absence of circulation.Cell stem cell2,252-263.
Schmitt,T.M.,de Pooter,R.F.,Gronski,M.A.,Cho,S.K.,Ohashi,P.S.和Zuniga-Pflucker,J.C.(2004).Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.Nat Immunol5,410-417.
Schuh,K.,Twardzik,T.,Kneitz,B.,Heyer,J.,Schimpl,A.和Serfling,E.(1998).The interleukin2receptor alpha chain/CD25promoter is a target for nuclear factor of activated T cells.The Journal of experimental medicine188,1369-1373.
Sumi,T.,Tsuneyoshi,N.,Nakatsuji,N.和Suemori,H.(2008).Defining early lineage specification of human embryonic stem cells by the orchestrated balance of canonical Wnt/beta-catenin,Activin/Nodal and BMP signaling.Development(Cambridge,England)135,2969-2979.
Taoudi,S.和Medvinsky,A.(2007).Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America104,9399-9403.
Tavian,M.,Biasch,K.,Sinka,L.,Vallet,J.和Peault,B.(2010).Embryonic origin of human hematopoiesis.The International journal of developmental biology54,1061-1065.
Tavian,M.,Robin,C.,Coulombel,L.和Peault,B.(2001).The human embryo,but not its yolk sac,generates lympho-myeloid stem cells:mapping multipotent hematopoietic cell fate in intraembryonic mesoderm.Immunity15,487-495.
Thomson,J.A.,Itskovitz-Eldor,J.,Shapiro,S.S.,Waknitz,M.A.,Swiergiel,J.J.,Marshall,V.S.和Jones,J.M.(1998).Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science(New York,NY282,1145-1147.
Tian,X.,Woll,P.S.,Morris,J.K.,Linehan,J.L.和Kaufman,D.S.(2006).Hematopoietic engraftment of human embryonic stem cell-derived cells is regulated by recipient innate immunity.Stem Cells24,1370-1380.
Timmermans,F.,Velghe,I.,Vanwalleghem,L.,De Smedt,M.,Van Coppernolle,S.,Taghon,T.,Moore,H.D.,Leclercq,G.,Langerak,A.W.,Kerre,T.等人(2009).Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones.J Immunol182,6879-6888.
Vijayaragavan,K.,Szabo,E.,Bosse,M.,Ramos-Mejia,V.,Moon,R.T.和Bhatia,M.(2009).Noncanonical Wnt signaling orchestrates early developmental events toward hematopoietic cell fate from human embryonic stem cells.Cell stem cell4,248-262.
Vodyanik,M.A.,Thomson,J.A.和Slukvin,II(2006).Leukosialin (CD43)defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.Blood108,2095-2105.
Wang,L.,Li,L.,Shojaei,F.,Levac,K.,Cerdan,C.,Menendez,P.,Martin,T.,Rouleau,A.和Bhatia,M.(2004).Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.Immunity21,31-41.
Wang,L.,Menendez,P.,Shojaei,F.,Li,L.,Mazurier,F.,Dick,J.E.,Cerdan,C.,Levac,K.和Bhatia,M.(2005).Generation of hematopoietic repopulating cells from human embryonic stem cells independent of ectopic HOXB4expression.The Journal of experimental medicine201,1603-1614.
Yokomizo,T.和Dzierzak,E.(2010).Three-dimensional cartography of hematopoietic clusters in the vasculature of whole mouse embryos.Development(Cambridge,England)137,3651-3661.
Yoshimoto,M.,Montecino-Rodriguez,E.,Ferkowicz,M.J.,Porayette,P.,Shelley,W.C.,Conway,S.J.,Dorshkind,K.和Yoder,M.C.(2011).Embryonic day9yolk sac and intra-embryonic hemogenic endothelium independently generate a B-1and marginal zone progenitor lacking B-2potential.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America108,1468-1473.
Yoshimoto,M.,Porayette,P.,Glosson,N.L.,Conway,S.J.,Carlesso,N.,Cardoso,A.A.,Kaplan,M.H.和Yoder,M.C.(2012).Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.Blood119,5706-5714.
Yu,C.,Liu,Y.,Miao,Z.,Yin,M.,Lu,W.,Lv,Y.,Ding,M.和Deng,H.(2010).Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors.Blood116,4786-4794.
Zambidis,E.T.,Peault,B.,Park,T.S.,Bunz,F.和Civin,C.I.(2005).Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial,primitive和definitive stages resembling human yolk sac development.Blood106,860-870.