说明书上转换荧光纳米颗粒
发明领域
本发明涉及上转换(upconversion)荧光纳米颗粒和包含所述上转换荧光纳 米颗粒的制品。
发明背景
将复杂细胞事件联接在一起的艰巨任务目前可通过多路技术来进行。通过 对细胞样品赋予彩色荧光色，可使多于一种目标物在相同细胞中同时可见，从 而允许在单次快照中捕捉数项事件，于此同时，除了使取样误差最小化和简化 所含内标以外，还减少所需的试剂、消费品和样品的量。事实上，所述多路技 术能力随多色荧光的出现而成为可能。具有高度独特光学性质，以及单一波长 的近红外(NIR)光的激发后的紫外(UV)、可见(VIS)和近红外(NIR)区域的发射波 长的上转换纳米颗粒(UCN)已成为受欢迎的一组新型荧光标记物，预见其能够 克服当前传统标记物的限制。采用NIR作为激发光源具有竞争性的优势，因为 除了大多数生物分子不具有上转换性质以外，实践中，因在NIR光谱范围内缺 乏有效内源性吸收物从而样品产生接近零背景的可见荧光。
在多重检测设置中使用时，也可大幅降低激发光和发射光之间的交互作 用。此外，UCN在单一NIR激发波长的多色发射能力允许容易同时激发不同颜 色。此外，与对细胞的较低光损伤(photo-damage)(NIR激发光通常对低剂量的生 物分子无害)相联的其固有的特殊光稳定性特征和精密蛋白质使其成为长期活 细胞成像方面具有吸引力的工具。因此，处理这些UCN的色彩输出的能力在控 制其独特光学性质以产生新型、优质的荧光标签供于多路技术应用而言特别重 要。
先前已通过掺入Tm、Ho、Er和Yb镧系元素离子进入NaYbF4和NaYF4栅来 制造四种色彩UCN，但由于其非均一尺寸、无规形状和具有相比其批次类似物 而言低得多的密度从而显示出低质量。已经报道一种通过调节共同掺入纳米晶 体的Er/Tm比来微调上转换发射色彩的方法。类似地，先前也已公开了一种通 过改变粒径及其Yb/Tm掺入浓度来合成具有蓝色、紫色和红色整体输出色的 NaYF4:Yb,Tm纳米晶体的方法。然而，不可否认，上述方法容易受制于荧光淬 灭，这归因于Er或Tm离子掺入相同晶体基质作为其它稀有稀土掺杂物时出现的 交叉弛豫，从而Er和Tm离子的浓度仅能够在某一范围内调整，因此使通过该方 法进行的颜色调整非常受限。由此，通过仅调节其Er/Tm比难以获得具有强荧 光的多色发射UCN。
NaYF4UCN的上转换发射是尺寸依赖性的，并且其绿/红发射比(fg/r)受到无 掺杂α-NaYF4壳体的被覆的影响。尽管通过处理这些参数获得多色UCN，但发 射不同颜色的纳米晶体具有不同尺寸，因此阻碍了其下游应用的潜力。
也已制造出基于UCN和已包封在所述UCN的二氧化硅壳体中的有机染料 (OD)或量子点(QD)之间出现的荧光共振能量转移(FRET)的多色发射上转换纳 米球。然而，所述多色发射极其依赖于并受限于从UCN到包封的OD或QD的 FRET效率。因此，对衍生出多色UCN所做的上述努力均以消耗所述颗粒的上 转换荧光密度为代价。
因此，需要改进的上转换荧光纳米颗粒。
发明概述
本发明意在解决本领域中的至少一个问题，并且提供改进的上转换荧光纳 米颗粒，其可用作高效且有效的生物标志物，等等。
根据第一方面，本发明提供一种上转换荧光纳米颗粒，其包含：第一纳米 晶体层、第二纳米晶体层，和处于所述第一纳米晶体层与所述第二纳米晶体层 之间的能量吸收层，其中所述第一纳米晶体层和所述第二纳米晶体层各包含至 少一种下式化合物：(M1)j(M2)kXn:(M3)q，而所述能量吸收层包含至少一种下式 化合物：(M1)j(M2)kXn:(M3)r，
其中
各X相同或不同，并且选自下组：卤素、O、S、Se、Te、N、P和As；
各M1(若存在)相同或不同，并且选自下组：Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、 Be、Mg、Ca、Sr、Ba、Ra、O和NH4；
各M2相同或不同，并且是金属离子；
各M3，独立地，相同或不同并且选自下组：Er、Tm、Pr、Ho、Nd、Tb、 Eu、Sm、Yb、Ce、Dy、Mo和Cs；
j为0≤j≤10；k为1≤k≤10；n为1≤n≤10；q为1≤q≤10；且r为0≤r≤10。
具体而言，j、k、n、q和r分别表示一个晶体单胞中M1、M2、X和M3元素 的数量。例如，如果q或r是1，仅有一个M3元素掺入所述层中。当q或r是2(或 更高数值)时，有两个(或更多个)不同的M3元素共同掺入相应的层中。因此，j、 k、n、q和r不代表M1、M2、X和M3的原子价。例如，当第一纳米晶体层和/或第 二纳米晶体层包含NaYF4:Yb,Tm时，M1是Na，j是1，M2是Y，k是1，X是F4，n 是1，M3是Yb和Tm共掺入，并且q是2。同样，当能量吸收层包含NaYbF4:Er时， M1是Na，j是1，M2是Yb，k是1，X是F4，n是1，M3是Er并且r是1。
M2可以是任何合适的金属离子。例如，M2可以是过渡金属离子、内过渡 金属离子，或I～VI族的金属离子。具体而言，M2可选自下组：Sc、Y、La、 Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。
根据一个具体方面，所述第一纳米晶体层、第二纳米晶体层和能量吸收层 中至少之一可包含至少一种发射离子和至少一种吸收离子。具体而言，所述能 量吸收层可用至少一种吸收离子饱和。
第一纳米晶体层和第二纳米晶体层各自可包含任何合适的纳米晶体。例 如，第一纳米晶体层和第二纳米晶体层可包含任何合适的纳米晶体，所述纳米 晶体选自但不限于：NaYF4:(M3)q、La2O3:(M3)q、La2O3:(M3)q、La2(MoO4)3:(M3)q、 LnF3:(M3)q、Y2O2S:(M3)q、Y2O3:(M3)q、TeO2:(M3)q、ZrO2:(M3)q、LaPO4:(M3)q和LiYF4:(M3)q，其中M3和q如上定义。
所述能量吸收层可包含任何合适的化合物。例如，所述能量吸收层可包含 (但不限于)如下至少一种：NaYbF4:(M3)r、La2O3:(M3)r、La2O3:(M3)r、 La2(MoO4)3:(M3)r、LnF3:(M3)r、Y2O2S:(M3)r、Y2O3:(M3)r、TeO2:(M3)r、ZrO2:(M3)r、 LaPO4:(M3)r和LiYbF4:(M3)r，其中M3和r如上定义。
根据一个具体方面，第一纳米晶体层和第二纳米晶体层各自可以相同或不 同，并且可包含选自下组的纳米晶体：NaYF4:Yb,Er和NaYF4:Yb,Tm，并且所述 能量吸收层可包含选自下组的化合物：NaYbF4、NaYbF4:Er、NaYbF4:Tm和 NaYbF4:Ho。
所述上转换荧光纳米颗粒可以是NIR-至-可见的、NIR-至-NIR或NIR-至-紫 外上转换荧光纳米颗粒。
根据另一个具体方面，所述上转换荧光纳米颗粒可包含连接至所述纳米颗 粒的至少一种生物分子。可将任何合适的生物分子连接至所述纳米颗粒。例如， 所述生物分子可以是但不限于：蛋白质、核酸、核苷、核苷酸、DNA、激素、 氨基酸、肽、拟肽物、RNA、脂质、白蛋白、抗体、磷脂、糖脂、固醇、维生 素、神经递质、碳水化合物、糖、二糖、单糖、寡肽、多肽、寡糖、多糖及其 混合物。
根据第二方面，本发明提供包含上述上转换荧光纳米颗粒的制品。所述制 品可以是任何合适的制品。例如，所述制品可以是(但不限于)生物探针、药 物递送运载体、生物成像装置、生物实验物(bioassay)、用于生物检测的装置 或光电子装置。
根据第三方面，本发明提供生物成像和/或生物检测设备，所述装置包含至 少一种上述的上转换荧光纳米颗粒，至少一种生物分子以及至少一种激发源。
所述生物分子可以是任何合适的生物分子。例如，所述生物分子可以如上 所述。
所述激发源可以是任何合适的激发源。例如，所述激发源可以是NIR。具 体而言，所述NIR可以是980nm处的波长。
本发明还提供包含至少一种如上所述上转换荧光纳米颗粒或如上所述的 制品的试剂盒。所述试剂盒可任选地包含至少一种生物分子。所述生物分子可 以是任何合适的生物分子。例如，所述生物分子可以如上所述。
附图简要说明
为了使本发明能被充分理解且易于获得实践效果，现通过非限制性示例的 方式描述仅示例性实施方式，参考所示附图进行描述。在附图中：
图1显示夹心结构UCN的示意性设计和特点。(a)顶图：形成夹心结构构造 的示意图，其利用夹在两个A基质层之间的能量累积B基质层调整UCN发射颜 色。中间B基质层的子结构视图示于最右侧。A和B分别定义为NaYF4和NaYbF4基质。底图：掺入ABA构造的不同层中的不同镧系元素离子的能量转移图示于 最左侧。从ABA构造的不同壳体混合的RGB色彩以产生多色发射UCN的示意图 示于右侧。(b)，典型合成的UCN的代表性TEM图像。从左到右：核UCN、核- 壳UCN和夹心结构UCN(比例尺：50nm)。(c)，UCN的粒径分布统计直方图。 从左到右：核UCN、核-壳UCN和夹心结构的UCN。(d)UCN的XPS谱。从左到 右：核UCN、核-壳UCN和夹心结构的UCN。内插图是各样品的相应的元素扫 描。(e)，夹心结构的UCN形成过程中的晶体XRD图谱。各UCN的层组分如下： 核UCN A:Yb,Er，核-壳UCN A:Yb,Er@B:Er和夹心结构的UCN A:Yb,Er@B:Er@ A:Yb,Tm。(f)，夹心结构形成的不同阶段的UCN的元素图。从顶图至底图，各 UCN的组分如下：核UCN A:Yb,Er，核-壳UCN A:Yb,Er@B:Er和核-壳-壳UCN A:Yb,Er@B:Er@A:Yb,Tm；
图2显示用不同量的Er和Tm发射离子共同掺入的未被覆的UCN的发射。
图3显示多色发射UCN的光学图像和荧光图谱。(a)多色UCN的上转换图 谱。(a)中的UCN的层组分(从顶到底)如下：A:Yb,Er、A:Yb,Tm、B:Er、 A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm、A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Er、 A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm。NaYF4定义为A，而NaYbF4定义为B；(b)，UCN在 壳形成过程中的发射；(c)带有不同壳覆层的UCN的发射；
图4显示夹心结构的UCN关于其核和核-壳UCN对应物的荧光发射，其中其 B基质壳从中间层转换至最外层；
图5显示具有不同厚度的B壳覆层的UCN的发射；
图6显示不同层对颗粒的总体发射的作用。下述结构之间的荧光图谱比较： (a)，具有掺入的对比未掺入的核的夹心结构UCN；(b)，在中间B基质层中具有 不同掺入物构成成分的夹心结构UCN；(c)，在最外层A基质层中具有不同掺入 物构成成分的夹心结构UCN；
图7显示用多色UCN同时标记多重亚细胞靶标的示意图。可使具有基于镧 系元素掺入层的不同组合的夹心结构组装的RGB可调整发射的不同颜色的 UCN偶联至针对两种细胞表面受体和微管结构的抗体。特定细胞靶标各具色彩 标签，在单一980nm NIR波长处的激发将会产生各靶标不同色彩的上转换荧 光，允许容易地进行多种靶标的平行检测；
图8显示用UCN对活细胞进行HER2单标记。活的(a)，HER2-过表达 SK-BR-3，和(b)，HER2-低表达MCF-7乳腺癌细胞针对HER2细胞表面受体用抗 -HER2-UCNs-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)染色(比例尺：10μm)。(c)，用抗 HER2-UCN染色的SK-BR-3细胞的放大图像，和(d)，其细胞膜用Alexa Fluor 488- 伴刀豆球蛋白A偶联物复染的对应图像，显示UCN-染色的HER2的亚细胞位置 (比例尺：5μm)。红色荧光指示UCN在980nm激发下的上转换发射，蓝色荧光 显示用DAPI核复染而绿色荧光是用Alexa Fluor 488-伴刀豆球蛋白A偶联物复染 的细胞膜；
图9显示用UCN对活细胞进行HER2单标记。活的HER2-过表达SK-BR-3和 HER2-低表达MCF-7乳腺癌细胞针对HER2细胞表面受体用抗 -HER2-UCNs-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)染色。红色荧光(R)指示980nm激 发下发自UCN的上转换发射，而蓝色荧光(B)显示采用DAPI的核复染。来自各 细胞系的顶图显示以低放大倍数拍摄的图像(比例尺：50μm)，而来自各细胞系 的底图显示以高放大倍数拍摄的图像(比例尺：10μm)；
图10显示在固定的细胞上用UCN进行的BMPR2单一标记。固定的SK-BR-3 细胞用抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm)针对BMPR2细胞表面受体染色(比例尺：10 μm)。蓝色荧光指示在980nm激发下发自UCN的上转换发射，而采用DAPI的核 复染假染色(pseudocoloured)为黄色；
图11显示对用抗HER2-UCN标记的SK-BR-3细胞死亡的实时跟踪。通过停 止常规的5％CO2和37℃常温的供应来诱导抗-HER2-UCN-染色的SK-BR-3细胞 死亡。采用延时共聚焦显微镜在2小时时程中于980nm激发下持续捕获死亡过 程。来自摄影的0小时和2小时的视频快照显示细胞形状变化，如其抗 -HER2-UCN染色的轮廓所示。红色荧光指示UCN在980nm激发下的上转换发 射，蓝色荧光显示用DAPI核复染而绿色荧光是用Alexa Fluor 488-伴刀豆球蛋白 A偶联物复染的细胞膜(比例尺：5μm)；
图12显示在活细胞和固定细胞上采用多色UCN的亚细胞靶标的多重标记。
(a)，固定的3T3成纤维细胞分开针对细胞表面受体BMPR2和PDGFRα，以 及细胞骨架成分微管，分别用抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)、抗 -PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)和抗-α-微管蛋白-UCN-(A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm) 染色(比例尺：10μm)。左图中的红色荧光指示来自抗 -HER2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)的上转换发射，中图中的蓝色荧光指 示来自抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)的上转换发射，而右图中的红色荧光指示 来自抗-α-微管蛋白-UCN-(A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm)的上转换发射，均在980 nm激发下。采用DAPI的核复染由左图和右图中的蓝色荧光指示，而中图是假 染色的黄色。(b)，针对BMPR2和PDGFRα细胞表面受体，分别用抗 -BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)和抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)双染 活3T3细胞。红色荧光指示来自抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)的 上转换发射，而蓝色荧光指示来自抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)的上转换发射， 均在980nm激发下。(c)，固定的3T3细胞针对BMPR2和PDGFRα细胞表面受体 和第三微管结构用抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)、抗 -PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)和抗-α-微管蛋白-UCN-(A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm) 分别三重染色。红色荧光指示来自抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm) 和抗-α-微管蛋白-UCN-(A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm)的上转换发射，绿色荧光指 示来自抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)的上转换发射，而蓝色荧光 指示来自抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)的上转换发射，均在980nm激发下。用 DAPI的核复染假染色成黄色。所有这些色彩的合并图像显示染色的细胞结构的 彼此相对位置以及其在细胞边界内的分布，其可通过此处(b)和(c)中插图所示的 对应亮场图像来跟踪(比例尺：10μm)；
图13显示带有不同颜色的UCN的固定细胞上的三种亚细胞靶标的单一标 记。
固定的3T3成纤维细胞分开针对细胞表面受体BMPR2和PDGFRα，以及细 胞骨架成分微管，分别用抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)、抗 -PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)和抗-α-微管蛋白-UCN-(A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm) 染色(比例尺：10μm)。顶图中的红色荧光指示来自抗 -HER2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)的上转换发射，中图中的蓝色荧光指 示来自抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)的上转换发射，而底图中的红色荧光指示来 自抗-α-微管蛋白-UCN-(A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm)的上转换发射，均在980nm 激发下。采用DAPI的核复染由顶图和底图中的蓝色荧光指示，而中图是假染色 的黄色；
图14显示对活细胞上的细胞表面受体用两色多重UCN系统进行双标记。针 对BMPR2和PDGFRα细胞表面受体，分别用抗 -BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)和抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)双染 活3T3细胞。
红色荧光指示来自抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)的上转换 发射，而蓝色荧光指示来自抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)的上转换发射，均在980 nm激发下。用DAPI的核复染假染色成黄色。所有这些色彩的合并图像显示染 色的细胞结构的彼此相对位置以及其在细胞边界内的分布，其可通过此处插图 所示的对应亮场图像来跟踪(比例尺：10μm)；
图15显示采用两色多重UCN系统，对固定细胞上的细胞表面受体进行双标 记。针对细胞表面受体HER2和BMPR2，分别用抗 -HER2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)和抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm)双染固 定的SK-BR-3细胞。红色荧光指示来自抗 -HER2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)的上转换发射，而蓝色荧光指示来自 抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm)的上转换发射，均在980nm激发下。用DAPI的核复 染假染色成黄色。所有这些色彩的合并图像显示染色的表面受体的彼此相对位 置以及其在细胞边界内的分布，其可通过此处插图所示的对应亮场图像来跟踪 (比例尺：10μm)；
图16显示具有不同壳厚度的NaYF4:Er@NaYbF4核-壳纳米颗粒的TEM图 像。各纳米颗粒的核-壳摩尔比如下：(a)1:0，(b)1:0.1，(c)1:0.3，(d)1:0.5，(e) 1:0.9，(f)1:1.3，(g)1:1.7和(h)1:2.1；
如17显示(a)具有不同壳厚度的NaYF4:Er@NaYbF4核-壳纳米颗粒的荧光光 谱，和(b)具有渐增壳厚度的纳米颗粒在542nm处的绿峰和在657nm处的红峰的 荧光密度变化；
图18显示具有固定的1:1.3核/壳比但NaYF4:Er核尺寸从核-壳1增加至核-壳 4的NaYF4:Er@NaYbF4核-壳纳米颗粒的TEM图像和尺寸分布。
图19显示(a)具有固定核/壳比但NaYF4:Er核尺寸从核-壳1增加至核-壳4的 NaYF4:Er@NaYbF4核-壳纳米颗粒的荧光光谱，和(b)具有渐增核尺寸的 NaYF4:Er@NaYbF4核-壳纳米颗粒(固定1:1.3核/壳比)在542nm处的绿峰和在 657nm处的红峰的荧光密度的变化；和
图20显示用于对偶联至上转换荧光纳米颗粒的HER2抗体进行定量检测的 改进的布拉德福(Bradford)测试标准曲线。
详细描述
对用于满足生物标记物在快速发展的多重应用中的急速增长应用的更有 效的生物标记物的需求可通过最近出现的上转换纳米颗粒(UCN)来实现。然而， 迄今制造的UCN显示不具有强荧光，或可用色彩有限。
本发明的上转换荧光纳米颗粒允许通过吸收物富离子能量吸收层来有效 吸收激发能量，然后将其转移至附近的第一纳米晶体层和第二纳米晶体层，所 述第一纳米晶体层和第二纳米晶体层在能量吸收层的各侧以提高荧光效率。通 过向各壳/层掺入不同的发射物并调节其厚度，可获得基于RGB色模型可调的不 同色彩输出。已简单地合成了具有强发射密度的多色UCN，并用于采用单一近 红外激发波长进行的三种亚细胞靶标的多重检测。
本发明的上转换荧光纳米颗粒可包含夹在夹心结构的两层之间的能量累 积基质。出于本发明目的，所述上转换荧光纳米颗粒将被称为具有夹心结构或 核-壳-壳(CSS)结构。在基于RGB色彩模型可调发射的情况下，所述纳米颗粒可 具有高荧光性。具体而言，本发明的纳米颗粒提供密度足够的多色发射。因此， 本发明的纳米颗粒可用于关于多色发射的多重检测。
根据第一方面，本发明提供一种上转换荧光纳米颗粒，其包含：第一纳米 晶体层、第二纳米晶体层，和处于所述第一纳米晶体层与所述第二纳米晶体层 之间的能量吸收层，其中所述第一纳米晶体层和所述第二纳米晶体层各包含至 少一种下式化合物：(M1)j(M2)kXn:(M3)q，而所述能量吸收层包含至少一种下式 化合物：(M1)j(M2)kXn:(M3)r，其中
各X相同或不同，并且选自下组：卤素、O、S、Se、Te、N、P和As；
各M1(若存在)相同或不同，并且选自下组：Li、Na、K、Rb、Cs、Fr、 Be、Mg、Ca、Sr、Ba、Ra、O和NH4；
各M2相同或不同，并且是金属离子；
各M3，独立地，相同或不同并且选自下组：Er、Tm、Pr、Ho、Nd、Tb、 Eu、Sm、Yb、Ce、Dy、Mo和Cs；
j为0≤j≤10；k为1≤k≤10；n为1≤n≤10；q为1≤q≤10；且r为0≤r≤10。
根据一个具体实施方式，所述上转换荧光纳米颗粒可包含夹心结构形式的 第一纳米晶体层、第二纳米晶体层和能量吸收层。具体而言，所述夹心结构可 包含夹在两个NaYF4基质层之间的中间NaYbF4基质层。中间能量吸收层可实现 以下作用：(i)其吸收物离子的富含量允许最大化地吸收激发能量，该激发能量 随后被转移至附近的处于各侧的第一纳米晶体层和第二纳米晶体层；(ii)其修复 纳米晶体核(第一纳米晶体层)上的表面缺陷并因而使荧光淬灭最小化；(iii)其拥 有作为色源的上转换发射，其可被用于调整整体输出发射色彩。具体而言，中 间能量吸收层可以是NaYbF4基质，其中Yb吸收物离子中的富含量可允许最大化 地吸收激发能量，所述激发能量被转移至附近的第一纳米晶体层和第二纳米晶 体层。第一纳米晶体层和第二纳米晶体层各自可包含NaYF4。
根据具体实施方式，第一纳米晶体层和第二纳米晶体层可包含至少一种掺 入物。能量吸收层可以包含或不包含掺入物。掺入物可以是发射物离子和/或吸 收物离子。本领域技术人员应理解，掺入物可以是杂质，其以低浓度添加至化 合物以改变所述化合物的一些性质。例如，掺入物可以千分之一至亿分之一的 浓度添加。还应理解，掺入物不改变其添加目标化合物的晶体结构。
通过改变各层中掺入物成分并调节层厚度，可基于RGB模型获得任何所需 上转换发射色彩。所述通过夹心构造的层与层之间的能量累积基质的夹心设计 而具有强发射的，调整本发明的上转换荧光颗粒的发射色彩的方法可生成优良 的荧光工具以用于宽范围的多重应用。本发明上转换荧光纳米颗粒用于多重检 测的可行性通过同时采用针对靶标多重细胞标志物的不同抗体对这些多色上 转换荧光纳米颗粒进行进一步表面功能化来证明。纳米颗粒的下述优势使其具 有优于目前用于多路技术的其它纳米材料的显著优势：仅采用单一激发源即可 容易地同时激发多色上转换荧光纳米颗粒，以及可由上转换荧光纳米颗粒的固 有独特光学性质获得的其它优势，包括不存在背景荧光以及采用安全NIR光作 为激发源(因此绕过了对通常需要用于激发传统荧光团(例如QD)和绿色荧光蛋 白的潜在细胞毒性紫外光的需求)。
所述上转换荧光纳米颗粒可包含第一纳米晶体层和第二纳米晶体层，其中 第一纳米晶体层和第二纳米晶体层可包含选自下组(但不限于此)的纳米晶体： NaYF4:(M3)q、La2O3:(M3)q、La2O3:(M3)q、La2(MoO4)3:(M3)q、LnF3:(M3)q、 Y2O2S:(M3)q、Y2O3:(M3)q、TeO2:(M3)q、ZrO2:(M3)q、LaPO4:(M3)q和LiYF4:(M3)q， 其中M3和q如上定义。
所述能量吸收层可以是任何合适的层。例如，所述能量吸收层可包含(但 不限于)如下至少一种：NaYbF4:(M3)r、La2O3:(M3)r、La2O3:(M3)r、 La2(MoO4)3:(M3)r、LnF3:(M3)r、Y2O2S:(M3)r、Y2O3:(M3)r、TeO2:(M3)r、ZrO2:(M3)r、 LaPO4:(M3)r和LiYbF4:(M3)r，其中M3和r如上定义。
根据具体实施方式，所述能量吸收层可以不包含掺入物，其中r是0。例如， 当能量吸收层不需要对发射色彩起作用时，所述能量吸收层需要不掺入发射物 离子。然而，所述能量吸收层可包含吸收物作为掺入物或通过选择合适的M2。
根据一个具体方面，第一纳米晶体层和第二纳米晶体层各自可以相同或不 同，并且可包含：NaYF4:Yb,Er或NaYF4:Yb,Tm，并且所述能量吸收层可选自下 组：NaYbF4、NaYbF4:Er、NaYbF4:Tm和NaYbF4:Ho。
夹心结构的UCN合成
所述第一纳米晶体层和第二纳米晶体层将由“A”表示，而能量吸收层将 由“B”表示。如图1a中所示，夹心结构的本发明纳米颗粒的合成以逐步过程 进行，开始形成A基质(例如，掺有发射物的NaYF4)核心，然后使其被覆有B基 质层(例如，掺有发射物的NaYbF4)壳体，最后将另一个A基质壳体被覆至B基质 上以形成ABA夹心结构的UCN。
根据一个具体实施方式，所述发射物掺入物的浓度固定至A和B基质中均有 2mol％Er和0.3mol％Tm，而就Yb感光剂而言设置为A和B基质中分别有20 mol％和100mol％(作为发射物)。通过该方法，由所述纳米颗粒的透射电子显微 镜(TEM)图像(图1b)明显可见，获得了均一尺寸的球形纳米颗粒。此处，观 察到随着纳米颗粒经历了从核至夹心结构UCN的结构转变，其粒径从约15nm 逐步增加至43nm，因此表明成功形成了夹心结构。随着所述尺寸增加，由此 可推断所述覆层似乎产生约5nm的平均壳体厚度。虽然所述核-壳或夹心结构颗 粒上的这些壳体在TEM图像中并不明显。这可能是因为分别在A和B基质中占优 势的Y和Yb元素之间没有合适的Z对比，因为其离子尺寸足够接近以允许其占 据晶体中相同的晶格位置。因此，UCN核上的壳体形成，如同其尺寸变化反映 的那样，后续进一步通过δ纳米粒度仪进行粒径检测来确认，其揭示在壳体被 覆过程中所述纳米颗粒的平均直径随时间增加(图1c)。此外，该结果还表明所 述颗粒在其第一和第二壳体形成之后呈单分散，因此为成功形成夹心结构提供 了进一步的实验证据。还注意到在壳体被覆过程中，新添加的反应物可能会通 过成核作用形成新的小颗粒而不是沉积在先前存在的核UCN的表面上。然而， 因为这高度依赖于所述反应的能量平衡，预期此时壳体形成是主要产物，因为 在新晶体形成所需要克服的能量障碍远高于在存在的核上沉积离子所需的能 量。
通过X射线光电子能谱学(XPS)和X射线衍射(XRD)进一步检测形成UCN的 组合物和纳米结构。因为所述颗粒的平均壳体厚度是约5nm，各样品中的Y和 Yb离子可由XPS来方便地跟踪，因为XPS对样品的前5nm敏感。此处，记录XPS 宽谱扫描以供基于碳和氧的特征峰进行的元素校正。元素扫描聚焦在Y和Yb元 素，因为在该夹心结构形成的不同阶段中发现它们是特征主导元素。如图1d的 中图所示，很明显，对应于中间NaYbF4基质层中的Yb的4d3电子的200eV附近 的峰远高于核UCN(图1d，左图)和夹心结构的UCN(图1d，右图)中观察到的峰。 另一方面，代表Y 3b电子的175eV附近的峰在核UCN和夹心结构的UCN中相对 高于其核-壳UCN对应物。这些XPS结果不仅表示所示壳体被成功被覆在所述核 上，而且其不扩散开，因此说明其在被覆之后坚实沉积在核表面上。此外，Y 离子仅在B壳体层被覆之后含量丰富，清除了关于离子在纳米颗粒中迁移(可能 在其被置于高温溶液中时发生)的疑惑，一并否定了不同离子可能出现扩散和分 离的假设。事实上，这通过将本发明的夹心结构的UCN的荧光光谱与先前常规 合成的核UCN的荧光光谱做比较而进一步证实。就此而言，比较具有相同量的 离子含量的三重掺入(tri-doped)的UCN(A:Yb,Er,Tm，元素比Y:Yb:Er:Tm＝ 53.3:47.3:1.3:0.1)和夹心结构的UCN(A:0.2Yb,0.02Er@B:0.02Er@A:0.2 Yb,0.003Tm)。发现三重掺入的UCN的发射非常暗，与夹心结构的UCN相反， 并且记录的荧光强度甚至远低于用Yb和Er/Tm共掺入的UCN，这归因于掺入物 以高离子浓度存在时其之间出现的交叉弛豫。因此，这确证了先前的在壳体覆 层反应过程中没有离子迁移的概念。
所述夹心结构(核-壳-壳结构)的形成的进一步确认通过经由飞行时间离子 质谱(TOF-SIMS)对纳米颗粒表面上的吸收物元素进行元素比对来完成。在壳体 形成的不同阶段，所述吸收物元素的浓度预计大有不同并且这可基于与存在的 元素的浓度成比例增加的元素图的亮度来观察。根据一个具体实施方式，所述 吸收物元素可选择是Yb。所述元素比对可检测300x300μm2的区域。用于研究 具有核-壳-壳结构的上转换荧光纳米颗粒上的Yb浓度的TOF-SIMS的结果如图 1f所示。具体而言，观察到所述核-壳纳米颗粒的表面上的Yb同位素的浓度高于 核或具有夹心结构的上转换荧光纳米颗粒，这指示发现Yb元素仅在中间能量吸 收层(即，NaYbF4层)中含量丰富，因此证明形成了核-壳-壳结构。
基于XRD的颗粒的其它表征表明，在所述反应的每个阶段均产生单结晶六 边形相纳米晶体(图1e)。此处观察到的右移的XRD峰指示晶体单胞的平均尺寸 在用Yb取代的基质处理夹心结构之后轻微缩小，这通过Yb的离子尺寸(即， )小于先前的占据物Y()的事实得以验证。
用于色彩调整的夹心结构策略
调整UCN的色彩输出无法通过使掺入物(例如Er和Tm(共掺入纳米颗粒))的 发射峰彼此重叠来简单地完成，因为光谱上的各峰对应于某一能量水平。例如， 450和475nm处的发射峰被分配为Tm离子的1D2→3F4和1G4→3H6跃迁，而 409、520、541和653nm处的发射峰被分配为Er离子从4H9/2→4I15/2、4H11/2→4I15/2、 4S3/2→4I15/2和4F9/2→4I15/2的跃迁。因此，将两种不同发射物离子掺入一种纳米 颗粒可能未必产生强度为其个体发射物的荧光简单之和的发射光谱。相反，当 与常规合成的仅具有掺入发射物的单一物质(即，Er)的UCN(A:0.2Yb,0.02Er)相 比时，观察到用Er和Tm发射物离子共掺入的UCN的绝对发射强度的下降(图2)。 为了散发更多的光，合成了不同的Er-Tm比掺入的UCN，同时就所有UCN样品 而言保持吸收物离子Yb浓度恒定在20mol％比(从而确保相同量的被UCN吸收 的激发能量对所述发射物可及)。首先，制备用Er和Tm发射物离子共同掺入的 UCN，以这些离子个体掺入纳米晶体时发现的最佳浓度掺入(即，0.02Er, 0.003Tm)。然后，还合成用一半量的Er离子但最有Tm量(0.01Er,0.003Tm)共掺 入的其它UCN，或具有等分Er和Tm离子(0.01Er,0.0015Tm)的那些UCN。如图2 中记录的光谱所示，具有较高净量的Er和Tm发射物离子的UCN显示的荧光强度 低于具有较低净量的这些发射物离子的UCN，其中在Er-Tm共掺入样品中(尽管 未达相同强度水平，这是因为仅掺入有单一发射物离子Er的那些UCN)，具有最 低量的净发射物离子(0.01Er,0.0015Tm)的UCN发射出最高的荧光。这归因于从 放射源转移的能量的损失(由离子之间的交叉弛豫所致)，因此导致较少数的光 子，所示光子的能量水平足够高以在其下降至基态时产生荧光。因此，这些观 察结果指示，通过Er/Tm共掺入来调整UCN发射并非产生高强度的多色UCN的 有效途径。事实上，所述三重掺入的系统需要达到如下平衡：掺入足够的Yb吸 收物离子从而吸收尽量多的放射能量以供转换成激发的光子能量，同时使其维 持在Yb离子置入的饱和效果的水平之下。采用本发明的上转换荧光纳米颗粒， 这可以通过具有中间能量吸收层和附近的第一纳米晶体层和第二纳米晶体层 来绕过，所述中间能量吸收层可被分配成具有更多吸收物离子(例如包装的Yb 离子)以使能量吸收最大化，所述第一纳米晶体层和第二纳米晶体层掺有不同的 发射物离子，其中吸收的能量可被有效转移，以获得未缩减的发射。
探索了采用在夹心结构的两层间夹着的能量累积基质来调整色彩的可行 性。在该夹心设计中，将NaYbF4基质分配至中间能量吸收层以使能量吸收最大 化，而附近的第一纳米晶体层和第二纳米晶体层掺有发射物离子，所述吸收的 能量可被有效转移至纳米晶体层。合成了具有不同的掺入不同层的发射物的组 合的夹心结构的纳米颗粒样品。在所有这些样品中，通过保持用于制造各层的 化学品的总量在相同反应条件下恒定来使各层的厚度相当，从而夹心结构UCN 的产物尺寸相当。通过改变各壳体中的掺入物，可实现调整发射色彩，如图3a 所示。有趣的是，当掺入所述夹心结构时，Tm发射大幅增加(图3a； A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm)。更加令人吃惊的是，对于蓝色上转换荧光而言， 最优Tm浓度范围非常低(约0.3％，相比之下Er为2％)，而通常而言，难以调整传 统核-壳结构中掺入的Tm的发射强度。而在所述上转换荧光纳米颗粒的夹心结 构中，容易地实现了Tm发射强度的增加，而无需掺入更多的Tm离子。事实上， 这通过另一个实验进一步地证实，为何具有夹心结构的UCN显示绝对荧光强度 比其核-壳UCN对应物或核本身高得多(图3b)，因此指示夹心结构对于UCN而言 的另一个益处。该增强可归于两个原因：(i)通过第一壳体(能量吸收层)对核(第 一纳米晶体层)上的表面缺陷进行链修复，并且通过第二壳体(第二纳米晶体层) 对第一壳体上的表面缺陷进行链修复；(ii)夹心结构通过具有中间能量吸收层 和附近的掺有发射物离子的层，提供了将高量吸收物离子掺入UCN的方式，这 无需考虑其可能对荧光淬灭可能产生的饱和效应，所述中间能量吸收层可被分 配以具有包装进来的更多吸收物离子，使能量吸收最大化，而在所述掺有发射 物离子的层中，吸收的能量可被有效转移，以获得未缩减的发射。因此，各层 中掺有不同的发射物离子，本发明的上转换荧光纳米颗粒的上转换发射可基于 RGB色模型被调整，而没有因镧系元素掺入物之间的交叉弛豫所致的缩减。
达到壳体被覆的遮蔽和增强效果之间的平衡
在所述夹心结构设计中，B基质壳体的中间能量吸收层在对UCN的荧光输 出的遮蔽和增强方面起两种不同且相对的作用。根据这些作用，因而可进一步 将其细分成三层，如图1a的示意图中的虚线所示。据信外部亚层和最里亚层对 纳米颗粒的总体发射具有增强作用，而中间亚层起相反作用，其对来自核的荧 光发射起遮蔽作用。B基质壳体从中间层转换成为第二外部纳米晶体层，从而 新夹心结构的UCN现在具有层组分A:Yb,Er@A:Yb,Tm@B:Er。事实上，所述转 换导致所得夹心结构的A:Yb,Er@A:Yb,Tm@B:Er纳米晶体相较于其纳米颗粒核 或核-壳纳米颗粒而言，所有发射峰的强度下降(图4)。这强调了多层纳米颗粒 中B基质位置的重要性，因为其对所得纳米颗粒的发射荧光具有很强的影响。 为了确定所述荧光强度的下降实际上归因于B基质壳体层被置于最外部位置， 仅用B基质层被覆A:Yb,Er核纳米晶体。在所述被覆处理之前和之后比较其发射 荧光，显示在将B基质层被覆在所述核上之后，所有发射峰下降(图3c)。在其它 系列的实验中也类似地观察到该情况，由此合成并比较具有相同A基质核但被 覆有不同厚度的A基质壳体(具有20mol％Yb)或B基质壳体(具有100mol％Yb， 作为发射物)的核-壳纳米结构。通过DLS检测，发现不论是否具有相似平均尺 寸，那些被覆有A基质壳体的荧光强度比那些被覆有相同厚度的B基质壳体的几 乎强15倍(图3c)。当所述壳-核总离子摩尔比下降至0.5并随后进一步下降至0.2 时，荧光强度对应地增加(图5)，尽管从未达到与核相同的强度水平。总体而言， 这些结果表明，当吸收物含量丰富(Yb含量丰富)的B基质层被置于最外层时， 遮蔽由内层发射的荧光。该遮蔽主要归因于Yb吸收物的饱和作用。当被置于最 外位置时，B基质中包装的丰富Yb吸收物离子对入射NIR光的强吸收并没有被 有效转移至纳米晶体的内层中掺入的Er或Tm发射物离子。事实上，能量从放射 源转换至UCN的效率很大程度上取决于其Yb吸收物离子的浓度。该转换效率随 着Yb浓度的增加而升高，直至该浓度到达饱和点，超过该点后其过度优势存在 会导致Yb和Er/Tm发射物离子之间的距离较短，从而这时将会发生能量从Er至 Yb离子的回转。这大幅减少了能够到达内层的NIR激发能量的量，由此造成从 这些内层发射的荧光减少。尽管上转换发射物离子(例如Er或Tm)可通过NIR光 本身直接被激发，其在NIR区内的截面吸收比Yb离子低十倍。NIR区内Er和Tm 发射物离子的吸收截面如此之低，与来自Yb离子向这些发射物离子的弱能量转 移相关联，导致被遮蔽的内核对所述纳米晶体的总体荧光强度的贡献可忽略不 计。因此，尽管希望在UCN核上被覆B基质壳体层能通过修复表面缺陷来使荧 光淬灭最小化，并且将其从周围溶剂分子和表面配体分离，但如通过核-壳UCN 的缩减的发射可见，这并不促进荧光增强。另一方面，A基质壳体层的被覆增 加了UCN内核的荧光，因为此时掺入的Yb离子的量是最优的。
各层对改善纳米颗粒总体发射的作用
还观察了各层对改善所述颗粒总体发射的作用。首先通过将具有相同壳体 但不同核成分的夹心结构UCN做比较来研究了第一纳米晶体层(核)的作用，其 中一种有掺入，而其它保持未掺入作为纯A基质核。尽管两种类型的颗粒显示 了相似的发射谱，但具有未含掺入物的核的那些颗粒显示比其有掺入物的对映 体弱10倍的荧光(图6a)。从有掺入物的核发射的荧光似乎并无缩减，甚至在其 上被覆两层壳体时也是如此，其中一层是中间能量吸收B基质层，其可富含吸 收物离子，例如Yb离子。因此，这解决了向所述中间层包装进入高量吸收物离 子(例如Yb离子)是否导致其吸收从附近的第一纳米晶体层和第二纳米晶体层发 射的荧光这一悬而未决的疑惑。基于NIR区内的Yb离子的高截面吸收，在A层 基质生长到B层基质上之前和之后的UCN的荧光强度的明显增加可指示中间B 层的作用是用于累积吸收的激发能量的接收物，所述能量随后将被同时转移至 内侧和外侧的附近的层。
研究中间能量吸收层中的掺入物的作用以评估其对颗粒的总体发射强度 和概况的贡献。此处，检测具有相同核(A:Yb,Er)和最外层(A:Yb,Em)但不同的 掺入中间层的两种类型的夹心结构UCN。如图6b所示，B基质的中间层中的掺 入物组分的对总体发射强度的贡献比其典型发射多出一倍，因此指示中间层对 改善颗粒的发射的重要性，虽然其程度小于先前观察到的来自核的程度。最后， 通过比较具有相同核(A:Yb,Er)和中间层(B:Tm)成分但不同最外层的夹心结构 的UCN来研究最外层对所示颗粒总体发射的作用。清楚显示，相较于具有 A:Yb,Tm成分的那些颗粒而言，具有A:Yb,Er成分作为其最外层的颗粒中，在约 550和650nm处的典型Er发射峰稍有增强(图6c)。因此，通过分开研究各层的发 射表现，揭示了其对颗粒的发射光谱做贡献的个体作用，并且所述最外层似乎 显示最弱的影响，可能是因为它们比其它两个核和中间层薄。
能量吸收层向第一纳米晶体层和/或第二纳米晶体层的能量转移
在本发明的上转换荧光纳米颗粒中，能量吸收层中吸收的能量被转移至第 一纳米晶体层和/或第二纳米晶体层。这通过从研究能量吸收层(壳体)到第一纳 米晶体层(核)的能量转移来证实。通过采用具有于分开的层中掺入吸收物和发 射物离子的核-壳纳米颗粒，排除了在掺入相同层的吸收物和发射物离子之间的 能量转移。合成了NaYF4:Er@NaYbF4核-壳上转换纳米颗粒，其中仅允许从壳 体(掺有Yb吸收物)到核(掺有Er发射物)的能量转移。通过改变所述核-壳纳米颗 粒的壳厚度和核尺寸，获得优选的NaYbF4层厚度和核尺寸，以实现最高荧光。 在典型的合成过程中，NaYF4:Er核依照任何合适的方案合成，例如(“A(NaYF4) core UCN synthesis((NaYF4)核UCN合成)”)所描述的，并且将掺入物浓度固定在2 mol％Er。用于将NaYbF4层被覆在NaYF4:Er核上的方法也与(“AB (NaYF4@NaYbF4)core-shell UCN synthesis(《AB(NaYF4@NaYbF4)核-壳UCN合 成》)”)中描述的核-壳UCN合成方案类似，不同之处在于根据各样品中的核/壳 比调节壳前体的量。
首先合成一组具有不同厚度的NaYbF4壳的NaYF4:Er@NaYbF4核-壳UCN以 研究壳厚度在能量从NaYbF4层转移至核NaYF4:Er的因素。从图16中所示的TEM 图像可见，观察到具有递增量的用于NaYbF4壳合成的前体的核-壳UCN的尺寸 逐渐增加，因此指示成功被覆了NaYbF4层。Y与Yb比的能量分散的X射线光谱 (EDX)分析也与壳体分析中所用的化学品的公称比匹配良好(参见下表1)。
表1：公称和EDX检测的Y/Yb比
所述颗粒的荧光光谱显示位于542nm处的绿色发射峰，其对应于Er离子的 4S3/2至4I15/2转变，首先随NaYbF4壳在到达其核/壳比为1:1.3的峰强度之前的厚度 增加而增大，超过该点后，其随着NaYbF4壳厚度的进一步增加而减小(图17)。 这指示NaYbF4壳在增强和遮蔽所述核-壳纳米颗粒的荧光方面起着两种不同且 相对的作用。所述NaYbF4壳通过吸收能量然后将其转移至核中掺入的Er离子来 增强荧光。当壳厚度增加时，Yb离子吸收更多的能量从而有更多的该能量被转 移至Er离子，导致颗粒的荧光强度增加。然而，当NaYbF4壳厚度达到超过临界 值的厚度时，其起到遮蔽发自核的荧光的相反作用，因此解释了图17中观察到 的Er的542nm处的峰的减小。鉴于这两种相反的作用，供于从NaYbF4层至核的 能量转移的最优核/壳比是1:1.3。相反，Yb在657nm处的共同上转换发射峰随 着NaYbF4壳的厚度增加而增大，因为共同上转换与Yb浓度直接成比例。
在第二种方法中，研究了核尺寸的因素以评估其对从NaYbF4层至核的能量 转移的作用。为此，合成了一组具有不同核尺寸的NaYF4:Er@NaYbF4核-壳 UCN(图18)。基于对于壳厚度的先前研究，将核/壳比固定至最优比例1:1.3。从 核到核-壳的尺寸上的增加具有窄分布，指示成功被覆了NaYbF4层。核-壳UCN 的荧光强度随核尺寸的增加而增加(图19)。这可能归因于纳米颗粒尺寸的增加， 这些纳米颗粒表面上发现的晶体缺陷也有所减少，因此减少了通常已知由晶体 缺陷造成的淬灭效应，由此导致荧光增强。
带有多色抗体偶联UCN的细胞标志物的多重检测
根据另一个具体方面，所述上转换荧光纳米颗粒可进一步包含连接至所述 纳米颗粒的至少一种生物分子。例如，所述生物分子可以选自但不限于：蛋白 质、核酸、核苷、核苷酸、DNA、激素、氨基酸、肽、拟肽物、RNA、脂质、 白蛋白、抗体、磷脂、糖脂、固醇、维生素、神经递质、碳水化合物、糖、二 糖、单糖、寡肽、多肽、寡糖、多糖或其混合物。
采用上述相同的夹心型构造，由此可对这些UCN分配不同的色彩以基本产 生多色颗粒，这些色彩基于RGB色彩模型是可调整的，所述调整采用掺入不同 层中的不同发射物组合来进行。根据一个具体实施方式，以逐步形式评估了所 述多色UCN作为用于多从检测细胞标志物(如图7中示意)的有希望的候选物的 可行性，首先检测单一靶标－人表皮生长因子受体2(HER2)－在一些乳腺癌细 胞(例如SK-BR-3)的表面上过表达的癌症标志物。使共价偶联至羧基基团官能化 的UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)的HER2抗体与活SK-BR-3细胞孵育4小时。 用980nm NIR光激发这些细胞显示强烈显著的荧光，该荧光似乎是细胞核区域 周围染色的明亮边缘(基于采用4',6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)的双链DNA染色 的跟踪)(图8a,c和图9)。采用Alexa Fluor 488-伴刀豆球蛋白A偶联物对细胞膜染 色，我们能够确认这些抗-HER2-UCN定位在质膜的外表面(图8d)，表明了UCN- 抗体偶联物对其细胞表面受体靶标的特异性。完全相反地，在相同染色条件下 暴露于UCN的HER2-低表达MCF-7乳腺癌细胞在980nm激光激发下产生最小的 所述荧光(图8b和图9)。这表明UCN抗体偶联物以特异方式结合至其靶标，并且 有用于检测不同样品之间细胞标志物的不同或变化表达水平，如同本文通过在 不同细胞系上标记HER2示例的那样。还通过将另一种颜色的UCN(A:Yb,Tm– 显示显著蓝色发射)偶联至第二细胞表面受体抗体－抗骨形态发生蛋白受体II 型(BMPR2)来评估UCN技术作为检测不同阵列的细胞标志物的标记工具的强 健性。将SK-BR-3细胞与这些UCN孵育显示BMPR2在所述细胞表面上的有效染 色(图10)。
除特异性以外，对于大多数基于荧光的应用而言至关重要的另一个重要特 征是光稳定性。这在实时监控细胞事件动力学的活细胞成像中尤为如此，由此 采用常用于提供针对光褪色的保护的不退色封固剂现在变得不实用。本文中， 通过采用抗-HER2-UCN作为标记试剂来监测SK-BR-3细胞在其培养条件在失 去常规供给5％二氧化碳(CO2)和常温37℃后受到干扰时的死亡来延伸上述研 究。这些抗-HER2-UCN-染色的SK-BR-3细胞的死亡进程(推测是通过坏死)采 用延时共聚焦显微镜来跟踪。死亡细胞的膨胀和最终的质膜破裂在两小时时程 中被实时不显眼地(unobtrusively)捕捉(图11)，在该过程中，UCN荧光信号 非常稳定，尽管在已知影响传统荧光团的光稳定性的培养介质环境中也是如 此。
已显示UCN是检测单一靶标的具有高特异性和光稳定性的有效标记物，建 立了其在同时多重检测3T3成纤维细胞系单一样品的两种细胞表面受体- BMPR2和血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)，以及一种胞内结构－微管的 可行性。
为了实现该目的，使具有三种发射光谱(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm； A:Yb,Tm；和A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm)的UCN偶联至针对BMPR2、PDGFRα 和α-微管蛋白的相应抗体。然后，使这三种细胞靶标各自单一地用这些UCN- 抗体偶联物标记，然后进行多重检测设置。如图12a和图13中所示，与UCN孵 育过夜的固定的3T3细胞显示总体输出色彩的上转换荧光，这以其各自的发射 概况为特点。由此可推断，UCN抗体偶联物可轻易地适应针对固定样品的应用。 事实上，这些观察结果与先前的结果相一致，并且对其在采用不同样品处理方 法的大量细胞上检测不同阵列的细胞靶标的稳健性提供进一步的支持。
接着，建立双色多重UCN系统对活3T3双染色，这通过使所述细胞与抗 -BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)和抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)的混 合物孵育4小时来进行。
在980nm激发下，两种视觉可分辨的上转换荧光色同时明显存在于这些细 胞中(图12b和图14和15)，显示BMPR2和PDGFRα在3T3细胞上的不同空间分布。 最后，将该研究延伸至多重系统，其中伴随先前的抗-BMPR2-和抗- PDGFRα-UCN添加第三抗-α-微管蛋白-UCN-(A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm)以对 固定的3T3细胞进行三重染色。同样地，观察到具有光谱可分辨色的上转换荧 光，其具有各UCN发射概况的特点(图12c)。
共价偶联至羧基基团官能化的上转换荧光纳米颗粒(其中 A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)的HER2抗体间的连接的量也通过改进Bradford试验 (详细描述请见下文)定量地确认，其显示24.325μg的HER2抗体偶联至0.005 mmol的上转换荧光纳米颗粒，如图20所示。
用于制备所述上转换荧光纳米颗粒的方法可如下所述。
(NaYF4)核UCN合成
所有的化学物质都购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣 路易斯)公司并且无需进一步纯化即可使用。NaYF4:20％Yb,2％Er(或0.3％Tm) 纳米晶体按照如下文献中先前报道的方案(有修改)合成(Li等,Advanced Materials,2008；Qian和Zhang,Langmuir,2008)。0.8mmol YCl3,0.20mmol YbCl3和0.02mmol ErCl3(或0.003mmol TmCl3)与6ml油酸和15ml十八烯在50ml烧瓶 中混合。将所述溶解升温至150℃以形成均一溶液，然后冷却至室温(RT)。接 着，将内含4mmol NH4F和2.5mmol NaOH的10ml甲醇溶液添加至所述烧瓶并 搅拌30分钟。随后，将该溶液缓慢升温以去除甲醇，随后在100℃除气10分钟。 然后，使其升温至300℃并保持在该温度下，氩气气氛1.5小时。使所述溶液冷 却至RT，然后用丙酮将纳米晶体从溶液沉积出来。然后，用乙醇/水(1:1v/v)将 其洗涤三次，并且最终在环己烷中分散以供后续使用。
AB(NaYF4@NaYbF4)核-壳UCN合成
1mmol YbCl3和0.02mmol ErCl3(或0.003TmCl3)与6ml油酸和15ml十八 烯在50ml烧瓶中混合。将所述溶解升温至150℃以形成均一溶液，然后冷却。 随后，从先前步骤获得的其中分散有核纳米晶体的环己烷溶液添加至烧瓶。使 该溶液保持在70℃以去除环己烷溶剂，并且随后冷却至RT。然后，将内含4mmol NH4F和2.5mmol NaOH的10ml甲醇溶液添加至所述烧瓶并搅拌30分钟。随后， 将该溶液缓慢升温以去除甲醇，随后在100℃除气10分钟。随后，使该溶液升 温至300℃在氩气气氛下保持1.5小时。使所述溶液再一次冷却，然后用丙酮将 纳米晶体从溶液沉积出来。其用乙醇/水(1:1v/v)洗涤三次，然后使所得的AB纳 米晶体分散在环己烷中供于后续的层被覆。
ABA(NaYF4@NaYbF4@NaYF4)夹心结构的UCN合成
0.8mmol YCl3,0.20mmol YbCl3和0.02mmol ErCl3(或0.003mmol TmCl3) 与6ml油酸和15ml十八烯在50ml烧瓶中混合。将所述溶解升温至150℃以形成 均一溶液，然后冷却。接着，向烧瓶中添加从先前步骤中获得的其中分散有核 -壳AB纳米晶体的环己烷溶液。使该溶液保持在70℃以蒸发去除环己烷，并且 随后冷却至RT。将内含4mmol NH4F和2.5mmol NaOH的10ml甲醇溶液添加至 所述烧瓶并搅拌30分钟。随后，使该溶液缓慢升温以去除甲醇，在100℃脱气 10分钟，然后升温至300℃，氩气气氛下1.5小时。使所述溶液再一次冷却，然 后用丙酮将纳米晶体从溶液沉积出来。用乙醇/水(1:1v/v)对其洗涤三次。所得 的纳米颗粒即是夹心结构的ABA UCN。
抗体与上转换荧光纳米颗粒(UCN)的偶联
采用EDC-NHS化学法将抗体共价偶联至UCN。UCN首先用羧基乙基硅烷三醇 钠盐羧基化。将0.25ml的CO-520、4ml的环己烷和1ml的其内分散有0.02M ABA UCN的环己烷混合在瓶中，然后进行超声处理。然后，向该瓶添加0.04ml 的氨(33wt％)并将其密封，然后猛烈振荡以形成透明乳剂。接着，向该溶液添 加5μl的TEOS和5μl的羧基乙基硅烷三醇钠盐，然后以60rpm剧烈搅拌该溶液 两天。用乙醇使产物沉积出来，用乙醇/水(1:1v/v)洗涤两次，然后储存在水中。 1ml的2mM UCN用1μl的0.2mg/μl N-羟基琥珀酰亚胺和1μl的0.3mg/μl 1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸酯在剧烈振荡15分钟的条件下激活。然 后，去除激活缓冲液并对该混合物用新鲜DI水加满。将20μl的4μg/μl抗体溶液 添加至活化的颗粒并在4℃孵育3小时。所述抗体的详细情况如下：抗-HER2 (AbD Serotec公司，英国牛津基林顿)；抗-BMPR2(N-末端)(Abgent公司，美国 加利福尼亚州圣迭戈)；抗-PDGFRα(细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technology)，美国马萨诸塞州贝弗利)；抗-α-微管蛋白(细胞信号转导技术公司， 美国马萨诸塞州贝弗利)。然后，所述颗粒用水洗涤两次，每次洗涤之间有离心 步骤，以5,000rpm离心5分钟。最后，使UCN-抗体偶联物重悬并储存于1ml的 DI水。
改进的Bradford试验
首先制备HER2抗体四种不同浓度(0、5、10、15和20μg/ml)的标准溶液。 这些标准物，以及UCN-抗体偶联物(如上所得)的悬液，各自与亮 蓝G-250染料(Bio-Rad)以4:1的比例涡旋混合。室温下孵育5分钟后，检测各样品 在595nm处的吸光度。基于由标准物HER2抗体溶液的吸收光谱生成的标准曲 线计算偶联至UCN的抗体的浓度。
细胞培养
SK-BR-3细胞在McCoy5A培养基中而MCF-7和NIH-3T3细胞在杜贝克氏改 良伊格培养基在37℃下潮湿、5％CO2气氛的条件下生长。所有的培养基均补 充10％胎牛血清、100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。染色之前的一天， 将所述细胞接种在合适的培养皿上，SK-BR-3和MCF-7细胞以57,000个细胞/cm2的密度接种，而NIH-3T3细胞以30,000个细胞/cm2的密度接种。在第二天如下详 述进行染色。
活细胞染色
先前接种的细胞用抗-HER2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)、抗 -BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)、抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)或其 组合，分别以预优化的胞外浓度0.342、0.125和3.56mM孵育。通过将其在37℃ 于潮湿条件下，5％CO2气氛中孵育3小时来使UCN结合到相应的细胞表面受体 上。在该孵育阶段的最后30分钟，其质膜用0.1mg/ml Alexa Fluor 488-偶联的伴 刀豆球蛋白A复染，核用0.02mg/ml DAPI复染。然后，弃去包含未结合的UCN 和过量复染染料的旧培养基。细胞用培养基洗涤两次，并用1x磷酸盐缓冲盐水 (PBS)洗涤一次，然后在4％多聚甲醛中室温固定10分钟。然后，其在1x PBS中 清洗两次，每次5分钟。
固定细胞染色
先前接种的细胞在4％多聚甲醛中室温固定10分钟。然后使其在1x PBS中 再水合5分钟，该步骤重复两次。就用抗-α-微管蛋白-UCN的细胞的后续染色而 言，对所述细胞进行在内含0.1％曲通X-100的PBS中室温渗透5分钟的额外步骤。 非特异性结合位点用内含2％山羊血清和2％牛血清白蛋白的0.1％吐温20在37℃ 封闭1小时。然后，使所述细胞与抗-BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm)、抗 -BMPR2-UCN-(A:Yb,Tm@B:Er@A:Yb,Tm)、抗-PDGFRα-UCN-(A:Yb,Tm)、抗-α- 微管蛋白-UCN-(A:Yb,Er@B:Tm@A:Yb,Tm)或其组合，分别以预优化的胞外浓 度3.56、0.125、3.56和1.78mM孵育。通过使其在4℃孵育过夜来使UCN结合至 相应的细胞标志物。第二天，细胞用1x PBS洗涤三次。其核用0.1μg/ml DAPI 在室温下复染5分钟，然后用1x PBS洗涤两次，各5分钟。
UCN染色细胞的共聚焦成像
UCN、DAPI和Alexa Fluor 488在所述细胞上的染色通过在分别980、408和 488nm利用共聚焦激光扫描显微镜(Nikon C1Confocal,尼康公司(Nikon Inc.), 日本东京)来观察，该显微镜特别配有连续波980nm激光激发源(Opto-Link公司， 香港)。
本发明的上转换荧光纳米颗粒可适合用于若干应用。例如，所述上转换荧 光纳米颗粒可适合用于，但不限于，可光活化的基因治疗、光化学内化、光活 化的离子通道、光动力学治疗等。多色上转换纳米颗粒可用作通用荧光标记物， 用于多重生物成像和生物试验应用，例如，以开发用于多重检测和定量测量生 物标记物的试剂盒。这些纳米颗粒的其它应用包括，但不限于，例如，计算和 存储；电子学和显示器；光电子装置例如LED、照明设备和激光；用于无线电 通讯的光学组成；以及安全应用，例如隐蔽的鉴定标记或生物战检测传感器。
根据第二方面，本发明提供包含上述上转换荧光纳米颗粒的制品。所述制 品可以是任何合适的物品。例如，所述制品可以是(但不限于)生物探针、药 物递送运载体、生物成像装置、生物实验物、用于生物检测的装置或光电子装 置。
根据第三方面，本发明提供生物成像和/或生物检测设备，所述装置包含至 少一种上述的上转换荧光纳米颗粒，至少一种生物分子以及至少一种激发源。 所述生物分子可以是任何合适的生物分子。例如，所述生物分子可以如上所述。 所述至少一种激发源可以是任何合适的源。例如，所述激发源可以是NIR。具 体而言，所述NIR可以在980nm处。
就上文描述示例性实施方式的描述而言，本领域技术人员应理解，本技术 可涉及多种设计、构造和/或操作的具体变化方式，而这并不偏离本发明。
参考文献
1.Li ZQ等,Multicolor core/shell-structured upconversion fluorescent nanoparticles(多色核/壳结构的上转换荧光纳米颗粒),Advanced Materials, 2008,20:4765-4769；
2.Qian HS和Zhang Y,Synthesis of hexagonal-phase core-shell NaYF4nanocrystals with tunable upconversion fluorescence(具有可调整上转换荧 光的六边形相核-壳NaYF4纳米晶体的合成),Langmuir,2008, 24:12123-12125.