一种预防或/和治疗流感的保健茶及其制备方法.pdf

本发明公开了一种预防或/和治疗流行性感冒的保健茶及其制备方法，该保健茶由浸泡液人参提取物溶液中的金银花、连翘叶制成。本发明的防治流感保健茶中金银花、连翘叶的寒性和人参的燥性相互平衡或抵消，茶香醇厚、温而不寒、不燥，既能够在治疗流行性感冒又能够在流感易发季节作为增强免疫能力保健茶饮用，适用于人们日常茶饮，起到很好的预防、治疗流感的作用。本保健茶效果明显、服用方便、口感好，无任何毒副作用。

权利要求书
1.  一种预防或/和治疗流行性感冒的保健茶，其特征是包括如下原料药：金银花、连翘叶、人参。

2.  如权利要求1所述的保健茶，其特征是所述原料药的重量份配比为100：100：1-10。

3.  一种预防或/和治疗流行性感冒的保健茶的制备方法，其特征是包括如下步骤：
1)按照以下重量份配比准备原料药：
金银花100、连翘叶100、人参1-10
2)将人参与提取溶剂混合后进行加热提取，收集提取液；
3)将提取液浓缩，制成人参提取物浸膏；
4)将人参提取物浸膏与水或醇溶液混合均匀，制成人参提取物溶液；
5)将金银花、连翘叶加入到人参提取物溶液中，搅拌、混合均匀，制得金银花-连翘叶-人参混合物，然后进行烘干处理，即得。

4.  如权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤1)中所述原料药的重量份配比为：金银花100、连翘叶100、人参2-5。

5.  如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是步骤1)中所述人参选择人参茎、人参叶或人参根中的一种或多种。

6.  如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是步骤2)中所述提取溶剂选择水或醇溶液。

7.  如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是步骤3)中所述人参提取物浸膏的相对密度为1.05-1.25。

8.  如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是步骤4)中所述人参提取物溶液的浓度为1-60％。

9.  如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是步骤5)中还包括将金银花、连翘叶浸泡在所述的人参提取物溶液中30-60min，再进行所述的烘干处理。

10.  如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是步骤5)中烘干处理温度为60-90℃。

说明书一种预防或/和治疗流感的保健茶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种预防或/和治疗流行性感冒的保健品及其制备方法，特别涉及一种源自植物的预防或治疗流行性感冒的保健茶及其制备方法，属于茶剂、饮品、及功能食品领域。
背景技术
金银花，学名(Japan-ese Honeysuckle)，又名忍冬，为忍冬科多年生半常绿木本植物。“金银花”一名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。药材金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花。金银花自古被誉为清热解毒的良药。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症，均效果显著。金银花含有大量对人体有益的物质，其中包括绿原酸，异绿原酸,木犀草酸、木犀草素-葡萄糖苷、忍冬苷、皂苷、挥发油、肌醇、鞣质,环烯醚萜甙裂环马钱素、獐牙菜甙等，属名贵中药材，沂蒙山地区是主要产地。
金银花自古以来就以它的药用价值广泛而著名。《神农本草经》载：“金银花性寒味甘，具有清热解毒、凉血化淤之功效，主治外感风热、瘟病初起、疮疡疔毒、红肿热痛、便脓血”等。《本草纲目》中详细论述了金银花具有“久服轻身、延年益寿”的功效。二十世纪八十年代，国家卫生部对金银花先后进行了化学分析，结果表明：金银花含有多种人体必须的微量元素和化学成分，同时含有多种对人体有利的活性酶物质，具有抗衰老，防癌变，轻身健体的良好功效。
连翘叶属木犀科植物连翘的干燥叶片，根据《四川省中药材标准》采收，并按照《四川省中药饮片炮制规范》加工生产。
据《本草纲目》、《中药大辞典》、《神农本草经》的记载，巴蜀所产连翘茎、叶可治心肺积热、清热解暑、生津止渴、利咽润喉，长期服用令人面悦好、 明目清心、轻身耐老，令人焕发青春活力。
人参为五加科多年生草本植物，中国古老的关于中药的药学典籍《神农本草经》把人参列为上品，言其“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，明目，开心益智，久服有轻身延年之功效”。经现代医学研究及化验分析表明，人参内含有一种叫人参皂甙的化学物质，它对调节人的中枢神经系统、强心、抗疲劳、调节物质代谢等有明显功效，所以对治疗神经系统.心血管系统、内分泌系统及生殖系统的多种疾病有很好的治疗作用。
人参提取物浸泡金银花、连翘叶，可使寒性、燥性相抵，温而不寒、不躁，三种中药共同发挥防治感冒、增强体质的作用。
发明内容
本发明的主要目的是针对上述预防或/和治疗流行性感冒的保健品及中药制剂的现有技术和产品存在的问题，提供一种用于预防或/和治疗流感的保健茶及其制备方法。本发明的防治流感的保健茶具有提高人体免疫能力，预防、治疗流感的功效显著，金银花、连翘叶的寒性和人参的燥性相互平衡或抵消，茶香醇厚、温而不寒、不燥，适用于人们日常茶饮。而且本发明的预防或/和治疗流感的保健茶的制备方法简便、生产工艺稳定、价格低廉及便于携带和使用
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种预防或/和治疗流行性感冒的保健茶，包括如下原料：金银花、连翘、人参。
其中，所述原料的重量份配比为：金银花：连翘叶：人参为100：100：1-10，优选为100：100：2-5。
特别是，所述连翘选择连翘叶；所述人参选择人参茎、人参叶或人参根中的一种或多种。
本发明的防治流感的保健茶中金银花、连翘叶、人参组合使用，使得各药物的功效产生协同增效作用，提高预防、治疗流行性感冒的效率。
金银花别称银花、双花、二花、二宝花，为忍冬科植物忍冬、红腺忍冬、山银花(毛萼忍冬)或毛花柱忍冬的干燥花蕾或带初开的花。性寒、味甘；归肺、心、胃经。具有清热解毒，凉散风热的功效，主要用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。
金银花用于外感风热或温病初起；疮痈肿毒、咽喉肿痛；热毒引起的泻痢便血(粪便中夹有黏液和血液)。既可清透疏表，又能解血分热毒，尤为治阳性疮疡的要药。
金银花的化学成分主要含有木犀草素、绿原酸、异绿原酸、白果醇、β-谷甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇-D-葡萄糖甙、豆甾醇-D-葡萄糖甙等，肌醇约1％及皂甙、鞣质等。
现代药理研究表明金银花具有①抗病原微生物作用：体外实验表明金银花多种致病菌如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌等均有一定抑制作用，对肺炎球菌、脑膜炎双球菌、绿脓杆菌，结核杆菌亦有效。水浸剂比煎剂作用强，叶煎剂比花煎剂作用强。②抗炎和解热作用：腹腔注射金银花提取液0.25g/kg，能抑制大鼠角叉菜胶性脚肿。③加强防御机能作用：金银花煎剂稀释至1：1280的浓度，仍能促进白细胞的吞噬功能。小鼠腹腔注射金银花注射液，也有明显促进炎性细胞吞噬功能的作用。④中枢兴奋作用：经电休克、转笼等多种实验方法证明口服绿原酸后，可引起大鼠、小鼠等动物中枢神经系统兴奋，其作用强度为咖啡因的1/6。⑤降血脂作用：大鼠灌胃金银花2.5g/kg能减少肠内胆固醇吸收，降低血浆中胆固醇含量。
连翘又称连壳、黄花条、黄链条花、黄奇丹、青翘、落翘，为木犀科植物连翘的干燥果实。性微寒、味苦，归肺、心、小肠经。具有清热解毒，消肿散结的功能，主要用于治疗痈疽，瘰疠，乳痈，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋尿闭。连翘性凉味苦，轻清上浮，可治上焦诸热，尤能解毒消痈而散结。
连翘果实含木脂体类化合物：连翘甙、连翘甙元、右旋松脂酚、右旋松脂醇葡萄糖甙；黄酮类化合物：芸香甙；苯乙烷类衍生物：连翘脂甙A、C、D、E，连翘种甙，毛柳甙；乙基环己醇类衍生物：(木来)木甙，连翘环己醇，异连翘环己醇，连翘环己醇氧化物，连翘环己醇酮，连翘环己醇甙A、B、C；三萜类化合物：白烨脂酸，齐墩果酸，熊果酸，β-香树脂醇乙酸酯，异降香萜烯酸乙酸酯，20(S)-达玛-24-烯-3β，20-二醇-3-乙酸酯等。青连翘含皂甙4.89％，生物碱0.2％。
连翘具有①抗菌、抗病毒作用：连翘浓缩煎剂在体外有抗菌作用，可抑制伤 寒杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、白喉杆菌及霍乱弧菌、葡萄球菌、链球菌等；连翘种子挥发油乳剂在鸡胚外对京科68-1株和仙台株病毒均有显着的抗病毒作用。②连翘对心血管系统有影响，具有强心及升压作用；③连翘注射液对醋酸所致的毛细血管通透性有明显抑制作用。④连翘对豚鼠离体小肠有抑制作用；⑤抑制弹性蛋白酶活力作用；⑥抗辐射损伤。连翘甲醇提取物1g/kg腹腔注射，于X线照射前5分钟给药，对小鼠皮肤损害有防护作用。
人参为五加科多年生草本植物，中国古老的关于中药的药学典籍《神农本草经》把人参列为上品，言其“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，明目，开心益智，久服有轻身延年之功效”。人参性平、味甘、微苦；归脾、肺、心经。具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津，安神的功能。主要用于体虚欲脱，肢冷脉微，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，内热消渴，久病虚羸，惊悸失眠，阳痿宫冷；心力衰竭，心原性休克。
人参含有人参皂苷和少量挥发油，油中主要成份为人参烯；据报导从根中分离出皂甙类：人参皂甙A、B、C、D、E和F等。人参皂甙B和C水解后产生人参三醇皂甙元，人参皂甙D、E和F水解后得20－表人参二醇皂甙元。又自乙醚提取物的低沸点部分分离出β－榄香烯。高沸点部分分离出人参炔醇。此外尚含有单糖类：葡萄糖、果糖、蔗醣，三种三糖：葡萄糖－果糖－果糖、三聚葡萄糖，葡萄糖－葡萄糖－果糖，人参酸(为软脂酸、硬脂酸及亚油酸的混和物)，多钟维生素(B1、B2、菸酸、菸酰胺、泛酸)，多种氨基酸、胆碱、酶(麦芽糖酶、转化酶、酯酶)，精胺及胆胺。人参的地上部分含黄酮类化合物，人称人参黄甙、三叶甙、山柰醇、人参皂甙、β－谷甾醇及糖类。
人参的主要功效成分是人参皂甙(Ginsenoside)，现代药理研究证明其具有提高免疫、滋补强壮、活血化瘀、抗疲劳等功效。
本发明另一方面提供一种预防或/和治疗流行性感冒的保健茶的制备方法，包括如下步骤：
1)按照以下重量份配比准备原料药：
金银花 100、连翘 100、人参1-10
2)将人参与提取溶剂混合后进行加热提取，收集提取液；
3)将提取液浓缩，制成人参提取物浸膏；
4)将人参提取物浸膏与水或醇溶液混合均匀，制成人参提取物溶液；
5)将金银花、连翘与人参提取物溶液混合均匀，制得金银花-连翘-人参混合物，然后进行烘干处理，即得。
其中，步骤1)中所述原料药的重量份配比为：金银花 100、连翘 100、人参2-5。
特别是，所述连翘选择连翘叶；所述人参选择人参茎、人参叶或人参根中的一种或多种。
其中，步骤2)中所述提取溶剂选择水或醇溶液。
特别是，所述醇溶液选择质量百分比浓度为1-80％的乙醇-水溶液或甲醇-水溶液，优选为质量百分比浓度为10-60％乙醇-水溶液或甲醇-水溶液。
其中，所述加热提取过程中提取温度为85-100℃，优选为90-100℃；提取次数为2-3次；每次提取时间为30-90min。
特别是，每次加热提取过程中人参与提取溶剂的重量份配比为8-12：1。
特别是，还包括将人参与提取溶剂混合后，浸泡30-60min后在进行所述的加热提取。
其中，所述的加热提取包括如下顺序进行的步骤：
A)将人参加入到提取溶剂中，加入的提取溶剂与人参的重量之比为8-12：
1，浸泡30-60min后进行第一次加热提取，加热温度为85-100℃，加热提取时间为30-90min；
B)将第一次提取液进行过滤，收集滤液；
C)向滤渣中加入提取溶剂1-2次，进行加热提取，其中，每次加入的提取溶剂的重量与人参的重量之比为8-12：1，加热温度为85-100℃，加热提取时间为30-90min；
D)过滤，将过滤后的滤液合并，得到人参提取液。
其中，步骤3)中所述人参提取物浸膏的相对密度为1.05-1.25，即将人参提取液浓缩至相对密度为1.05-1.25；所述浓缩过程中浓缩温度为80-90℃。
其中，步骤4)中所述醇溶液选择质量百分比浓度为30-50％的乙醇溶液-水溶液；所述水选择温度为50-70℃的热水，优选为60℃热水。人参提取物浸膏与水或醇溶液混合后，溶解，制成人参提取物溶液。
特别是，所述人参提取物浸膏与水或醇溶液的重量份配比为1-60：100，优选为10-50：100。
其中，步骤4)中所述人参提取物溶液的浓度为1-60％(w/v)，优选为10-50％(w/v)。
其中，步骤5)中还包括将与所述人参提取物溶液混合均匀金银花、连翘浸泡在所述的人参提取物溶液中30-60min后再进行所述的烘干处理。
特别是，所述浸泡的温度为30-50℃。
其中，步骤5)中所述烘干处理的温度为60-90℃。
特别是，还包括将烘干后的混合物粉碎并过10目筛。
本发明的防治流感保健茶的活性成分可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、黏合剂等以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用的口服剂型，如丸剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液等。
本发明保健茶具有宣散风热，清解血毒，透邪外出，散结消肿，去除邪气等功能，用于预防、治疗流行性感冒。
本发明制备的防治流感保健茶使用时，每天口服2-3次，每次2-5克(生药)，可以作为日常饮品连续使用，增强机体免疫力，预防、治疗流行性感冒。。
本发明的防治流感的保健茶具有如下优点和好处：
1、本发明的防治流感的保健茶组方配伍科学，疗效确切，安全性高，质量可控。
2、本发明的防治流感的保健茶中金银花、连翘叶的寒性和人参的燥性相互平衡或抵消，茶香醇厚、温而不寒、不燥，适用于人们日常茶饮。
3、本发明制备防治流感的保健茶的过程中金银花，连翘叶浸泡于人参提取物溶液中后，直接与人参提取物一并烘干，不经过提取，没有任何成分的流失，最大程度的保留了药物的有效成分，充分发挥其抗流感的作用。
4、本发明提供了一种新的金银花，连翘叶的应用形式。
5、本发明制备的防治流感的保健茶，采用天然药材合理复配而成，从人参调节人体免疫力着手，通过金银花，连翘叶这两个经典的清热解毒的传统中药共同作用，达到预防、治疗流感的目的，因此，本发明的产品具有标本兼治、预防和治疗流感的多重功效。
6、本发明的防治流感的保健茶的制备方法简单，工艺条件温和，制造成本低。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、按照如下重量配比备料(×100g)
金银花 100 连翘叶 100 人参茎叶 5
2、制备人参提取物浸膏
2-1)将原料药材人参茎叶500g与自来水加入到中药多功能提取罐内，于室温(15-30℃)下浸泡30min，其中自来水与人参茎叶的重量之比为12：1；
2-2)开启多功能提取罐电源进行加热，加热至100℃，保持在此温度下恒温提取60min，然后过滤，得到第一次提取液；
2-3)向滤渣中分2次加入自来水，加热提取2次，每次加热提取的温度为100℃，加入的自来水的重量与人参茎叶重量之比为12：1，提取时间为1小时，过滤得到2次提取液；
2-4)将3次加热的提取液合并，得到总提取液后进行加热，进行蒸发浓缩处理，得到相对密度为1.1的浸膏(162g)，其中，浓缩温度为90℃；
3、配制人参提取物溶液
向步骤2)制备的人参提取物浸膏中加入温度为60℃热水，搅拌，溶解均匀，制成人参提取物溶液(540ml)，其中人参提取物溶液的浓度为30％(w/v)；
4、制备金银花-连翘-人参混合物 
将金银花、连翘叶与人参提取物溶液混合，并浸泡与人参提取物溶液中，搅拌均匀，于30℃下浸泡60min后得到金银花-连翘-人参混合物；在浸泡过程中 金银花、连翘叶将人参提取物溶液全部吸收。
5、烘干处理 
将获得的金银花-连翘-人参混合物置于烘箱中，进行常压烘干处理，其中烘干温度为90℃，烘干至含水率为12％；
将烘干后的混合物粉碎并过10目筛后装袋，制成10万袋防治流感的保健茶。
实施例2
1、按照如下重量配比备料(×100g)
金银花 100 连翘叶 100 人参茎叶 3
2、制备人参提取物浸膏
2-1)将原料药材人参根300g与自来水加入到中药多功能提取罐内，浸泡45min，其中自来水与人参茎叶的重量之比为10：1；
2-2)开启多功能提取罐电源进行加热，加热至90℃，保持在此温度下恒温提取90min，然后过滤，得到第一次提取液；
2-3)向滤渣中分2次加入自来水，加热提取2次，每次加热提取的温度为90℃，加入的自来水的重量与人参根重量之比为10：1，提取时间为90min，过滤得到2次提取液；
2-4)将3次加热的提取液合并，得到总提取液后进行加热，进行蒸发浓缩处理，得到相对密度为1.2的浸膏(87g)，其中，浓缩温度为80℃；
3、配制人参提取物溶液
向步骤2)制备的人参提取物浸膏中加入30％的乙醇-水溶液，搅拌，溶解均匀，制成人参提取物溶液(174ml)，其中人参提取物溶液的浓度为50％(w/v)；
4、制备金银花-连翘-人参混合物 
将金银花、连翘叶与人参提取物溶液混合，并浸泡与人参提取物溶液中，搅拌均匀，于50℃下浸泡40min后得到金银花-连翘-人参混合物；在浸泡过程中金银花、连翘叶将人参提取物溶液全部吸收。
5、烘干处理 
将获得的金银花-连翘-人参混合物置于烘箱中，进行常压烘干处理，其中 烘干温度为80℃，烘干至含水率为15％；
将烘干后的混合物粉碎并过10目筛后装袋，制成10万袋防治流感的保健茶。
实施例3
1、按照如下重量配比备料(×100g)
金银花 100 连翘叶 100 人参茎叶 2
2、制备人参提取物浸膏
2-1)将原料药材人参茎叶200g与自来水加入到中药多功能提取罐内，浸泡60min，其中自来水与人参茎叶的重量之比为8：1；
2-2)开启多功能提取罐电源进行加热，加热至100℃，保持在此温度下恒温提取30min，然后过滤，得到第一次提取液；
2-3)向滤渣中分2次加入自来水，加热提取2次，每次加热提取的温度为100℃，加入的自来水的重量与人参根重量之比为8：1，提取时间为30min，过滤得到2次提取液；
2-4)将3次加热的提取液合并，得到总提取液后进行加热，进行蒸发浓缩处理，得到相对密度为1.05的浸膏(82g)，其中，浓缩温度为85℃；
3、配制人参提取物溶液
向步骤2)制备的人参提取物浸膏中加入质量百分比浓度为30％的乙醇-水溶液，搅拌，溶解均匀，制成人参提取物溶液(820ml)，其中人参提取物溶液的浓度为10％(w/v)；
4、制备金银花-连翘-人参混合物 
将金银花、连翘叶与人参提取物溶液混合，并浸泡于人参提取物溶液中，搅拌均匀，于50℃下浸泡30min后得到金银花-连翘-人参混合物；在浸泡过程中金银花、连翘叶将人参提取物溶液全部吸收。
5、烘干处理 
将获得的金银花-连翘-人参混合物置于烘箱中，进行常压烘干处理，其中烘干温度为85℃，烘干至含水率为9％；
将烘干后的混合物粉碎并过10目筛后装袋，制成10万袋防治流感的保健茶。
实施例4
1、按照如下重量配比备料(×100g)
金银花 100 连翘叶 100 人参茎叶 4
2、制备人参提取物浸膏
2-1)将原料药材人参根400g与自来水加入到中药多功能提取罐内，浸泡60min，其中自来水与人参茎叶的重量之比为12：1；
2-2)开启多功能提取罐电源进行加热，加热至85℃，保持在此温度下恒温提取90min，然后过滤，得到第一次提取液；
2-3)向滤渣中加入自来水，加热提取1次，加热提取温度为85℃，加入的自来水的重量与人参根重量之比为12：1，提取时间为90min，过滤得到第2次提取液；
2-4)将2次加热的提取液合并，得到总提取液后进行加热，进行蒸发浓缩处理，得到相对密度为1.1的浸膏(118g)，其中，浓缩温度为80℃；
3、配制人参提取物溶液
向步骤2)制备的人参提取物浸膏中加入质量百分比浓度为50％的乙醇-水溶液，搅拌，溶解均匀，制成人参提取物溶液(295ml)，其中人参提取物溶液的浓度为40％(w/v)；
4、制备金银花-连翘-人参混合物 
将金银花、连翘叶、与人参提取物溶液混合，并浸泡于人参提取物溶液中，搅拌均匀，于40℃下浸泡50min后得到金银花-连翘-人参混合物；
5、烘干处理 
将获得的金银花-连翘-人参混合物置于烘箱中，进行常压烘干处理，其中烘干温度为70℃，烘干至含水率为14％；
将烘干后的混合物粉碎并过10目筛后装袋，制成10万袋防治流感的保健茶。
试验例1防治流感保健茶抗流感病毒作用的研究
1.实验材料
1.1药品
防治流感保健茶：大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130121。
利巴韦林注射液，无色透明液体，由河南润弘股份有限公司生产，产品批号：1206261，国药准字：H19993553，100mg/ml，作为本次试验阳性对照药物。
上述药品均用纯净水溶解，滤过，除菌分装，4℃备用，为本次试验待测药物。
1.2细胞株
Vero(非洲绿猴肾细胞细胞)由吉林大学基础医学院保存细胞株。
1.3病毒株
1)流感病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所。
2)副流感病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所。
3)呼吸道合胞病毒(RSV)购于中国预防医学科学院病毒研究所。
1.4仪器与试剂 
培养基：DMEM，HyClone
胎牛血清：HyClone
胰蛋白酶：Gibco
MTT：Sigma
DMSO：天津市北联精细化学品开发有限公司
生物安全柜：BHC-1300ⅡA/B3，AIRTECH
CO2培养箱：MCO-18AIC，SANYO
倒置显微镜：CKX41，OLYMPUS
电子分析天平：AR1140/C，DHAUS
2.实验方法
2.1细胞准备
Vero细胞传代培养1-2d，使之成片，界线清晰，立体感及折光度强时，用胰酶消化，待细胞面出现针尖样小孔，吸尽消化液，取数毫升培养液吹散细胞，计数，用培养液(含10％胎牛血清的DMEM)稀释至约5×107个/L后，接种于96孔培养板内，待细胞长成单层。
2.2药物毒性测定 
细胞毒性试验：将药物用维持液(含2％胎牛血清的DMEM)按表1所示浓 度进行稀释，用于细胞毒性测定。
表1药物稀释参照表(单位：g/L)

将上述稀释好的不同浓度的药品滴加于Vero单层细胞上，每孔0.2ml，每个浓度6个复孔，另设6孔正常对照(不加药物的正常对照组)和6孔空白对照(培养液)，置37℃，5％CO2培养箱中培养，每日置倒置显微镜观察CPE并记录。72h后，每孔加入MTT溶液20μL(5mg·mL－1)，继续孵育4h，吸弃各孔培养液，每孔加入100μL DMSO，振荡5min，492nm测定OD值，计算细胞存活率。在SPSS18.0统计软件中，将细胞存活率进行Probit回归分析，计算药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC0)和半数毒性浓度(TC50)。
2.3药物对病毒致细胞病变作用的影响
取已长满单层细胞的培养板，吸取培养液，以100TCID50对应的病毒攻击量接种细胞，37℃，5％CO2培养箱吸附2h，加入特定浓度(最大无毒浓度左右)的各药液，每浓度6个复孔培养，200μL/孔。设利巴韦林注射液为阳性药物对照组，同时设正常对照组(不加病毒不加药)和病毒对照组(加病毒但不加药物的对照组)，观察药物对病毒致CPE的影响。72h后，用MTT比色法，在492nm波长下测定OD值，计算药物抗病毒有效率(ER％)。在SPSS18.0统计软件中用ANOVA法比较各药物抗病毒有效率之间的显著性差异。
ER％＝(药物处理组平均OD值－病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值－病毒对照组平均OD值)×100％
3.实验结果
3.1药物毒性测定结果
各药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC0)、半数毒性浓度(TC50)及药物抗病毒实验用浓度见表2。防治流感保健茶为测出半数毒性浓度(TC50)，其安全性良好。
表2药物细胞毒性实验结果(单位：g/L)

*防治流感保健茶未测出半数毒性浓度(TC50)
3.2药物对病毒致细胞病变保护作用结果
防治流感保健茶对流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒均有良好的抑制作用，其抗流感病毒、呼吸道合胞病毒均优于利巴韦林，其对副流感病毒的有效率与利巴韦林相当。实验结果见表3。
表3药物抗病毒有效率(ER％)统计表

*P<0.05,**P<0.01
试验例2.体内抗病毒试验
1实验材料
1.1药品与试剂 
防治流感保健茶：大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130121；
阳性对照药：利巴韦林注射液，由河南润弘股份有限公司生产，产品批号：1206261，国药准字：H19993553。
1.2仪器


1.3动物
昆明种小鼠雌雄各半，体重15-20g，购自大连医科大学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(辽)2004—0017。
2.实验方法
2.1动物分组
取四周龄的昆明小鼠240只，进行2项试验。取小鼠120只，随机分成12组，每组10只，前六组分别为：正常对照组、病毒对照组、利巴韦林组、防治流感保健茶高、中、低剂量组，用于防治流感保健茶对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的测定试验；以及后六组分别为正常对照组、病毒对照组、利巴韦林组、防治流感保健茶高、中、低剂量组，用于防治流感保健茶对副流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的测定试验；另取小鼠120只，随机分成12组，每组10只，按照上述分组方式分组后，用于防治流感保健茶对流感病毒感染小鼠和副流感病毒感染小鼠肺悬液病毒血凝滴度的测定试验。
2.2感染方法
对除正常对照组以外，其他小组小鼠进行感染处理，具体操作为：在200～300mL大小的烧杯内放入一团脱脂棉，然后倒入适量的乙醚(使脱脂棉变湿即可)，把装有脱脂棉的烧杯倒扣过来，把小鼠放入进行麻醉，见小鼠极度兴奋，明显呈无力样时，将小鼠仰卧，滴鼻感染15LD50流感病毒或副流感病毒0.03ml/鼻孔，正常对照组用生理盐水代替病毒悬液。
2.3给药方法及给药剂量
防治流感保健茶高、中、低给药剂量组和利巴韦林对照组，分别于感染前一天开始常规灌胃给药，防治流感保健茶高、中、低给药剂量分别为0.26、0.13、0.065g/kg，利巴韦林阳性药给药剂量为58.5mg/kg，每天一次，连续给药5d，正常对照组和病毒对照组灌服相同体积的生理盐水。
2.4观察指标
①肺指数测定 
小鼠用药后第5天，先禁食禁水8小时，称体重后摘眼球放血处死动物，打开胸腔摘出全肺，以生理盐水洗涤两次，用滤纸吸干表面水份，电子天平称肺重，按下列公式计算计算肺指数和肺指数抑制率：
肺指数＝(小鼠肺重/小鼠体重)×100％。
肺指数抑制率＝(感染模型组平均肺指数-实验组平均肺指数)/感染模型组平均肺指数×100％。
②肺悬液病毒血凝滴度测定
分别取治疗后第5天的各组小鼠肺，低温下置匀浆器研磨成匀浆，生理盐水稀释为10％的肺组织悬液，离心取上清，倍比稀释，按0.2ml/孔滴于滴定板上,每孔加入0.2ml1％鸡红细胞悬液,混匀,置室温30min,观察记录血凝滴度。以红细胞凝集(++)时为終点，以悬液稀释倍数表示其滴度。
3.实验结果及分析
3.1肺指数测定 
流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，平均肺指数结果显示：与感染病毒的模型对照组比较，正常对照组、各浓度防治流感保健茶组、利巴韦林组肺指数明显降低(P<0.05)，防治流感保健茶浓度在0.065～0.26g/kg/d范围内有一定保护作用，肺指数均明显降低，高剂量组疗效最好，中、低剂量组与利巴韦林疗效相当。实验结果见表4、5。
表4防治流感保健茶对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的影响

*表示与病毒对照组比较#表示与利巴韦林组比较
表5防治流感保健茶对副流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的影响

*表示与病毒对照组比较
3.2肺悬液病毒血凝滴度测定
流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，感染病毒的对照组肺组织病毒血凝滴度(InX)分别为33.11和32.45，不同浓度防治流感保健茶治疗5天后，肺组织病毒血凝滴度均有所下降，与病毒对照组比较，差异有显著性,(P<0.05)，中、高剂量组疗效更好，低剂量组与利巴韦林疗效相当。实验结果分别见表6、表7。
表6防治流感保健茶对流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响

*表示与病毒对照组比较#表示与利巴韦林组比较
表7防治流感保健茶对副流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响


*表示与病毒对照组比较#表示与利巴韦林组比较
试验例3防治流感保健茶提高免疫功能作用的研究
1.试验材料
1)药品与试剂 
防治流感保健茶：大连富生天然药物开发有限公司生产，批号：20130121；
阳性对照药：云芝糖肽胶囊(生产厂家：上海新康制药厂，批号：20110306、规格：0.5g/粒等)
水解蛋白：(生产厂家：广西康哲广明药业有限公司，批号：20110208、规格：10ml*6支/盒)
鸡红细胞：(生产厂家：玉环县南方试剂厂，批号：20101208、规格：100ml/瓶)
MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)：(生产厂家上海索莱宝生物科技有限公司，批号20101105、规格：250mg)
2)瘤源 小鼠肉瘤S180模型、Lewis肺癌C57BL/6小鼠模型均由上海医药工业研究院药理室传代维持。
3)实验动物
C57BL/6小鼠、昆明种小鼠(雄性)，体重18-20克，购自大连医科大学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(辽)2004—0017。
2.实验方法
2.1对正常昆明种小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能试验
取昆明种雄性小鼠60只，随机分成5组，分别为：防治流感保健茶高、中、低剂量组，阳性对照组，阴性对照组，前四组每组10只，阴性对照组为20只；
防治流感保健茶高、中、低剂量组、云芝糖肽组、阴性对照组均灌胃给药，连续10天，给药剂量如表8所示，阴性对照组给予等体积纯净水；
末次给药后各组小鼠腹腔注射0.5％水解蛋白1.5ml/只，24小时后腹腔注射每毫升1×106的鸡红细胞悬液0.2ml/只；隔40分钟后用生理盐水洗脱、收集小 鼠腹腔液；离心，取细胞沉淀液制成涂片，用甲醇固定，吉姆萨染色封片，用油镜计数100个巨噬细胞中吞噬鸡红血球的巨噬细胞数及吞噬鸡红血球的总数，按下列公式计算吞噬百分比和吞噬指数。
吞噬百分比％＝(100个巨噬细胞中吞噬鸡红血球的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％；
吞噬指数＝100个巨噬细胞中吞噬鸡红血球的总数/100个巨噬细胞。 
2.2对荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠的NK细胞活性试验 
取C57BL/6小鼠60只，趾皮下接种无菌制备的Lewis肺癌混悬液0.05ml/只(约1×106个肿瘤细胞)；
次日随机分成5组，分别为：防治流感保健茶高、中、低剂量组，阳性对照组，阴性对照组，前四组每组10只，阴性对照组为20只；
防治流感保健茶高、中、低剂量组、云芝糖肽组、阴性对照组均灌胃给药，连续10天，给药剂量如表9所示，阴性对照组给予等体积纯净水；
末次给药后次日在无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网制成单个脾细胞悬液，低渗除去红细胞，将细胞悬液转入培养瓶中，37℃5％CO2条件培养1小时后去除贴壁细胞，计数活细胞并调整细胞浓度为3×106个细胞/ml作为效应细胞。靶细胞取L929体外培养细胞，常规培养24小时，以培养液调整细胞浓度为1.5×105个细胞/ml，使效靶细胞之比为20∶1。取96孔培养板分别加入效应细胞和靶细胞，另设效应细胞和靶细胞对照，于37℃5％CO2条件培养4小时后，加入MTT染色液，再培养2小时后加入消化液于次日测各孔OD值，按公式计算NK细胞毒活性。
NK细胞毒活性％＝{[靶细胞对照组OD均值-(实验组OD均值-效应细胞OD均值)]/靶细胞对照组OD均值}×100％
3.实验结果
3.1防治流感保健茶对正常昆明种小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能
与阴性对照组相比，经不同浓度防治流感保健茶和云芝糖肽用药后，其吞噬百分率和吞噬指数均有显著提升，差异有显著性,(P<0.01)，说明防治流感保健茶和云芝糖肽都具有提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能的作用，中、高剂量组疗效更好，低剂量组与云芝糖肽组疗效相当。实验结果分别见表8。
表8防治流感保健茶对正常昆明种小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

与阴性对照组相比***P<0.01
3.2对荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠的NK细胞活性试验 
与阴性对照组相比，经不同浓度防治流感保健茶和云芝糖肽用药后，其NK细胞活性均有显著提升，差异有显著性,(P<0.01)，说明防治流感保健茶和云芝糖肽都具有提高荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠的NK细胞活性的作用，防治流感保健茶组疗效优于云芝糖肽组。实验结果分别见表9。
表9防治流感保健茶对荷Lewis肺癌小鼠NK活性的影响

1与阴性对照组相比***P<0.01；
2#指(效应细胞+靶细胞)-效应细胞的OD值。