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1、10申请公布号CN104195185A43申请公布日20141210CN104195185A21申请号201410324698222申请日20140709C12P7/62200601C02F3/12200601C02F3/34200601C12R1/0120060171申请人北京工业大学地址100124北京市朝阳区平乐园100号72发明人崔有为冀思远张宏宇74专利代理机构北京思海天达知识产权代理有限公司11203代理人张慧54发明名称嗜盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的方法57摘要嗜盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的方法，属于PHA的生产技术领域。包括以下步骤H。
2、ALOFERAXMEDITERRANEI菌种活化、在种子培养基中进行培养、SBR反应器内以糖蜜酒精废水进行菌种放大培养、连续流反应器内以糖蜜废水进行连续PHA生产、回收排除的剩余污泥中的PHA。连续流工艺简单，相比较发酵工艺，无需反复更换发酵液，无需反复接种菌泥，连续进水连续出水，各工艺参数趋于恒定值，实现简单，便于自动控制，易于工程操作，PHA产量高，实现了PHA的连续生产，同时也做到了剩余污泥的资源化利用。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104195185ACN104195185A1/1页21嗜。
3、盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的方法，其特征在于，采用的装置为污水处理领域连续推流工艺反应器、鼓风曝气装置、SBR反应器，利用上述的装置驯化培养嗜盐古菌HMEDITERRANEI，在开放条件下实现PHA的连续生产，主要包括以下步骤步骤1，将菌株HMEDITERRANEI进行活化；步骤2，挑取活化后的纯菌株到灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养，转速150RPM，温度37，溶解氧浓度3MG/L，培养48H；5000RPM转速下离心悬浊液收获菌体，然后将收获的菌体再次放入灭菌后的种子培养基中，同样条件下培养24H；再次以5000RPM转速离心收获培养的菌体，然后将离心收获的菌体全。
4、部置于SBR反应器中；步骤3，向盛有放大菌体的SBR反应器中加入糖蜜酒精废水，运行SBR反应器，控制反应条件为温度室温，溶解氧3MG/L，曝气时间2023H，沉淀14H，然后排掉上清液；反复重复操作1020次，直至SBR内的菌体干重达到3000MG/L以上；步骤4，将沉淀收获的SBR反应器中的菌体全部转到连续流反应器中，启动连续流工艺装置，连续处理盐度范围在40100G/L的糖蜜酒精废水，连续流的工艺参数为水力停留时间1220H，有机负荷为086143KGCOD/KGMLSSD，曝气池溶解氧浓度3MG/L，污泥停留时间46D，污泥回流比为200300，运行温度为室温，二沉池沉淀时间35H；步骤。
5、5，连续运行步骤4连续推流工艺2030D后，对每日从二沉池排出的剩余污泥进行PHA的提取和生产。2按照权利要求1的方法，其特征在于，连续运行步骤4连续推流工艺2030D后，系统对糖蜜酒精废水的COD去除率达到80，糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为0508GPHA/GCOD，PHA的含量达到约菌体干重的40以上。权利要求书CN104195185A1/4页3嗜盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的方法技术领域0001本发明属于PHA的生产技术领域，涉及一种利用嗜盐古菌HALOFERAXMEDITERRANEI在连续推流反应器中处理糖蜜酒精废水合成聚羟基脂肪酸酯PHA的技术方法。该发明。
6、特别适用于糖蜜酒精废水的预处理进行资源回收，具有废物利用、能源生产和资源回收的多重优势。背景技术0002目前，全球范围内，PHA的工业化生产普遍采用单底物进行纯菌批次生物发酵的方法。例如，美国METABOLIX公司创造了基因重组的ESCHERICHIACOLIK12菌株，以葡萄糖为底物进行发酵，24H可获得90细胞干重的PHA产品生产。德国BIOMER公司利用ALCALIGENESLATUS菌株，以蔗糖为底物发酵进行PHA的工业生产。中国清华大学与广东江门生物技术开发中心有限公司、韩国科技院韩国和宝洁公司USA合作，已成功进行了AEROMONASHYDROPHILA发酵合成PHA的工业生产。但。
7、是间歇发酵过程有明显的缺陷发酵过程中要不断的向发酵罐中加入酸碱溶液控制PH，要配置专门的投加设备；每个周期结束后发酵罐要进行清洗、消毒；每周期要重新更换发酵液等，使得人力、物力、动力消耗较大；生产周期较短，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；生产效率低，由于在整个发酵周期中包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间，实际有效发酵时间短，发酵效率很低。为此，如果将间歇发酵改为连续生产将克服上述问题，提高PHA生产效率，降低PHA生产成本。0003在连续流生物技术层面，利用工业废水作为底物在污水生物处理过程中收。
8、获PHA是解决在这一问题很好的方式。利用废水尤其是某些工业废水中高含量的有机物作为碳源，在进行废水处理的同时收获PHA，不仅解决了污水处理问题，也使合成PHA过程中底物单一性得到改善，对PHA组分的多样性提供保证。这样的方式一方面突破了现在PHA生产依赖纯菌发酵的现状，另一方面也使污水处理和资源回收有效的结合。因此可以有效地提高生产效率，降低生产成本。0004糖蜜酒精产业是我国目前重要的工业产业。该行业产生的废水具有有机含量高、挥发性有机成分高的特性。本发明方法针对糖蜜酒精废水利用嗜盐古菌HMEDITERRANEI，在连续推流反应器内中对有机物废物进行资源回收，实现在开放环境中PHA的连续生产。
9、。发明内容0005本发明的目的在于提供一种在连续推流反应器中回收糖蜜酒精废水合成PHA，实现PHA连续生产的方法。该方法可以大大降低PHA工业生产成本，从而使PHA更具市场竞争力，应用更广泛。0006嗜盐古菌在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的方法，其特征在于，采说明书CN104195185A2/4页4用的装置为公知的污水处理领域连续推流工艺反应器、鼓风曝气装置、SBR反应器，利用上述的装置驯化培养嗜盐古菌HMEDITERRANEI，在开放条件下实现PHA的连续生产，主要包括以下步骤0007步骤1，将菌株HMEDITERRANEI按照公知的菌种活化方法进行活化；0008步骤2，挑取活化。
10、后的纯菌株到灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养，转速150RPM，温度37，溶解氧浓度3MG/L，培养48H；5000RPM转速下离心悬浊液收获菌体，然后将收获的菌体再次放入灭菌后的种子培养基中，同样条件下培养24H；再次以5000RPM转速离心收获培养的菌体，然后将离心收获的菌体全部置于SBR反应器中；0009步骤3，向盛有放大菌体的SBR反应器中加入糖蜜酒精废水，运行SBR反应器，控制反应条件为温度室温，溶解氧3MG/L，曝气时间2023H，沉淀14H，然后排掉上清液；反复重复操作1020次，直至SBR内的菌体干重达到3000MG/L以上；0010步骤4，将沉淀收获的SBR反应器中的菌体。
11、全部转到连续流反应器中，启动连续流工艺装置，连续处理盐度范围在40100G/L的糖蜜酒精废水，连续流的工艺参数为水力停留时间1220H，有机负荷为086143KGCOD/KGMLSSD，曝气池溶解氧浓度3MG/L，污泥停留时间46D，污泥回流比为200300，运行温度为室温，二沉池沉淀时间35H；0011步骤5，连续运行步骤4连续推流工艺2030D后，对每日从二沉池排出的剩余污泥进行PHA的提取和生产。0012连续运行步骤4连续推流工艺2030D后，系统对糖蜜酒精废水的COD去除率可以达到80，糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为0508GPHA/GCOD，连续运行生产的PHA为共聚物PHBV。。
12、PHA的含量达到约菌体干重的40以上。0013本发明具有以下优点00141目前国内的PHA生产主要集中于单底物发酵工艺，使用单底物成本很高，并且合成PHA的组分单一，PHA应用范围较窄。本发明利用工业废水的复杂底物，不仅改善了底物的单一性，同时进行了废水的资源化；00152本发明中使用嗜盐菌，优点在于高盐环境限制了其他非嗜盐微生物的生长，因此可以省略严格的灭菌程序；嗜盐微生物胞内积累的PHA在淡水环境很容易通过溶胞释放，便于下游回收PHA。嗜盐微生物积累的产物PHA多为特殊的共聚物，其物理性能更适合生产应用，因此应用前景更好。这些优势对进一步降低PHA生产成本，扩大PHA适用范围具有重要的意义。
13、。00163连续流工艺简单，相比较发酵工艺，无需反复更换发酵液，无需反复接种菌泥，连续进水连续出水，各工艺参数趋于恒定值，实现简单，便于自动控制，易于工程操作；00174该工艺无需发酵罐冲洗装置、PH调节装置等硬件设备，减少设备成本，同时节约能耗；00185连续流工艺的污泥产量高，从二沉池排出的剩余污泥直接用于PHA的提取和生产，PHA产量高，实现了PHA的连续生产，同时也做到了剩余污泥的资源化利用。具体实施方式0019以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于以下实施例。说明书CN104195185A3/4页50020实施例10021在实施例中，所用菌种为HALOFER。
14、AXMEDITERRANEI，菌种编号ATCC33500。0022该菌株的种子培养基配方为每1L去离子水对应蛋白胨75G、酵母提取物10G、柠檬酸钠3G、硫酸镁20G、氯化钾2G、硫酸亚铁001G、氯化钠200G所组成的培养基，调节PH至72。0023具体实施步骤如下0024步骤1，将购买到的菌株HMEDITERRANEI按照公知的菌种活化方法进行活化。0025步骤2，挑取活化后的纯菌株到200ML灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养，温度37，转速150RPM，溶解氧浓度3MG/L，培养48H。5000RMP转速下离心菌悬液收获菌体，然后将离心后的菌体全部转入到1L灭菌后的液体种子培养基中，。
15、37下摇床震荡培养24H，转速150RPM，将1L菌悬液再次离心，再次以5000RPM转速离心收获培养的菌体。然后将离心收获的菌体全部置于10LSBR反应器中。0026步骤3，向盛有放大菌体的SBR反应器中加入8L糖蜜酒精废水，运行SBR反应器。控制反应条件为温度室温，溶解氧浓度3MG/L，曝气20H，沉淀4H，排掉4L上清液。然后加入4L糖蜜酒精废水，按照上述步骤重复操作12次。SBR内菌体干重达到3500MG/L。0027步骤4，将沉淀收获的SBR反应器中的菌体转到连续流反应器中，开始进行连续流驯化培养。糖蜜酒精废水COD浓度为2500MG/L，进水C/N50，盐度50G/L。水力停留时间。
16、12H，有机负荷为143KGCOD/KGMLSSD，曝气池溶解氧浓度3MG/L，污泥停留时间5D，污泥回流比为300，运行温度为室温，二沉池沉淀时间4H。污泥主要在曝气区消耗废水中的碳源合成PHA。0028步骤5，连续运行连续推流工艺25D后，系统对糖蜜酒精废水的COD去除率可以达到50以上。糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为0588GPHA/GCOD。生产的PHA为共聚物PHBV。PHA的含量达到约菌体干重的21。0029步骤6，对每日排出连续流系统的剩余污泥进行PHA回收。0030实施例20031在实施例中，所用菌种为HALOFERAXMEDITERRANEI，菌种编号ATCC33500。。
17、0032该菌株的种子培养基配方为每1L去离子水对应蛋白胨75G、酵母提取物10G、柠檬酸钠3G、硫酸镁20G、氯化钾2G、硫酸亚铁001G、氯化钠200G所组成的培养基，调节PH至72。0033具体实施步骤如下0034步骤1，将购买到的菌株HMEDITERRANEI按照公知的菌种活化方法进行活化。0035步骤2，挑取活化后的纯菌株到200ML灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养，温度37，转速150RPM，溶解氧浓度3MG/L，培养48H。5000RMP转速下离心菌悬液收获菌体，然后将离心后的菌体全部转入到1L灭菌后的液体种子培养基中，37下摇床震荡培养24H，转速150RPM，将1L菌悬液再。
18、次离心，再次以5000RPM转速离心收获培养的菌体。然后将离心收获的菌体全部置于10LSBR反应器中。0036步骤3，向盛有放大菌体的SBR反应器中加入8L糖蜜酒精废水，运行SBR反应器。控制反应条件为温度室温，溶解氧浓度3MG/L，曝气20H，沉淀4H，排掉4L上清液。然后加入4L糖蜜酒精废水，按照上述步骤重复操作12次。SBR内菌体干重达到3500MG/L。说明书CN104195185A4/4页60037步骤4，将沉淀收获的SBR反应器中的菌体转到连续流反应器中，开始进行连续流驯化培养。糖蜜酒精废水COD浓度为2500MG/L，进水C/N50，盐度50G/L。水力停留时间16H，有机负荷为。
19、107KGCOD/KGMLSSD，曝气池溶解氧浓度3MG/L，污泥停留时间5D，污泥回流比为300，运行温度为室温，二沉池沉淀时间4H。污泥主要在曝气区消耗废水中的碳源合成PHA。0038步骤5，连续运行连续推流工艺25D后，系统对糖蜜酒精废水的COD去除率可以达到80以上。糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为076GPHA/GCOD。生产的PHA为共聚物PHBV。PHA的含量达到约菌体干重的43。0039步骤6，对每日排出连续流系统的剩余污泥进行PHA回收。0040实施例30041在实施例中，所用菌种为HALOFERAXMEDITERRANEI，菌种编号ATCC33500。0042该菌株的种子。
20、培养基配方为每1L去离子水对应蛋白胨75G、酵母提取物10G、柠檬酸钠3G、硫酸镁20G、氯化钾2G、硫酸亚铁001G、氯化钠200G所组成的培养基，调节PH至72。0043具体实施步骤如下0044步骤1，将购买到的菌株HMEDITERRANEI按照公知的菌种活化方法进行活化。0045步骤2，挑取活化后的纯菌株到200ML灭菌后的液体种子培养基，摇床震荡培养，温度37，转速150RPM，溶解氧浓度3MG/L，培养48H。5000RMP转速下离心菌悬液收获菌体，然后将离心后的菌体全部转入到1L灭菌后的液体种子培养基中，37下摇床震荡培养24H，转速150RPM，将1L菌悬液再次离心，再次以500。
21、0RPM转速离心收获培养的菌体。然后将离心收获的菌体全部置于10LSBR反应器中。0046步骤3，向盛有放大菌体的SBR反应器中加入8L糖蜜酒精废水，运行SBR反应器。控制反应条件为温度室温，溶解氧浓度3MG/L，曝气20H，沉淀4H，排掉4L上清液。然后加入4L糖蜜酒精废水，按照上述步骤重复操作12次。SBR内菌体干重达到3500MG/L。0047步骤4，将沉淀收获的SBR反应器中的菌体转到连续流反应器中，开始进行连续流驯化培养。糖蜜酒精废水COD浓度为2500MG/L，进水C/N50，盐度50G/L。水力停留时间20H，有机负荷为0857KGCOD/KGMLSSD，曝气池溶解氧浓度3MG/L，污泥停留时间5D，污泥回流比为300，运行温度为室温，二沉池沉淀时间4H。污泥主要在曝气区消耗废水中的碳源合成PHA。0048步骤5，连续运行连续推流工艺25D后，系统对糖蜜酒精废水的COD去除率可以达到70以上。糖蜜酒精废水转化成PHA的转化率为0680GPHA/GCOD。生产的PHA为共聚物PHBV。PHA的含量达到约菌体干重的34。0049步骤6，对每日排出连续流系统的剩余污泥进行PHA回收。说明书CN104195185A。