检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒.pdf

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1、10申请公布号CN104293980A43申请公布日20150121CN104293980A21申请号201410515902922申请日20140929C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12R1/9320060171申请人四川农业大学地址611130四川省成都市温江区惠民路211号72发明人文心田黄小波曹三杰姜来生文翼平伍锐黄宁胡中凯肖驰张焕容74专利代理机构成都高远知识产权代理事务所普通合伙51222代理人李高峡张娟54发明名称检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒57摘要本发明公开了一种检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综。

2、合征病毒的试剂盒，它包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因扩增试剂以及检测用基因芯片。本发明检测试剂盒可以准确、有效的检测繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。51INTCL权利要求书1页说明书17页序列表4页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书17页序列表4页附图4页10申请公布号CN104293980ACN104293980A1/1页21一种检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于它包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和。

3、猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因扩增试剂以及检测用基因芯片；扩增猪流行性乙型脑炎病毒基因的试剂包括SEQIDNO78和/或SEQIDNO910所示引物对；扩增猪瘟病毒基因的试剂包括SEQIDNO1112和/或SEQIDNO1314所示引物对；扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒基因的试剂包括SEQIDNO1516和/或SEQIDNO1718所示引物对；引物对中，上游引物与下游引物的比例是11；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；其中，探针包括SEQIDNO1或2所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，SEQIDNO3或4所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，以及SEQIDNO5或6所示任意一个或者两个。

4、寡核苷酸片段。2根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述扩增试剂还包括荧光染料标记的DNTP。3根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述荧光染料为CY3荧光染料或者CY5荧光染料。4根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括SEQIDNO2021所示引物对；所述探针还包括SEQIDNO19所示定位探针。5根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述固相载体为氨基化基片。6SEQIDNO78和/或SEQIDNO910所示引物对、SEQIDNO1112和/或SEQIDNO1314所示引物对以及SEQIDNO1516和/或SEQIDNO1718所示引物对，与SEQIDNO1或2所示任意。

5、一个或者两个基因片段、SEQIDNO3或4所示任意一个或者两个基因片段以及SEQIDNO5或6所示任意一个或者两个基因片段在制备检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的用途；所述引物对为扩增试剂，上游引物与下游引物的摩尔比是11；SEQIDNO16所示基因片段为检测探针。7根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述扩增试剂还包括荧光染料标记的DNTP。8根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述荧光染料为CY3荧光染料或者CY5荧光染料。9根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述试剂盒还包括SEQIDNO2021所示引物对以及SEQIDNO19所示的定位探针。10根据。

6、权利要求6或9所述的用途，其特征在于所述探针固定在氨基化基片上。权利要求书CN104293980A1/17页3检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒技术领域0001本发明涉及一种检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒。背景技术0002多病原混合感染是当前猪场疫病的普遍现象，猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪流行性乙型脑炎这三种猪病毒引起的疾病症状相似且常常呈混合感染,是当前危害养猪业的3种重要病毒性疾病，因此早期鉴别诊断并及时了解流行状况对控制这3种病的流行显得尤其重要。目前对这3种病的诊断多采用病原的分离及常规的血清学方法，但需时间较长。最近。

7、国外和国内均建立了病原的分离鉴定、免疫胶体金技术、酶联免疫吸附试验、血清中和实验、聚合酶链反应等，但是还不能更加快速的检测多种病原的混合感染。0003基因芯片技术是近年来新兴起的一种生物高新技术，该技术可以同时定量或定性的检测成千上万个基因信息，具有无选择性、客观、高通量的特点。基因芯片计划开展后,许多部门、大学、重点实验室及制药公司参与了该项目的研发,我国相继也成立了一大批基因芯片公司。随着基因组数据的增长以及分子生物学相关学科的快速发展,基因芯片技术得到迅猛发展和广泛应用。但生物芯片技术发展时间较短，很多技术还处于初级研发阶段，要成为实验室研究或临床可以普遍采用的技术仍有诸多关键问题亟待解。

8、决。1基因芯片的特异性的提高；2增加信号检测的灵敏度；3简化样品制备和标记操作；4设备与操作人员的要求较高；5应用标准的统一。0004目前，昊时友等，“猪病毒性繁殖障碍综合征基因芯片诊断方法的建立”，中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会，2007年公开了检测日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种病毒的基因芯片，但是该文件中没有芯片灵敏度试验，不能说明其可以灵敏地检出乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。发明内容0005为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可同时检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒。0006。

9、本发明检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，它包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因扩增试剂以及检测用基因芯片；0007扩增猪流行性乙型脑炎病毒基因的试剂包括SEQIDNO78和/或SEQIDNO910所示引物对；扩增猪瘟病毒基因的试剂包括SEQIDNO1112和/或SEQIDNO1314所示引物对；扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒基因的试剂包括SEQIDNO1516和/或SEQIDNO1718所示引物对；引物对中，上游引物与下游引物的比例是11；0008所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；其中，探针包括SEQ说明书CN1042。

10、93980A2/17页4IDNO1或2所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，SEQIDNO3或4所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，以及SEQIDNO5或6所示任意一个或者两个寡核苷酸片段。0009优选地，所述扩增试剂还包括荧光染料标记的DNTP。进一步优选地，所述荧光染料为CY3荧光染料或者CY5荧光染料。0010优选地，所述试剂盒还包括SEQIDNO2021所示引物对；所述基因芯片还包括定位探针，定位探针是SEQIDNO19所示的基因片段。0011优选地，所述固相载体为氨基化基片。0012本发明提供了SEQIDNO78和/或SEQIDNO910所示引物对、SEQIDNO1112和/或SEQIDN。

11、O1314所示引物对以及SEQIDNO1516和/或SEQIDNO1718所示引物对，与SEQIDNO1或2所示任意一个或者两个基因片段、SEQIDNO3或4所示任意一个或者两个基因片段以及SEQIDNO5或6所示任意一个或者两个基因片段在制备检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的用途；0013所述引物对为扩增试剂，上游引物与下游引物的摩尔比是11；SEQIDNO16所示基因片段为检测探针。0014优选地，所述扩增试剂还包括荧光染料标记的DNTP。进一步优选地，所述荧光染料为CY3荧光染料或者CY5荧光染料。0015优选地，所述试剂盒还包括SEQIDNO2021。

12、所示引物对以及SEQIDNO19所示的定位探针。0016优选地，所述探针固定在氨基化基片上。0017本发明试剂盒可以有效检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，敏感性高，三种病毒的最低检测浓度均为20PG/L，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。0018以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明0019图1基因芯片四个重复检测区的分布及矩阵排列情况；0020图2两种点样针点样效果；0021图3不同点样缓冲液。

13、点样效果；0022图4不同湿度下点样效果；0023图5不同靶基因浓度和探针浓度对杂交信号强度的影响；0024图6不同烘焙时间处理结果；0025图7不同水合时间处理结果；0026图8不同紫外交联时间处理结果；0027图9基因芯片检测PRRSV、CSFV、JEV、PPV、PRV、PEDV、TGEV的扫描结果。具体实施方式说明书CN104293980A3/17页50028一、实验材料和仪器0029毒株0030猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV毒株、猪瘟病毒CSFV毒株和猪流行性乙型脑炎病毒JEV毒株，购自中国兽药监察所。0031试剂0032总RNA抽提试剂盒，为天根北京生化科技有限公司产品；PRIME。

14、SCRIPTTMRTREAGENTKITPERFECTREALTIME，为宝生物工程大连有限公司产品；小量质粒提取试剂盒、小量胶回收试剂盒，均为OMEGA美国生物技术公司产品。0033氨基载玻片、2点样缓冲液、预杂交缓冲液、杂交缓冲液,均购自上海百傲科技有限公司；CY3DCTP25NMOL，PA53021，LOT300989，AMERSHAMBIOSCIENCES，UK；洗液01SDS2SSC；洗液01SDS02SSC；洗液02SSC；洗液4双蒸水。0034仪器0035超净工作台SWCJ2FD，苏州安泰空气技术有限公司；0036超纯水仪MILLIQPLUS，法国产；0037梯度PCR仪P2，T。

15、HERMOHYBAID，美国产；0038高速冷冻离心机3K18型德国产；0039MINISUB凝胶电泳装置意大利产；0040电泳仪POWERPAC300，意大利产；0041凝胶电泳图像分析系统2000型意大利产；0042恒温摇床THERMOFORMA，美国产；0043核酸蛋白检测仪BIORAD，SMARTSPAEETM3010；0044分子杂交仪THERMO，美国产；0045多样品围栏、多样品围栏粘贴工具、多样品围栏盖片，芯片杂交盒均为北京博奥生物公司；0046SMARTARRAYERTM48，微阵列芯片点样系统CAPITALBIOCORPORATION，北京博奥生物公司；0047LUXSCA。

16、NTM10K微阵列芯片扫描仪CAPITALBIOCORPORATION，北京博奥生物公司；0048真空机SINBO，香港；0049CO2恒温培养箱THERMO，美国产。0050实施例1本发明试剂盒的制备00511、材料和仪器0052同前述实验材料和仪器。00532、实验方法005421PCR引物、检测探针的制备00551设计病原特异性探针通过对GENBNAK中收录的猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟说明书CN104293980A4/17页6病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸序列对位排列分析，选定保守区域序列JEVC、M、E、NS1、NS5；CSFV5UTR、3UTR、NPRO、ERNS、E2；PRRSV。

17、5UTR、ORF1B、ORF5、ORF6、ORF7。针对保守序列设计检测探针，从中挑选出特异性强的探针序列。00562设计探针序列的特异性引物针对上述保守探针序列，利用生物信息学软件PRIMER5设计特异性引物。特异性引物由大连宝生物公司合成。00573探针制备用小量病毒/液体样本RNA/DNA抽提试剂盒提取猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒，利用上述特异性引物对三种病原核酸进行PCR扩增，纯化浓度测定。0058PCR扩增体系中优化的参数及其浓度00590060最终确定扩增探针时MG2终浓度为20MMOL/L，DNTP浓度为200UMOL/L，扩增循环数为35个循环，选择用。

18、OMEGA试剂盒从PCR反应液中直接过柱纯化DNA来制备合格的探针浓度和纯度。0061优化后PCR扩增体系及条件00620063反应条件L94变性2MIN；294变性30S，50退火30S，72延伸30S，共35个循环；372延伸10MIN，4保持。00644探针的筛选将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在氨基化玻璃基片上制成基因芯片，通过杂交试验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明说明书CN104293980A5/17页7检测基因芯片所需的特异、灵敏的探针JEVJEVCC、PRM/MM；CSFVCSF15UTR、ERNSERNS；PRRSVPS95UTR、Y11ORF6。0065。

19、5探针基因组的建立将胶回收纯化的JEVJEVCC、PRM/MM；CSFVCSF15UTR、ERNSERNS；PRRSVPS95UTR、Y11ORF6用PMD18TVECTOR进行连接，连接体系为PMD18TVECTOR05UL，胶回收探针50UL，连接液45UL，总量100UL。连接反应在16下进行16H；将100UL探针连接产物加入氯化钙法制备的200UL感受态细胞JM109中，轻轻混匀后冰浴30MIN，42热休克90S后立即放入冰浴中冷却5MIN，加入800ULLB液体培养基，37轻微振荡培养3H。取200UL培养物涂布于含有XGAL、IPTG、含氨苄的LB琼脂平板培养基，37培养过夜，挑。

20、选白色菌落进行增菌培养及质粒PCR鉴定并送宝生物测序。00666探针基因组的保存将测序正确的质粒进行扩增培养，并用20脱脂牛奶作为保护剂进行冻干，至于80保存。0067引物和探针的核苷酸序列如下0068SEQIDNO1PRM/M0069源基因来源JEVSA14142株0070基因大小及序列451BP0071CATCAACAACACGGACATTGCAGACGTTATCGTGATTCCCACCTCAAAAGGAGAGAACAGATGCTGGGTCCGGGCAATCGACGTCGGCTACATGTGTGAGGACACTATCACGTACGAATGTCCTAAGCTTACCATGGGCAATGATC。

21、CAGAGGATGTGGATTGCTGGTGTGACAACCAAGAAGTCTACGTCCAATATGGACGGTGCACGCGGACCAGGCATTCCAAGCGAAGCAGGAGATCCGTGTCGGTCCAAACACATGGGGAGAGTTCACTAGTGAATAAAAAAGAGGCTTGGCTGGATTCAACGAAAGCCACACGATATCTCATGAAAACTGAGAACTGGATCATAAGGAATCCTGGCTATGCTTTCCTGGCGGCGGTACTTGGCTGGATGCTTGGCAGTAACAACGGTCAACGCGTGGTATTTACCATCCTCCTGCTGTTGG。

22、TCGCT0072SEQIDNO2JEVC0073源基因来源JEVSA14142株0074基因大小及序列238BP0075GCTTGTTGGACGGCAGAGGGCCAGTACGTTTCGTGCTGGCTCTTATCACGTTCTTCAAGT0076TTACAGCATTAGCCCCGACCAAGGCGCTTTCAGGCCGATGGAAAGCAGTGGAAAAGAGTG0077TGGCAATGAAACATCTTACTAGTTTCAAACGAGAACTTGGAACACTCATTGACGCCGTGA0078ACAAGCGGGGCAGAAAGCAAAACAAAAGAGGAGGAAATGAAGGCTCA。

23、ATCATGTGGCT0079SEQIDNO3ERNS0080源基因来源CSFV,ERNS,强毒株0081基因大小及序列301BP0082TCAATGGAACCTGAGTGACAACGGCACTAATGGTATTCAGCATGCTATGTACCTTAGAGGGGTTAGCAGAAGCTTGCATGGGATCTGGCCGGAAAAAATATGCAAAGGAGTCCCCACCTACCTGGCCACAGACACGGAACTGAAAGAAATACAGGGAATGATGGATGCCAGCGAGGGGACAAACTATACGTGCTGTAAGTTACAGAGACATGAATGGAACAAACATGGATG。

24、GTGTAACTGGTACAATATAGACCCATGGATACAGTTGATGAATAGAACCCAAGCAGACTTGGCAGAAGGC0083SEQIDNO4CSF1说明书CN104293980A6/17页80084源基因来源CSFV，5UTR强毒0085基因大小及序列143BP0086ACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCGTGCCCAAGACGCACCTTAACCCTAGCGGGGGTCGCTAGGGTGAAATCACACCACGTGATGGGAGTACGACCTGATA0087SEQIDN。

25、O5PS90088克隆基因的源基因来源PRRSUS,5UTRPS9PRIMER,C142分离株0089基因大小及序列174BP0090CGTATAGGTGTTGGCTCTATGCCTTGGCATTTGTATTGTCAGGAGCTGTGACCATTGGCACAGCCCAAAACTTGCCGCACAGAAACACCCTTCTGTGATAGCCTCCTTCAGGGGAGCTTAGGGTTTGTCCCTAGCACCTTGCTTCCGGAGTTGCACTGCTTTACGGTCTCTCCA0091SEQIDNO6Y110092源基因来源C142分离株，ORF6，PRRSUSTYPE0093基因大小及序列1。

26、55BP0094TCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTTGAAAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACA0095SEQIDNO78PRM/MPRIMER0096F5CATCAACAACACGGACATTGC30097R5AGCGACCAACAGCAGGAG30098SEQIDNO910JEVCPRIMER0099F5GCTTGTTGGACGGCAGAG30100R5AGCCA。

27、CATGATTGAGCCTTC30101SEQIDNO1112ERNSPRIMER0102F5TCAATGGAACCTGAGTGACAAC30103R5TATTGTGCCAGTTACACCATCC30104SEQIDNO1314CSF1PRIMER0105F5ACAGGACAGTCGTCAGTAGTTC30106R5TATCAGGTCGTACTCCCATCAC30107SEQIDNO1516PS9PRIMER0108F5CGTATAGGTGTTGGCTCTATGC30109R5TGGAGAGACCGTAAAGCAGTG30110SEQIDNO1718Y11PRIMER0111F5TCACCTC。

28、CAGATGCCGTTTG30112R5TGTGCCGTTGACCGTAGTG30113定位基因DNA的序列SEQIDNO190114AAAGCGAGGCTTTTTGGCCTCTGTCGTTTCCTTTCTCTGTTTTTGTCCGTGGAATGAACAATGGAAGTCA0115ACAAAAAGCAGCTGGCTGACATTTTCGGTGCGAGTATCCGTACCATTCAGAACTGGCAGG说明书CN104293980A7/17页9AACAGGGAAT0116GCCCGTTCTGCGAGGCGGTGGCAAGGGTAATGAGGTGCTTTATGACTCTGCCGCCGTCATAAAA。

29、TGGTAT0117GCCGAAAGGGATGCTGAAATTGAGAACGAAAAGCTGCGCCGGGAGGTTGAAGAACTGCGGCAGGCCAGCG0118AGGCAGATCTCCAGCCAGGAACTATTGAGTACGAACGCCATCGACTTACGCGTGCGCAGGCCGACGCACA0119GGAACTGAAGAATGCCAGAGACTCCGCTGAAGTGGTGGAAACCGCATTCTGTACTTTCGTGCTGTCGCGG0120ATCGCAGGTGAAATTGCCAGTATTCTCGACGGGCTCCCCCTGTCGGTGCAGCGGCGTTTTCCGGAACT。

30、GG0121AAAACCGACA0122SEQIDNO2021定位基因互补序列的扩增引物0123FAAAGCGACGCAATGAGGCACT0124RGTTCCACGACCGCAACTGC012522标准质粒的构建0126221基因组的抽提0127总RNA抽提采用天根的总RNA提取试剂盒，参照说明，具体操作方法如下01281直接取200L病毒尿囊液于15ML离心管中，加入600L裂解液，充分振荡混匀；01292将匀浆样品在1530放置5MIN；013034，12000R/MIN离心5MIN，把上清液吸到新离心管中；01314加200L氯仿，剧烈上下振荡15SEC，室温静置3MIN；013254。

31、，12000R/MIN离心10MIN，样品会产生分层，轻轻地将最上层无色的水相转到新管中；01336加05倍体积无水乙醇，混匀，转移到吸附柱内，4，12000R/MIN离心30SEC；01347加500L去蛋白液，4，12000R/MIN离心30SEC；01358加600L漂洗液，静置2MIN，4，12000R/MIN离心30SEC；重复一次013694，12000R/MIN离心2MIN，弃掉残余液体；013710将吸附柱转到RNASEFREE离心管中，加50LRNASEFREE超纯水，室温静置2MIN，4，12000R/MIN离心2MIN。离心液即得到的病毒RNA，于20下保存备用或直接进行。

32、反转录。0138222探针基因的RTPCR及PCR扩增0139以抽提的RNA为模板，以RANDOM6PRIMERS为引物合成CDNA，反应体系如下0140RTENZYMEMIX05LRANDOM6PRIMERS05L说明书CN104293980A8/17页105PRIMESCRIPTRTBUFFER20LRNA20LRNASEFREE超纯水50LTOTAL100L0141将上述体系混匀后按下面程序进行CDNA合成反应程序为37，15MIN；85，5SEC；4，保存。0142以反转录合成的CDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下01432TAQPCRMASTERMIX125LCDNA/DNA。

33、20L上游特异性引物250MOL/L05L下游特异性引物250MOL/L05L超纯水95LTOTAL250L0144反应条件如下01450146PCR完毕后，分别取7L扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分析。0147223探针基因的胶回收0148探针基因的胶回收，采用OMEGA小量胶回收试剂盒，参照说明进行回收操作，步骤如下01491取20LPCR产物进行电泳，6V/CM，25MIN，紫外灯下切胶，称重。按照试剂盒说明进行胶回收；01502按11的比例加入BINDINGBUFFERXP2，5560水浴直到胶全部融化，期间每隔23MIN上下颠倒离心管；01513将液体加入吸附柱中，室温12000R/M。

34、IN离心1MIN，倒掉滤液；01524加入300BINDINGBUFFERXP2，室温12000R/MIN离心1MIN，倒掉滤液；说明书CN104293980A109/17页1101535加入700ML漂洗液SPW，室温12000R/MIN离心1MIN，倒掉滤液；01546室温12000R/MIN空离2MIN，倒掉滤液；01557将吸附柱放于新离心管中，加入30ML洗脱缓冲液，室温静置1MIN；01568室温12000R/MIN离心2MIN，取7L回收产物进行电泳，验证回收效果，其余回收产物于20保存备用。0157224探针基因的连接重组0158采用PMD19TSIMPLEVECTOR克隆试剂。

35、盒，进行探针基因的连接重组，具体步骤按说明进行。连接体系如下0159PMD19TSIMPLE载体05L胶回收PCR产物50LSOLUTIONI45LTOTAL100L01604连接过夜，连接产物用于转化DH5感受态细胞。0161225感受态细胞的制备及保存0162参考分子克隆实验指南氯化钙法56制备DH5感受态细胞，制备好的感受态细胞分装为100L/管，直接用于转化或于70保存。0163226连接产物的转化0164将100L感受细胞放在冰上，向其中加10L连接产物，冰浴30MIN；42水浴热休克90S，快速冰浴冷却5MIN；立即加入600L37预热的LB液体培养基无需冰上操作，37，150R/。

36、MIN振荡培养1H，使受体菌恢复正常生长状态；取150L培养物均匀涂布于LB平板含100MG/MLAMP，晾干，于37培养约12H，挑取菌落进行鉴定。0165227探针质粒菌的鉴定及保存01662271探针质粒菌的DNA抽提0167将阳性质粒菌接种于5MLLB含100MG/MLAMP液体培养基中，37振荡培养12H；按OMEGA小量质粒提取试剂盒说明方法提取质粒。具体步骤如下01681吸1ML菌液到离心管中，室温12000R/MIN离心1MIN，吸弃上清；01692加入250LSOLUTIONI4储存，振荡使菌体悬浮；01703加入250LSOLUTIONII，轻轻地颠倒混匀，静置2MIN；0。

37、1714加入350LSOLUTIONIII，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀物，室温12000R/MIN，离心10MIN；01725将上一步的液体转入吸附柱中，室温12000R/MIN离心1MIN，倒掉滤液；01736向其加500LBUFFERHB，室温12000R/MIN离心1MIN，倒掉滤液；01747向其加700LBUFFERWASHBUFFER，室温12000R/MIN离心1MIN，倒掉滤液；重复一次；01758室温12000R/MIN空离2MIN，将柱子装于一个干净的离心管中，向其加30LELUTIONBUFFER，静置2MIN，12000R/MIN离心1MIN，收集的离心液即为提取的。

38、质粒DNA。说明书CN104293980A1110/17页1201762372探针质粒菌的PCR鉴定0177对提取的探针质粒菌分别进行PCR鉴定，同时以PMD19TSIMPLE空白载体作阴性对照，反应体系如下01782TAQPCRMASTERMIX75L上游特异性引物250MOL/L05L下游特异性引物250MOL/L05L质粒50倍稀释20L超纯水45LTOTAL150L0179反应程序同上。反应完毕，分别取5L于20的琼脂糖凝胶进行电泳分析。0180228探针质粒菌的序列测定和分析0181采用SANGER双脱氧末端终止法对经过PCR鉴定为阳性的探针质粒菌进行序列测定，序列测定工作交由上海杰。

39、李生物技术有限公司完成。0182得测序正确的质粒菌T/PRM/M、T/JEVC、T/ERNS、T/CSF1、T/PS9、T/YLL，分别包含SEQIDNO1PRM/M、SEQIDNO2JEVC、SEQIDNO3ERNS、SEQIDNO4CSF1、SEQIDNO5PS9、SEQIDNO6YLL所述基因片段。0183229探针质粒菌的保存0184把序列测定正确的探针质粒菌扩大培养，然后以20脱脂奶粉作为保护剂冻干，70保存。018523芯片制备01861芯片矩阵的设计每张芯片分为四个区，四个区为四个重复阵列，用杂交围栏隔开，以便同时进行三个不同样本的杂交反应。每个阵列参数为每排探针基因和定位基因均。

40、为12个样点，各样点中心间距650UM，样点直径为220UM。图10187基因芯片点制过程中质量控制0188点制芯片点样针的选择用SMARTARRAYERTM48点样仪，分别以实心针和夹缝针在氨基化玻片上接触式点样方式进行点样，烘干，并用LUXSCANTM10K微阵列芯片扫描仪分别扫描观察。注点样液中添加有少量荧光素图20189点样缓冲液的选择将定位基因进行标记并纯化，分别用50DMSO、3SSC、点样缓冲液稀释到200NG/UL，用SMARTARRAYERTM48点样仪在基片上点制，经过后处理固定，扫描观察样点形态。注定位基因扩增时用荧光素标记过，以便用于优化过程的质量控制，在基因芯片制备时。

41、定位基因和靶基因是没有被标记的图30190点样过程中湿度的优化用点样缓冲液对标记过的定位基因进行稀释，在40、50、60、70四个点样湿度下进行点样，烘干，扫描观察样点的形态。注点样说明书CN104293980A1211/17页13液中添加有少量荧光素图40191探针和靶基因浓度的确定选择PRM/MM探针，用R点样液稀释成30、60、120、250、500、1000、2000、4000NG/UL浓度点制芯片，然后用不同浓度3PG/UL24000PG/UL的PRM/MM靶基因在48下杂交6H，按芯片洗涤程序洗涤后用激光共聚焦扫描仪扫读信号，探讨靶基因和探针浓度变化对杂交信号强度的影响。图5019。

42、2烘培时间的优化将点有定位基因的芯片分别按0H、2H、4H、8H、12H在80原位PCR上或烘箱中烘焙，最后用LUXSCANTM10K扫描，测定荧光信号强度F2。图60193水合时间的优化将点有定位基因的芯片在80原位PCR上或烘箱中烘焙8H，然后在95100水蒸汽上水合，水合时间按10S、20S、40S、60S、120S梯度进行，其他条件按照初步处理方法进行。将后处理好的芯片用杂交液模拟真实杂交条件和洗涤条件进行处理后用LUXSCANTM10K扫描，测定荧光信号强度F2。图70194紫外交联时间的优化紫外交联时间按照0MIN、5MIN、10MIN、15MIN、20MIN、25MIN、30MI。

43、N进行交联，将后处理好的芯片用杂交液模拟真实杂交条件和洗涤条件进行处理后用LUXSCANTM10K扫描，测定荧光信号强度F2。图80195优化后检测基因芯片的点制0196基因芯片点样缓冲液配制成点样液，将包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA探针、定位基因及阴性质控基因定量至使用浓度即为200NG/UL，加热至95保持5MIN，然后置于冰上冷却10MIN。0197按芯片设计要求在96384孔载样板孔内加入稀释变性好的包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA探针、定位基因、阴性质控基因及空白质控缓冲液，封住孔板，用基因芯片点样系统MICROARR。

44、AYPRINTINGSYSTEM，SPOTARRAYTM24在氨基化基片上接触式点样。点样环境相对湿度为5565，温度1530。0198点制好的芯片静置于点样仪上充分干燥过夜至少6H，然后用6080水合处理10S，立即于加热至80原位PCR仪上烘干，紫外线交联25MIN后，以02SDS液洗涤5MIN，再以蒸馏水快速洗涤后离心干燥，密封、室温保存备用。0199实施例2本发明检测方法02001、核酸抽提0201病毒RNA的抽提采用试剂盒方法抽提病毒RNA，试验使用上海华舜产小量病毒/液体样本RNA抽提试剂盒。按该试剂盒说明抽提RNA0202A即取细胞培养的病毒液300UL反复冻融3次后在4下120。

45、00G离心5MIN。0203B吸取250UL上清液置于离心管中，加入500ULRV液后高速振荡2MIN后室温静置5MIN。0204C加入750UL异丙醇，颠倒离心管以混匀。0205D移取750UL至吸附柱中，离心15S。0206E弃收集管中液体，将剩余的裂解物移入吸附柱中离心15S。0207F弃收集液后加入500ULRP液离心30S去除蛋白质。0208G加入500ULW3液，静置LMIN后，离心洗涤15S。0209H重复步骤G。说明书CN104293980A1312/17页140210I将吸附柱转移到另一干净的离心管中，在吸附膜中央加入30UL超纯水，室温静置LMIN。0211J12000G离。

46、心1MIN，离心液为提取的RNA，70保存备用。0212病毒RNA的反转录JEV、CSFV、PRRSV反转录体系200UL体系02130214反转录反应程序为021530保温10MIN，42反转录3OMIN，99灭活反转录酶5MIN，5保持。02162、DNA的PCR扩增标记02170218试验中CY3DCTP荧光素使用终浓度为25UMOL/L，加入荧光素时及以后操作均在暗室中进行。按如下程序进行扩增反应程序为反应条件L94变性2MIN；294变性30S，50退火30S，72延伸30S，共35个循环；372延伸10MIN，4保持。02193、CDNA的多重PCR扩增标记0220多重PCR标记体。

47、系02210222说明书CN104293980A1413/17页150223试验中CY3DCTP荧光素使用终浓度为25UMOL/L，加入荧光素时及以后操作均在暗室中进行。按如下程序进行扩增反应程序为反应条件L94变性2MIN；294变性30S，50退火30S，72延伸30S，共35个循环；0224372延伸10MIN，4保持。02254、检测0226杂交质量优化控制0227杂交温度优化制备包含所有探针的基因芯片，探针浓度为200NG/PL。以各标记靶基因与其分别进行杂交，每种探针和其相应的靶基因均在44、48、52、56等不同温度下进行杂交，预杂交LH，杂交6H。最后根据SNR值筛选出探针序列。

48、的最佳杂交温度分别为JEVC在44下杂交信号强；PRM/M在5256下杂交信号强；CSF1在4456下杂交信号强，SNR在197612之间；ERNS在4456下杂交信号强，SNR值在521154之间；PRRS_PS9探针在4056下杂交信号强，其SNR值在240479之间；YLL特异性较好，其杂交温度范围在4052之间时为最佳。表10228预杂交和杂交的影响试验选择JVEPRM/M探针研究了不同预杂交和杂交时间对芯片杂交信号的影响。试验设计了预杂交时间05和1H，杂交时间05H、10H、15H、20H、25H、30H、60H，杂交结束后根据SNR值筛选出探针序列预杂交和杂交时间。结果是预杂交时。

49、间和杂交时间长短对检测芯片的杂交效果影响不明显，无论预杂交05H或1H，杂交时间是05H还是延长至6H，样本信号强度和SNR值变化很小，对于本研究的检测基因芯片，预杂交05或LH，杂交1060H，都能达到检测目的。表20229表1不同温度下杂交结果0230内容ITEM44485256内容ITEM44PRM/M127124133134PRM/M127JEVC927710856764JEVC927ERNS154686521530ERNS154CSF1612197198528CSF16120231表2不同预杂交和杂交时间对杂交信号的影响0232说明书CN104293980A1514/17页16预杂交时间H050510101010杂交时间H051015203060样本信号强度209818325553802604953245579624104642234234样本SNR值。