一种酶法制备他汀类化合物中间体的方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，具体地，涉及一种酶法制备他汀类化合物中间体的方法。
背景技术
阿托伐他汀是他汀类血脂调节药,属HMG-CoA还原酶抑制剂。口服吸收后的水解产物在体内竞争性地抑制胆固醇合成过程中的限速酶羟甲戊二酰辅酶A还原酶,从而减少胆固醇的合成,增加低密度脂蛋白受体的合成，由此用于防治高胆固醇血症、混合型高脂血症、冠心病和脑中风。
目前通常采用化学方法合成阿托伐他汀的中间体，由于该方法具有生产成本高、污染大的缺点，因而最近逐渐开始用酶－化学方法来代替该化学方法。然而，目前采用的酶普遍催化活性较低，导致催化反应用酶量很大，影响提取收率，并且生产成本依旧较高。
因此，本领域迫切需要开发一种能够降低生产成本并且对环境友好的生物合成方法，具体地，需要开发一种利用具有高效催化活性的酶制备他汀类化合物中间体的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高效催化活性的酶以及用该酶制备他汀类化合物中间体的方法。
本发明第一方面提供了一种制备式II化合物的方法，所述方法包括步骤：
(a)在醇脱氢酶CmADH3存在下，对式III化合物进行催化还原反应，从而生成式II化合物；
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其中，R选自C1-C6烷基或C1－C6卤代烷基。
在另一优选例中，R为C1－C4烷基，较佳地为叔丁基、乙基或甲基。
在另一优选例中，所述醇脱氢酶CmADH3来源于Candida magnoliae。
在另一优选例中，所述醇脱氢酶CmADH3为野生型/突变型的醇脱氢酶。
在另一优选例中，所述突变型的醇脱氢酶CmADH3具有SEQ ID NO.：1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述序列包括与SEQ ID NO.:1具有90％(较佳地，95％)同源性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述方法在辅酶因子的存在下进行。
在另一优选例中，所述方法在辅酶因子和所述辅酶因子的再生系统的存在下进行。
在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH和/或NADH。
在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH。
在另一优选例中，所述辅酶因子的再生系统选自下组：葡萄糖脱氢酶GDH和葡萄糖、甲酸脱氢酶和甲酸、异丙醇和仲醇脱氢酶、或其组合。
在另一优选例中，所述所述辅酶因子的再生系统为野生型/突变型的葡萄糖脱氢酶GDH和葡萄糖。
在另一优选例中，所述突变型的葡萄糖脱氢酶GDH在第252位突变为亮氨酸，且在第170位突变为精氨酸。
在另一优选例中，所述葡萄糖脱氢酶GDH具有SEQ ID NO.：2所示的编码序列。
在另一优选例中，所述序列包括与SEQ ID NO.:2具有90％(较佳地，95％)同源性的编码序列。
在另一优选例中，所述辅酶因子的用量(g/L)为0.005-0.2，较佳地，0.01-0.1，更佳地，0.03-0.08。
在另一优选例中，所述葡萄糖脱氢酶GDH来源于原核生物。
在另一优选例中，所述葡萄糖脱氢酶GDH来源于枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌及其突变体。
在另一优选例中，所述步骤(a)具有以下一个或多个特征：
(1)反应温度为20－40℃，较佳地，25－35℃，更佳地28-32℃；
(2)反应时间为0.5-24小时，较佳地，为1-10小时，更佳地，为2-7小时；
(3)pH为5-8，较佳地，6.5-7.5。
在另一优选例中，所述式III化合物与所述醇脱氢酶CmADH3重量比为10000：1－10:1，较佳地，1000：1－20:1，更佳地，500:1－50:1。
在另一优选例中，所述醇脱氢酶CmADH3以菌泥的形式加入。
在另一优选例中，所述式III化合物与所述菌泥的重量比为100:1-1:1，较佳地，80:1-8:1，更佳地，50:1-10:1。
本发明第二方面提供了一种制备式I所示的(4R-Cis)-6-氰基-2,2-二甲基-1,3-二氧已环-4-乙酸烷基酯化合物的方法，包括步骤：
(a)在醇脱氢酶CmADH3存在下，对式III化合物进行发生催化还原反应，从而生成式II化合物；
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(b)在惰性溶剂中，将式II化合物与2，2-二甲氧基丙烷反应，形成式I化合物：
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其中，上述各式中，R选自C1-C6烷基或C1－C6卤代烷基。
在另一优选例中，在步骤(b)中，在甲磺酸存在下进行反应。
在另一优选例中，所述方法在步骤(a)和(b)之间还包括步骤：将步骤(a)中生成的式II化合物进行分离纯化，并将分离纯化的式II化合物用于步骤(b)。
在另一优选例中，所述的分离纯化包括：过滤和萃取。
在另一优选例中，步骤(b)中的温度为0-50℃，较佳地4-35℃；时间为0.1-24小时，较佳地为0.5-12小时。
本发明第三方面提供了一种合成他汀类化合物的方法，所述方法包括步骤：
(a)式III化合物通过催化还原反应生成式II化合物，其中，所述步骤(a)在醇脱氢酶CmADH3存在的条件下进行；
(b)式II化合物与2，2-二甲氧基丙烷反应，形成式I化合物；和
(c)将所述式I化合物作为中间体，制备他汀类化合物。
在另一优选例中，所述他汀类化合物选自下组：阿托伐他汀、罗苏伐他汀、匹伐他汀、或其组合。
本发明第四方面提供了一种反应混合物，所述混合物包括：
(i)醇脱氢酶CmADH3；
(ii)式III化合物和/或式II化合物；以及
(iii)所述辅酶因子。
在另一优选例中，所述混合物还包括所述辅酶因子的再生系统。
在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH和/或NADH。
在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH。
在另一优选例中，所述辅酶因子的再生系统选自下组：葡萄糖脱氢酶GDH和葡萄糖、甲酸脱氢酶和甲酸、异丙醇和仲醇脱氢酶、或其组合。
在另一优选例中，所述所述辅酶因子的再生系统为葡萄糖脱氢酶GDH和葡萄糖。
在另一优选例中，所述醇脱氢酶CmADH3以酶制剂或发酵液形式加入到反应式中。
在另一优选例中，所述辅酶因子的用量(g/L)为0.005-0.2，较佳地，0.01-0.1，更佳地，0.03-0.08。
在另一优选例中，所述式III化合物与所述醇脱氢酶CmADH3重量比为10000：1－10:1，较佳地，1000：1－20:1，更佳地，500:1－50:1。
在另一优选例中，所述醇脱氢酶CmADH3以菌泥的形式加入。
在另一优选例中，所述式III化合物与所述菌泥的重量比为100:1-1:1，较佳地，80:1-8:1，更佳地，50:1-10:1。
本发明第五方面提供了一种醇脱氢酶或表达重组酶的工程菌的用途，所述醇脱氢酶或表达重组酶的工程菌用于催化还原式III化合物，从而生成式II化合物。
在另一优选例中，所述醇脱氢酶来源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)。
在另一优选例中，所述反应还在辅酶因子和任选的辅酶因子的再生系统下进行。
在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH和/或NADH。
在另一优选例中，所述辅酶因子为NADPH。
在另一优选例中，所述辅酶因子的再生系统选自下组：葡萄糖脱氢酶GDH和 葡萄糖、甲酸脱氢酶和甲酸、异丙醇和仲醇脱氢酶、或其组合。
在另一优选例中，所述所述辅酶因子的再生系统为葡萄糖脱氢酶GDH和葡萄糖。
在另一优选例中，所述工程菌选自下组：大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母，芽孢杆菌、或其组合。
本发明第六方面提供了一种多核苷酸，所述核苷酸选自下组：
(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.：3所示的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.：3所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，且具有式III化合物催化还原活性的多核苷酸；
(c)如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸突变1-60个(较佳地1-30，更佳地1-6个)核苷酸，且具有式III化合物催化还原活性的多核苷酸；
(d)用于编码SEQ ID NO.：1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述多核苷酸来源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)。
本发明第七方面提供了一种表达载体，所述载体含有本发明第六方面所述的多核苷酸。
本发明第八方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第七方面所述的表达载体、或其染色体整合有外源的本发明第六方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母，芽孢杆菌、或其组合。
在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了kred316酶和CmADH3酶的可溶性表达情况。
图2显示了CmADH3酶与Kred316酶的催化活性比较结果。
图3显示了式I化合物的纯度分析情况。
图4显示了式I化合物的手性分析情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过对脱氢酶进行大量筛选，意外的发现一种醇脱氢酶CmADH3，它具有很高的催化活性，能够在辅酶因子(如NADPH)以及葡萄糖脱氢酶GDH存在的条件下，催化还原阿托伐他汀的中间体式III化合物，生成式II化合物。并且，用醇脱氢酶CmADH3催化合成阿托伐他汀中间体，不仅能够降低生产成本，还能降低环境污染，具有极大的应用价值。
醇脱氢酶CmADH3及其用途
如本文所用，所述“醇脱氢酶CmADH3”指一种来源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的醇脱氢酶，它更加适于在大肠杆菌中表达，并且表达得到的醇脱氢酶CmADH3具有很高的催化活性。
在本发明中，醇脱氢酶CmADH3被用于催化还原式III化合物，生成他汀类化合物的中间体式II化合物。
与kred316酶(中国专利申请号：200780036841.6，SEQ ID NO..315)相比，本发明所述的醇脱氢酶CmADH3具有更高的催化活性。
辅酶因子和辅酶因子的再生系统
如本文所用，所述“辅酶因子”是指参与醇脱氢酶CmADH3进行催化还原反应的非蛋白化合物。
在本发明中，所述“辅酶因子”包括但不限于：NADPH(NADP+的还原形式)以及NADP+、NADH(NAD+的还原形式)以及NAD+。
如本文所用，所述“辅酶因子的再生系统”是指参与还原辅酶因子的氧化型形式(如NADP+到NADPH)的反应的一组反应物。通常，辅酶因子的再生系统包括但不限于：葡萄糖脱氢酶GDH和葡萄糖、甲酸脱氢酶和甲酸、异丙醇和仲醇脱氢酶、亚磷酸和亚磷酸脱氢酶。
在本发明中，用葡萄糖脱氢酶GDH和葡萄糖作为“辅酶因子的再生系统”。具体地，醇脱氢酶CmADH3酶催化还原式III化合物制备得到式II化合物，该还原反应依赖辅酶NADPH提供还原力，反应后NADPH转化为NADP+，用葡萄糖脱氢酶GDH和葡萄糖再生辅酶NADPH，葡萄糖被转化为葡萄糖酸。在所述“辅酶因子的再生系统”的作用下，辅酶因子得以不断重复利用。
如本文所用，所述“葡萄糖脱氢酶GDH”包括野生型的葡萄糖脱氢酶GDH和 突变型的葡萄糖脱氢酶GDH。其中，突变型的葡萄糖脱氢酶GDH可用已知的方法(如诱变、定向进化)以及其他类似方法产生。在本发明的一个优选例中，所述“葡萄糖脱氢酶GDH”来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)，具有SEQ ID NO.：2所示的编码序列，所述序列包括与SEQ ID NO.:2具有90％(较佳地，95％)同源性的编码序列，并且所述突变型的葡萄糖脱氢酶GDH在第252位突变为亮氨酸，且在第170位突变为精氨酸。用本发明实施例6的方法测定突变型的葡萄糖脱氢酶GDH的酶活，结果显示其酶活高达4190U/ml。
式I化合物及他汀类化合物的制备
如本文所用，式I化合物的结构式为![]()
是他汀类化合物最重要的中间体，通常采用化学方法进行合成。
本发明提供了一种生物合成式I化合物的方法，具体地，所述方法包括如下步骤：(a)在辅酶因子(如NADPH)和辅酶因子的再生系统(如葡萄糖脱氢酶GDH和葡萄糖)的存在下，用醇脱氢酶CmADH3对式III化合物进行催化还原反应，生成式II化合物；(b)将式II化合物与2，2-二甲氧基丙烷反应，形成式I化合物。用该方法得到的式I化合物具有很高的纯度，非对映异构体的含量仅为0.0106％，对映异构体的含量仅为0.01％。其中，式I、式II、式III化合物的R如前文所定义。
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本发明还提供了一种生物合成合成他汀类化合物的方法，包括步骤：
(a)式III化合物通过催化还原反应生成式II化合物，其中，所述步骤(a)在醇脱氢酶CmADH3存在的条件下进行；
(b)式II化合物与2，2-二甲氧基丙烷反应，形成式I化合物；和
(c)将所述式I化合物作为中间体，制备他汀类化合物。
用上述方法制备式I化合物及他汀类化合物，不仅能够降低成本，还能减少环境污染，具有极大的应用价值。
本发明的主要优点包括：
(1)首次将醇脱氢酶CmADH3用到阿托伐他汀中间体(式II化合物)的催化还原反应中。
(2)与Kred316相比，醇脱氢酶CmADH3具有更高的催化活性，在5.5小时内就能完成催化还原反应。TLC显示，5.5小时后醇脱氢酶CmADH3已将底物反应完全，而Kred316仍有大量底物未反应完。
(3)参与催化还原反应的葡萄糖脱氢酶GDH具有很高的酶活性，能够达到4190U/ml。
(4)催化还原反应得到的阿托伐他汀中间体(式I化合物)具有极高的纯度，非对映异构体的含量仅为0.0106％，对映异构体的含量仅为0.01％。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用方法
菌株发酵：
(1)培养基配制：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min；
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/L KH2PO4、5g/L甘油，pH 7.0-7.5，121℃高温高压灭菌20min；
斜面培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、20g/L琼脂粉，混匀后按30-40mL装液量分装到茄子瓶，竖立放置于121℃高温高压灭菌20min，降温后加入100μg/mL硫酸卡那霉素，摆放成斜面，待冷凝成固体即可。
(2)发酵培养
种子活化：取种子甘油保藏管，取100μl种子保藏液，用接种环均匀涂抹于茄子瓶斜面，然后置于37℃培养箱培养过夜(18h)；
种子培养：取100ml无菌水导入茄子瓶做成菌悬液，取菌悬液50μl接入装 有50ml TB培养基的250ml摇瓶，30℃，220rpm培养16h；
发酵：将一级种子培养液接入装有1l TB培养基的5L摇瓶，37℃，220rpm培养4-6h后，加入0.3mM IPTG并降温至28℃，220rpm诱导培养12h。
(3)菌体收集：收集发酵液，置于离心机4000rpm离心30min，弃上清后收集菌泥，放置于-20℃冷冻收藏。
(4)酶液的制备：分别称取GDH、CmAdH3、Kred316菌泥各5g，然后各加入20ml的去离子水重悬浮后，通过超声波进行细胞破碎，破碎液经过12000rpm离心10min后取上清，即为酶液，放置于冰浴中待用；
实施例1 CmADH3表达菌种的的构建
对木兰假丝酵母(Candida magnoliae)来源醇脱氢酶CmADH3的蛋白序列(NCBI登录号：ABB91667)，进行适于大肠杆菌表达的密码子优化，并全基因合成该基因序列，在两端设计酶切位点NdeI和BamHI，并亚克隆到载体pET24a(购自Novagen)上相应位点，从而获得重组质粒pET24a-CmADH3。
将构建好的重组质粒pET24a-CmADH3用氯化钙法转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到BL21(DE3)/pET24a-CmADH3。
密码子优化的基因序列(SEQ ID NO.:3)：
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蛋白序列(SEQ ID NO.1)：
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实施例2 KRED316表达菌种的构建
根据已报道的Saccharomyces cerevisiae来源羰基还原酶突变体的基因序列(中国专利申请号：200780036841.6，SEQ ID NO.315)，进行全基因合成该序列，在两端设计酶切位点NdeI和BamHI，并亚克隆到载体pET24a(购自Novagen)上相应位点，从而获得重组质粒pET24a-KRED316。
将构建好的重组质粒pET24a-KRED316用氯化钙法转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到BL21(DE3)/pET24a-KRED316。
基因序列如下：
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实施例3 GDH表达菌种的构建
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)接种于LB液体培养基中，30℃、220rpm培养24小时。参照基因组提取试剂盒说明书提取总DNA的(购自生工生物)。
根据已报道的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)来源的葡萄糖脱氢酶(GDH)的基因序列(NCBI登录号：AL009126.3)，设计引物对：GDH-F：5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAG-3’(BamHI)，GDH-R：5’-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(HindIII)。
PCR反应体系包括：GDH-F和GDH-R各50pmol，总DNA 100ng，1X KOD plus buffer，0.2mM dNTP，25mM MgSO4，KOD plus 2U，补水至总体系50μL。PCR扩增条件为：95℃5min，94℃45s，55℃45s，68℃1min，重复30个循环，68℃10min。
PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条大约800bp的特 异条带，为所需。小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用BamHI和HindIII于37℃双酶切3-6小时，过柱纯化回收。回收产物与同样酶切处理的表达载体pET24a用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子进行测序验证，获得重组质粒。
对GDH氨基酸序列的252和170两个位点做定点突变：E170R，Q252L。根据待突变的氨基酸及突变位点设计引物，采用MEGA WHOP方法(Arnold and Georgiou 2003)进行突变。
设计引物对：GDHE170R-F：AAGCTGATGACACGAACATTAGCGTT，GDHQ252L-R：AATGAAGGATATAGTGTCATACCGC。
用这对引物扩增出含有突变位点Q252L/E170R的序列。PCR反应体系包括：GDHE170R-F和GDHQ252L-R各50pmol，质粒模板pET24a-GDH 50ng，1X KOD plus buffer，0.2mM dNTP，25mM MgSO4，KOD plus 2U，补水至总体系50μL。PCR扩增条件为：95℃5min，94℃45s，55℃45s，68℃30s，重复30个循环，68℃10min。PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条大约250bp的特异条带，为所需。小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。将此PCR产物作为大引物，以pET24a-GDH为模板，采用高保真DNA聚合酶KOD plus做全质粒线性扩增，PCR反应体系包括：大引物片段50-100pmol，质粒模板pET24a-GDH 50ng，1X KOD plus buffer，0.2mM dNTP，25mM MgSO4，KOD plus 2U，补水至总体系50μL。PCR扩增条件为：95℃5min，94℃45s，55℃45s，68℃6min，重复25个循环，68℃10min。扩增完成后，在体系中加入DpnI于37℃消化去除质粒模板，然后将消化产物直接转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑取克隆进行测序验证，测序正确的表达菌种命名为BL21(DE3)/pET24a-GDH。
基因序列(SEQ ID NO.:2)：
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实施例4菌株发酵
用通用方法对菌株进行发酵，之后收集菌泥，放置于-20℃冷冻收藏，并制备酶液。
实施例5蛋白电泳检测表达产物
称取适量菌体用去离子水重悬制成浓度为20g/l的菌悬液，超声细胞破碎。取1ml破胞液离心后吸出上清液，再加入等体积水重悬沉淀，制得沉淀液。分别取15μl上清液和沉淀液与5μl 4XSDS蛋白上样缓冲液(Takara Code：D621)混匀煮沸5min，离心后取10μl进行SDS-PAGE分析。采用5％浓缩胶和12％分离胶，电泳结束后凝胶用考马斯亮蓝R250染色。
如图1所示，结果表明，kred316和CmADH3的可溶性表达都比较好。
实施例6葡萄糖脱氢酶GDH的酶活测定
分别称取GDH、CmADH3、Kred316菌泥各5g，然后各加入20ml的去离子水重悬浮后，通过超声波进行细胞破碎，破碎液经过12000rpm离心10min后取上清，即为酶液，放置于冰浴中待用。
用文献(Fujita Y,Ramaley R,Freese E.Location and properties of glucose dehydrogenase in sporulating cells and spores of Bacillus subtilis.J.Bacteriol,1977,132:282-293.)中所述的方法进行测定，测定时辅酶采用NADP。
结果表明，GDH酶液具有较高的酶活，高达4190U/ml。
实施例7 CmADH3酶与Kred316酶的催化活性比较结果
实验方法：
取2个250ml的烧杯，分别加入0.1g三乙醇胺、5ml水、4.5g葡萄糖、5g底物(6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯)，升温至30℃，用20％硫酸调节pH7.0，加入1.2ml GDH酶液，然后分别加入3ml的kred316和CmADH3酶液，用水定容至50ml并升温至30℃后，加入0.05g/L的NaNADP开始反应，用1M的Na2CO3溶液控制pH7.0。
表1不同时段的Na2CO3溶液的补加量
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用TLC检测酶对底物的消耗情况。结果表明，如图2所示，5.5h后CmADH3已将底物反应完全，而kred316仍然有大量底物未反应完。因此，CmADH3的催化效率明显高于kred316。
实施例8合成式I化合物
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6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯制备6-氰基-(3R，5R)-二羟基已酸叔丁酯
在1L烧瓶中加入水100ml、2g三乙醇胺，用20％的硫酸将pH调节至7.0，加入葡萄糖80g，搅拌，再加入50g 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯，用20％稀硫酸调节pH值为7.0，然后加入4190U/ml的GDH酶液2ml、CmADH3酶液 20ml，升温至30℃后加入0.05g/L的NaNADP后开始反应，用1M的Na2CO3水溶将pH控制为7.0，反应5小时后pH不再变化，经过TLC检测已经完全转化。
加入乙酸乙酯500ml和硅藻土50g，升温至50～60℃，过滤后分层，水层用300ml乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，浓缩得到48g的粗品6-氰基-(3R，5R)-二羟基已酸叔丁酯，为油状物。
(2)![]()
6-氰基-(3R，5R)-二羟基已酸叔丁酯制备(4R-Cis)-6-氰基-2,2-二甲基-1,3-二氧已环-4-乙酸叔丁酯
在烧瓶中加入步骤(1)获得的48g 6-氰基-(3R，5R)-二羟基已酸叔丁酯、2，2-二甲氧基丙烷50g、甲苯100ml和甲磺酸0.4g，升温至25℃，保温反应3小时。反应结束后，加入200ml甲苯，加饱和碳酸氢钠水溶液中和至pH7.5，分去水层，浓缩干有机层。加入150ml已烷，升温溶解,冷却至0℃，结晶，过滤，得45.5g(4R-Cis)-6-氰基-2,2-二甲基-1,3-二氧已环-4-乙酸叔丁酯粗品。粗品再用已烷(100ml)和乙醇(5ml)混合溶剂重结晶，过滤，烘干得26.5g(4R-Cis)-6-氰基-2,2-二甲基-1,3-二氧已环-4-乙酸叔丁酯。
实施例9分析式I化合物(4R-Cis)-6-氰基-2,2-二甲基-1,3-二氧已环-4-乙酸叔丁酯的纯度
测定方法：
气相色谱柱：SPBTM-50 30m×0.32mm×0.25um；
柱温：200℃， 检测器：300℃
汽化室：280℃ 载气：N2，柱头压力：0.05MPa
进样量：0.2μl， 空气：300ml/min
分流比：50：1 氢气：30ml/min
非对映异构体保留时间为5.85min，(4R-Cis)-6-氰基-2,2-二甲基-1,3-二氧已环-4-乙酸叔丁酯为6.38min
样品分析：称取上述样品约0.2g于25mm×25mm称量瓶中，加入分析纯的DMF1ml溶解，待仪器稳定后，用微量注射器取样品溶液0.2μl注入气相色谱仪，记录色谱图至主成份峰保留时间的二倍，删除DMF及溶剂峰，按面积归一法计算结果。
如图3所示，结果表明，非对映异构体的含量仅为0.0106％。因此，式I化合物(4R-Cis)-6-氰基-2,2-二甲基-1,3-二氧已环-4-乙酸叔丁酯具有很高的纯度。
实施例10式I化合物(4R-Cis)-6-氰基-2,2-二甲基-1,3-二氧已环-4-乙酸叔丁酯的手性分析
测定方法：
液相流动相：正已烷：异丙醇厚98：2
波长λ＝215nm， 流速＝0.6ml/min， 溶剂：流动相；
色谱柱：Chiralcel OD-H 250×4.6mm 5um；
进样量：20μl，柱温：30℃，运行时间：28min。
(4R-Cis)-6-氰基-2,2-二甲基-1,3-二氧已环-4-乙酸叔丁酯的保留时间为19.8min左右；4R，6S-isomer保留时间14.1min左右；4S,6S-isomer保留时间15.5min左右；4S,6R-isomer保留时间16.9min左右。
样品分析：称取上述样品约200mg置10ml的容量瓶中，用溶剂溶解、定容、摇匀，作为样品溶液。取样品溶液20μl，注入液相色谱仪，进行检测。
如图4所示，结果表明，在液相手性分析条件下，对映异构体的含量仅为0.01％，其他异构体几乎未检测到。
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