说明书一株高产油栅藻SDEC-13及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一株高产油栅藻SDEC-13及其培 养方法和应用。
背景技术
能源短缺和二氧化碳过度排放是当今世界两大突出的环境问题。
随着社会经济的飞速发展，初级能源消耗量持续增加，能源缺口逐年扩大， 同时由于化石燃料的燃烧，过多的二氧化碳排放到大气中导致全球温室效应。作 为一种可再生能源，生物柴油有同时解决这两个问题的潜力。藻类是一种非常高 效的生产生物柴油的原料。它的优势有：1、生长速率快，一般十几天就能收获； 2、可以在无法种植粮食的废水中进行培养，不占用耕地面积；3、亩产量可以达 到传统生物柴油原料玉米的172倍；4、由于高生长速率，其具有更高的二氧化 碳固定效率。利用微藻生产生物柴油必须保证充足的碳源和氮源,由此造成的高 培养成本是制约微藻生物柴油规模生产的主要因素。
为实现能源微藻油脂的高效积累及生产，国内外就富油微藻筛选，高密度、 高油脂含量微藻的培养等方面进行了研究。目前针对提高油脂含量的研究主要集 中在微藻的最优生长条件上，包括光照强度、光质、pH值、培养基(营养物质)、 温度等影响产油藻类的生长因子、以及反应器设计和营养方式等方面。目前利用 废物培养微藻以降低培养成本成为当前能源微藻资源开发研究中的热点和难点。
热电厂废气中含有大量的二氧化碳和一氧化氮，如果能利用电厂废气养藻， 不仅可以降低微藻生物柴油的生产成本，还可以处理电厂废气。二氧化碳是微藻 能够有效利用的无机碳源，废气中的一氧化氮容易被氧化成二氧化氮，二氧化氮 易溶于水且生成硝酸根，可以无机氮源供微藻利用。但是高浓度的二氧化碳和氮 氧化物对藻类有一定的毒性，而不同的藻种呈现不同的耐受性。据报道有些球藻 和栅藻能够在浓度30％(v/v)以上的二氧化碳环境快速生长，小球藻对0.2％的 一氧化氮具有耐受性。因此筛选能够耐受这些烟气的藻种是使用电厂废气养藻的 首要而关键的一步。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中用于生产微藻油脂的优良藻株不足和培 养成本高的问题，提供一株高产油栅藻及其利用工业废气的培养方法，即在自然 水体采集水样，分离纯化获得一种具有油脂含量较高(27％)、易开放培养的产油 微藻，并建立培养方法。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
一株高产油栅藻SDEC-13，为Scenedesmus quadricauda SDEC-13，其保藏 编号为CCTCC NO:M 2014498，保藏日期为2014年10月19日，保藏单 位为中国典型培养物保藏中心。栅藻SDEC-13富含优质油脂，油脂含量可达到 细胞干重的30.75％，脂肪酸中饱和脂肪酸可达到82.87％，可作为生物柴油原料。 十六烷值(57)高于欧洲标准(51)和碘值(83.36g I2/100g)决定了以该株微 藻为原料制备的生物柴油具有很好的氧化安定性。
所述的高产油栅藻SDEC-13，其核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的核苷 酸序列。
本发明还提供了一种上述的高产油栅藻SDEC-13培养基，其成份和用量为 NaNO32.5g L-1,K2HPO40.075g L-1,MgSO4·7H2O 0.075g L-1,CaCl2·2H2O 0.025 g L-1,KH2PO40.175g L-1,NaCl 0.025g L-1,土壤提取液40ml L-1,FeCl3·6H2O 0.005g L-1,Fe-EDTA 1ml L-1,H3BO32.86mg·L-1，MnCl2·4H2O 1.86mg·L-1， ZnSO4·7H2O 0.22mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.39mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.08mg·L-1， Co(NO3)2·6H2O 0.05mg·L-1，初始pH值在7～7.5之间，接种后的藻细胞密度为 0.35～0.40×106cells.mL-1。
所述土壤提取液的制备方法为：称取200g富含腐殖质的土壤，加入1L纯 净水；持续煮沸1h后静止3h，重复三次；过滤即得。
上述的高产油栅藻SDEC-13培养基的应用，其特征在于，所述的培养基培 养高产油栅藻SDEC-13，得到高产油栅藻SDEC-13藻粉。所述高产油栅藻 SDEC-13藻粉的饱和脂肪酸含量为82.87％，十六烷值为57，碘值为83.36g I2/100g。
本发明提供了一种培养上述高产油栅藻SDEC-13的培养方法，包括如下步 骤：
a)将高产油栅藻SDEC-13培养于添加BG11的培养基中，培养温度为 25±1℃，全光照，光照强度2000-3000Lux，培养7天；
b)将所得藻细胞转移至SE培养基中进行扩大培养，曝气气液比为0.1-0.2 vvm，气体为空气、含有15％CO2的空气或含有15％CO2和0.2％NO的空气，培 养温度为25±1℃，全光照，光照强度2000-3000Lux，待高产油栅藻SDEC-13 生长到稳定期离心、干燥即得到培养后高产油栅藻SDEC-13藻粉。上述的百分 数皆为体积百分数。
上述的高产油栅藻SDEC-13在处理污水和/或废气中的用途。所述处理为净 化。
进一步地，所述污水为工业废水或城市生活污水，所述废气为工业废气。
上述的高产油栅藻SDEC-13在制备生物柴油和/或油脂中的用途。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
1、本发明提供的藻种可以利用废气中高浓度CO2从而降低培养成本。本发 明栅藻富含优质油脂，总油脂含量可达干重的27.2％，脂肪酸中饱和脂肪酸含量 最高可达到82.87％，脂肪酸成分中，碳链长度为16-18的脂肪酸含量可达98％ 以上，适合作为生产生物柴油的原料。
2、本发明提供的栅藻SDEC-13能够耐受高浓的二氧化碳和有毒气体一氧化 氮。因此栅藻SDEC-13能够利用工业废气中的二氧化碳进行培养，降低生产成 本。本发明提供的栅藻SDEC-13含油量丰富，所含生物柴油品质高，重力学粘 度、比重、十六烷值等生物柴油指标均符合国家和国际标准。
附图说明
图1为栅藻SDEC-13的光学显微镜照片和扫描电镜照片。
图2为基于18S rRNA部分序列构建的系统发育树。
图3为不同曝气成分条件下，栅藻SDEC-13的生物量随时间的变化。
具体实施方式
以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述 的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法 和条件进行选择。
实施例1
藻种的获得和鉴定
一、样品采集
2012年11月从山东省济南市山东建筑大学人工湖采集富含微生物的水样。
二、栅藻SDEC-13的分离纯化和筛选
水样经过富集培养后，在显微镜下对藻细胞进行计数。根据计数结果将水样 稀释至其中的藻细胞浓度约为1个/50微升。在无菌环境下，向96孔板的每个孔 中加入50微升水样，再加入200微升BG 11培养液，BG 11培养基成分为：NaNO31.5g/L,K2HPO40.04g/L,MgSO4·7H2O 0.075g/L,CaCl2·2H2O 0.036g/L,Citric acid 0.006g/L,Ferric ammonium citrate 0.006g/L,EDTANa 0.001g/L,NaCO30.02 g/L,A5trace metal solution 1ml/L.The A5trace metal solution was composed of H3BO32.86g/L,MnCl2·4H2O 1.86g/L,ZnSO4·7H2O 0.22g/L,Na2MoO4·2H2O 0.39g/L,CuSO4·5H2O 0.08g/L,Co(NO3)2·6H2O 0.05g/L。将96孔板放在培养箱 内进行恒温培养，大约十余天后96孔板的孔内生长出藻类群落。在无菌环境中 将96孔板中的藻分别转移至装有10mL BG 11培养基的试管中，继续在培养箱 中培养至试管中藻液变绿。然后对试管中藻液在显微镜下进行镜鉴，将纯的藻种 进行保存。
将这些纯的藻种分别进行曝气培养，选出生长状况较好同时油脂含量较高的 一株为目标藻种。命名为SDEC-13。
三、栅藻SDEC-13的鉴定
1、栅藻SDEC-13的形态学鉴定
使用光学显微镜(CX31,OLYMPUS,Japan)在放大四百倍条件下观察栅藻 SDEC-13的藻细胞特征。藻细胞具有典型的栅藻细胞形态特征，细胞呈长圆形， 单个细胞长度约为5～10微米。通常以两个或四个的细胞群体状态存在，四个角 都长有脊刺，图1为栅藻SDEC-13的光学显微镜照片和扫描电镜照片。
2、栅藻SDEC-13的分子生物学鉴定
离心收集对数生长期的藻细胞，使用DNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取基因 组总DNA，对其进行18S rDNA扩增。PCR扩增体系为50μL，其中包括Taq PCR Master Mix 25μL， DNA样品1μL，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，ddH2O 20μL。 PCR扩增程序为:94℃预变性1min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸 1.5min，重复30个循环；72℃延伸10min。
上下游引物分别为：CTGGTTGATCCTGCCAG(18S-F)和 TTGATCCTTCTGCAGGTTCA(18S-R)。
PCR扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。PCR扩增产 物为18S rDNA的部分序列，长度为1046bp测序结果如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：
CGAATCGGTATTACGCGTAGACTCTGTGCAGTATCACAGAGACTGCTTAT ACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGGTGGT ACCTTCTTACTCGGAATAACCGTAAGAAAATTAGAGCTAATACGTGCGTA AATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATATATTAGATAAAAGGCCGACCGGG CTTTGCCCGACCCGCGGTGAATCATGATATCTTCACGAAGCGCATGGCCTT GTGCCGGCGCTGTTCCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAG GATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGAT TCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCA GGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAA CAATACCGGGCATTTCATGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATC CCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTA GTTGGATTTCGGGTGGGTTTCAGCGGTCCGCCTATGGTGAGTACTGCTGTG GCCTATCTTACTGTCGGGGACCTGCTTCTGGGCTTCATTGTCCGGGACAGG GATTCGGCATGGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCTTAC GCCGTGAATACTTTAGCATGGAATAACATGATAGGACTCTGCCCTATTCTG TTGGCCTGTACGAGTGGAGTAATGATTAAGAGGAACAGTCGGGGGCATTC CGTATTTCATTGTCAGAGGTCACATTCTTGTATTATGAAAGACGAACTACT GCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTACTCAAGAACGAACAGTTGG TGGTTCGAAGACGATTACATACCGTCGTAGTCTCAACCCATACACGATGC CGAACTAGGGATCTGCGCAGAACGGTTTCTTGGCTGACT
根据测序结果，利用Clustalx1.83、Mega 6等相关软件与GenBank数据库中找到的同 源序列进行比对分析，并采用NJ(neighbor-joining)法构建系统发育树(见图2)。栅藻 SDEC-13与Scenedesmus subspicatus(AJ 249514.1)的Query coverage值达到100％，Max ident 值为99％。系统发育树同时显示栅藻SDEC-13进化地位与栅藻属最为接近。
实施例2
为了考察栅藻SDEC-13在通入高浓度CO2及有害气体NO时的生长速率及耐受有害气 体的能力，使用上述SE培养基对栅藻SDEC-13进行曝气培养，其成分和组成如下：NaNO32.5g L-1,K2HPO40.075g L-1,MgSO4·7H2O 0.075g L-1,CaCl2·2H2O 0.025g L-1,KH2PO40.175 g L-1,NaCl 0.025g L-1,土壤提取液40ml L-1,FeCl3·6H2O 0.005g L-1,Fe-EDTA 1ml L-1, H3BO32.86mg·L-1，MnCl2·4H2O 1.86mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.22mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.39 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.08mg·L-1，Co(NO3)2·6H2O 0.05mg·L-1，该培养基是无碳培养基， 所以栅藻生长只能利用曝气中的CO2。在培养基中接种新鲜的栅藻SDEC-13藻种，控制接 种浓度约为0.5×106个/升，曝气成分分别为空气(CO2浓度约为0.03％)、含有15％CO2的 空气、含有15％CO2和0.2％NO的空气。在光照强度为2500lux，温度为25±1℃的条件培 养至稳定期后三天。每24小时取样，烘干测干重，得到栅藻SDEC-13的生长曲线(图3)。
培养结束后离心收获，条件为8000rpm离心5分钟。将藻泥在60℃下烘干后研磨即得 栅藻SDEC-13藻粉。用作测定总脂含量和脂肪酸甲酯组成。
由生长曲线可以看出，栅藻SDEC-13在通入15％CO2培养时生长速率及最大生物质浓 度均比仅通入空气时高。在用15％CO2时，栅藻SDEC-13的生长速率、生物质产率及最大 生物质浓度分别为0.186d-1，87mg L-1d-1和1074mg L-1。
说明栅藻SDEC-13能够有效利用高浓度CO2作为无机碳源，实现自身生物质的积累。 在使用15％CO2和0.2％NO培养时，栅藻SDEC-13的生长速率、生物质产率及最大生物 质浓度分别为0.128d-1，51mg L-1d-1和789mg L-1，较通入15％CO2培养时各项数据均有 所下降，说明NO确实对栅藻SDEC-13的生长有不利影响。但是生长状况较仅通入空气时 好，说明栅藻SDEC-13能够在有毒气体中生长。
实施例3
为了考察栅藻SDEC-13在通入高浓度CO2及有害气体NO培养时生产生物柴油的能力， 利用实施例2中获得的藻粉测定其总油脂含量和脂肪酸甲酯的组成。
干藻粉总油脂含量的测定方法如下：称取约0.1g干藻粉(m1)于50mL离心管中，加 入10ml氯仿/甲醇(2:1)溶液，用超声破碎仪破碎(处理)10min(频率为20％)，然后4000 r/min离心10min，离心完溶液分两相，将上清液转移到60mL的分液漏斗中，整个提取过 程重复两次；根据油脂提取液体积，投加0.9％的氯化钠溶液(1:5，加入氯化钠溶液体积为 油脂提取液体积的1/5)，充分摇匀1min，并静置15min；测量低相溶液体积V，并取5ml 低相溶液于10mL玻璃试管(m0)中，用氮气吹干，将玻璃管放置于80℃烘箱中烘至恒 重(m2，约30分钟)。
栅藻SDEC-13的总油脂含量在通入空气培养时为19％，通入15％CO2时为27％，在通 入15％CO2和0.2％NO时为25％。由此可见，栅藻SDEC-13可以高效利用高浓度CO2作为 无机碳源积累油脂，而有毒气体NO的加入虽对油脂积累产生一定影响，但是油脂含量仍 高于仅通空气培养时的水平。
脂肪酸甲酯成分测定方法如下：取0.1g藻粉于离心管中，加入2mL浓度为5％的NaOH 甲醇溶液，将其置于恒温水浴锅中60℃水浴1小时后，冷却。向反应后的溶液中加入正 己烷1mL，静置30min后，提取上层溶液100uL置于干净的试剂瓶中，再将25uL内标物 (2mg/L,十七烷酸甲酯)加入试剂瓶中，待测。采用全扫描模式，扫描范围为50-300amu。 色谱柱：VF-23ms，采用程序升温的方法：150℃保留1min，然后以1℃/min升温至165℃， 进样口温度：220℃。
表1 不同曝气成分对栅藻SDEC-13脂肪酸甲酯组分的影响
-：未检出
在三种条件下栅藻SDEC-13油脂中适合生产生物柴油的C16-C18脂肪酸含量都比较高， 而性质更加稳定的不饱和脂肪酸比重随着高浓度CO2的加入降低了约20％，但也含有 62.22％。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的 限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需 要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。