作为多核苷酸交联剂的非核苷的香豆素衍生物 介绍
相关申请的交叉参考
本申请是1993年4月13日申请的美国专利申请08/046,568的部分继续申请。美国申请08/046,568在此引用作参考。
【技术领域】
本发明涉及光活性的核苷类似物，它可在自动DNA合成过程中合并入合成的寡核苷酸用于交联靶核酸序列的互补链。
背景技术
K.Yabusaki等在美国专利4,825,967中已证明可在核酸杂交分析中使用可交联探针连接靶序列；化合物是基于呋香豆素(或补骨脂素)连接于存在的多核苷酸(一般是通过加成产物形成)且在多种应用中是令人满意的。但是，交联基/核苷加成物很难合成，特别是大量合成。在美国专利5,082,934中Saba等描述了含有香豆素部分通过其苯环连接到无碱基的核糖或脱氧核糖部分的1-位的光活性核苷类似物。所得核苷类似物在杂交分析中作为光交联基团插入多核苷酸中作为一个或多个互补核苷碱基的替代物存在于探针中。
然而，人们仍希望得到新的具有更多优点，如在整个探针合成和使用过程中稳定，且构象容易改变的化合物。
发明的概述
本发明提供了非核苷的，稳定的，光活性的化合物，可在核酸杂交分析和治疗应用中用作光交联剂，还提供了可用于制备终产物地技术和中间体。
本发明的化合物含有香豆素基衍生物，通过将香豆素分子或其衍生物的苯环连接到羟基或多羟基烃分子，如甘油分子的一个末端羟基上。所得化合物的(多)羟基烃部分等价于核苷中的糖，而香豆素部分占据了碱基的位置。因此，可使用多核苷酸合成的自动(或手动)技术将化合物插入生长的多核苷酸链。在香豆素环系中3和4位之间的双键是光活性基团，当寡核苷酸含有此非核苷类似物(即“探针”)用于杂交分析和/或治疗应用中时，它在互补链中共价连接到核苷上。
通常，光活性化合物具有通式如下：其中取代基和连接基团如下详述。
(多)羟基烃主链使得它们存在的寡糖结构具有最大的容易改变性和稳定性，以及在含水和有机介质中好的溶解性。
发明详述
本发明提供了可交联化合物，它可在杂交分析和/或治疗应用中在寡核苷酸探针中用作光活性非核苷交联剂。在杂交分析中，本发明化合物一般用作合成的DNA或RNA寡核苷酸的一部分用于测定样品中特定DNA和RNA碱基序列的存在与否。更具体地讲，本发明提供了连接到稳定的，柔韧的，(多)羟基烃主链单元上的香豆素衍生物，它可在杂交分析中用作光活性交联化合物。
本发明的化合物具有通式如下：
主链部分-连接部分-交联部分
在这里以及说明书其它部分的“部分”是指执行所指功能的分子的一部分。所给部分一般从其它分子通过共价连接两个或多个分子得到，具有原始分子可确认的剩余部分被称作“部分”。例如，如果补骨脂素分子通过二价键，如亚甲基连接到甘油分子上，所得单个分子被认为是从甘油，亚甲基和补骨脂素部分形成的。如下所述，这三部分不一定，但是事实上从三个分开的分子衍生得到的。因此，“从…衍生”可指理论上的，以及事实上的前体。
交联部分将从具有稠合的苯并吡喃酮结构的分子衍生得到。这些分子如下：(1)香豆素及其简单衍生物；(2)补骨脂素及其衍生物，如8-甲氧补骨脂素或5-甲氧补骨脂素(文献中描述过至少40种其它的天然补骨脂素，且它们可用于本发明)；(3)顺-苯并二吡喃酮及其衍生物；(4)反-苯并二吡喃酮；和(5)含有稠合香豆素-噌啉环系的化合物。所有这些化合物在与靶链核苷酸交联的合适的取向和合适的距离含有必须的交联基团(活化的双键)。所有这些分子都是香豆素衍生物，因为都含有碱性香豆素(苯并吡喃酮)环系，所以分子的剩余部分被碱化。
连接部分一般从含有1-100，优选1-25，更优选1-10原子在两个位置具有彼此连接到其它部分的功能基的前体形成。当前体反应形成连接部分之后，在香豆素环系的原子和主链部分(糖取代基)的原子之间的最短连接链的总原子数一般为1-15，优选1-7，更优选1-3。另外，此部分结构可有很大变化，因为它基本上只是从交联部分到主链部分的一个柔韧的键。
连接部分一般大多是稳定的环或非环部分，通过具有合适的用于在一端连接交联分子在另一端连接主链分子的功能基(一般在其末端)的分子反应得到。但是，如果在主链和交联部分存在足够的功能基，可以不使用连接部分的前体(即，主链和交联部分可直接通过共价键连接)。
应理解所描述的最终分子的属于上述定义的特定部分的特定部分多少有些任意性且不一定是指由三个原始分子反应形成的最终产物。有一系列香豆素衍生物，例如，具有连接到香豆素环上的功能化甲基或甲氧基可与主链部分前体上的功能基反应形成只由两个起始物质形成的产物。但是，所得结构一般显示出具有如上所述的三部分：主链分子插入多核苷酸的糖主链，交联部分占据正常核苷中碱基的位置，和连接两个主要部分的原子(即，连接部分)。为了方便起见，连接部分被认为是由在交联部分连接点的环原子和在清楚地形成替代糖分子的主链部分，一般是带羟基的碳原子(或羟基的反应产物)，即与交联部分最近的原子之间的原子组成。
主链部分，如此称呼是因为其最终的功能是代替多核苷酸主链中核糖或脱氧核糖部分，一般具有1-3个(有时更多)羟基(或如下讨论的类似的功能基)连接在不同的sp3-杂化的碳原子上。主链部分一般无电荷，因此它可在最终修饰的核苷酸中作为核糖或脱氧核糖的替代物。主链部分包括但并不限于下面这些：(1)直链烃部分如三碳丙烷单元或带有合适的功能基的更长烃链，这些功能基一般选自-OH，-NH2，-SH，-COOH，酰基卤，和酸酐，和(2)环烃部分，一般具有5-7员碳环结构，具有1-3个羟基或如(1)所述的其它功能基。前面句子中所述的功能基是非反应形式的且许多实施方案中将以所述功能基的衍生物的形式存在。上述反应性功能基(不同于-OH和-SH)一般只存在为中间体；但是，与其它功能基反应后，它们形成稳定的基团或形成共价键与分子的其它部分相连。
除了上述碱性结构，一个或多个偶联部分可连接到主链部分以促进已存在的或生长的多核苷酸链的键的形成。当正被讨论的分子是用于制备探针分子的中间体时，偶联部分一般含有羟基偶联和/或保护基用于在溶液或固相核酸合成。典型的偶联基包括氨基磷酸酯(phosphoramidite)，磷酸酯，H-膦酸酯，硫代磷酸酯，膦酸甲酯，三苯甲基，二甲氧三苯甲基，单甲氧三苯甲基，和pixyl基。非磷偶联基团包括氨基甲酸酯，酰胺，和直链和环状烃基，一般连接到具有杂原子取代基的分子的剩余部分，如-COCH3，-CH2OH，-CF3，-NHCH3，和PO2CH2CH3。为了回顾这类化学问题，请参见“寡核苷酸合成的实用方法”(“Oligonucleotide Synthesis，APractical Approach”)，M.J.Gait，ed.，IRL Press Ltd.，牛津，英国，1984，这里引入作参考。优选的本发明化合物具有如下式(I)结构：其中
B代表(1)直链，支链，或环烃基，含有2-15，优选3-10，更优选3-6个碳原子，且如果是环状的，含5-或6-员环或(2)5-或6-员杂环芳香环系，B(1)和B(2)都可被1，2，或3个式OR1的基团取代；
X代表(1)直链，支链或环状含有1-15个，优选2-10个，更优选3-6个碳原子的烃基或(2)这类X基团中(1)1个至3个碳原子(优选1个)或烃基中的原子被氧，硫或氮原子代替，且其中X中的原子与分子中其它与X相连部分的原子之间的最短连接链为1-10个原子，其中X任意被1-3个选自羟基，卤素，氨基，酰氨基，叠氮基，羧基，羰基，硝基，硫代，全氟甲基，和氰基的功能基取代；
n是0，1，2，或3；
每个W分别代表羟基，卤素，氨基，酰氨基，叠氮基，硝基，硫代，羧基，羰基，全氟甲基，或氰基功能基；具有10个或更少碳原子，优选6个或更少碳原子，更优选3个或更少碳原子的未取代的烃基；或这类烃基被1-3个功能基取代或其中一个碳原子被氧，硫，或氮原子取代；
条件是(1)当X或W是取代的烃基时，在X或W中的取代基中的总原子数应少于X或W中的碳原子总数，且不多于一个取代基或杂原子与所给碳原子相连，除非所给碳原子上的取代基是卤原子；(2)在所有W的取代基的碳原子总数应为15或更少，优选10或更少，更优选6或更少；且(3)两个W与它们所连接原子的剩余部分可形成一个环(例如，补骨脂素中的情况)；
Y和Z分别代表H，F或低级烷基(一般为5个或更少的碳原子，优选3个或更少)；且
每个R1分别代表H，F或在多核苷酸合成中可保护或偶联羟基的羟基保护或羟基偶联基团或一个或两个(优选两个)R1代表连接到化合物上的核苷酸或多核苷酸。
桥联B-X键的功能基中(如醚或羧酸酯)的氧原子或其它非-C原子(如果存在)一般从B的前体中的羟基开始，但它可看作X的一部分(为了容易定义不同的取代基)，且下式，除非相反，从上下文的讨论中是可清楚得知的。
在上述式I中，特定的化合物是优选的。分子中最重要的部分(至少从这些化合物与已知化合物不同的角度来看)是B或主链部分。优选的B部分属于第一亚结构第二亚结构或第三亚结构其中
s是2或3；
Rx，Ry和Rz分别代表H或OR1；
m，n，p，q，和r分别代表0或1；
亚结构式中的一个氢被共价键取代与X基团相连；且
式中化合物中所有其它取代基和定义与前面的通式I的定义相同。
亚结构中被共价键取代与X基团相连氢原子一般是羟基(即，至少一个OR1代表在这类前体分子中的羟基)的氢。但是，此优选方案只为了便于合成，其结果是B-X键很容易从(多)羟基烃前体获得，这些(多)羟基前体大多数是商业可得的。如果需要，也可用特定的共价键取代其它氢。实际用于合成的分子一般是从其中一个羟基被功能基取代的(多)羟基化合物衍生来的，一般经过一系列反应。例如，羟基可被卤原子或其它离去基团取代，且在X基团前体中存在给电子基时，离去基团可参与键的形成。
尽管不饱和化合物(包括芳香环)也可以，但优选B是从饱和烃形成的化合物。在不饱和化合物(包括芳香族)中，优选-OR1取代基不直接与sp2-杂化的碳原子相连，而与中间的sp3碳原子连接，如在-CZ2OR1中，其中Z代表H或烷基。
通式I化合物中优选其中B是三个亚结构式中第三个亚结构式的化合物，特别是那些m+n+p+q+r＝0，1，或2。更优选那些第三个亚结构式的化合物代表非环的，饱和的，二或三羟基烃，特别是甘油和以离指定羟基最远的末端位置与X基团相连的3-5个碳原子的1，2-或1，3-二羟基烷，如4，5-二羟基戊基，3，5-二羟基戊基，2，4-二羟基-2-甲基丁基，3-羟基-2-(羟甲基)丙基，和2，3-二羟基丙基。
芳香环系也可在B部分存在，尽管如前所述，这些化合物是非优选的。它们包括烃和杂环芳香环系。这些化合物中优选其中B含苯环或萘环环系的，特别是1，2-二(羟甲基)取代的芳香化合物。当B含有杂环系，如呋喃，吡喃，吡咯，吡唑，咪唑，哌啶，吡啶，哌嗪，嘧啶，pyrazidine，噻吩，吖啶，吲哚，喹啉，异喹啉，喹唑啉，喹喔啉，氧杂蒽或1，2-苯并吡喃环系时，优选相同的取代基。
尽管非优选但也在本发明范围内的化合物是其中B含有桥烃环系，如双环[3.1.0]己烷或[2.2.1]庚烷环系的化合物。这些分子具有弱可移动性的构型，所以不同的顺和反取代可容易地制备并保持。参见例如，Ferguson，“有机分子结构”，Willard Grant，Boston，1975，17-19章，为此化学和合成技术的综述。同样地，化合物的B中含有螺或二螺烃环系的化合物也在本发明范围内。
如前所述，X连接基团并不限于结构，因为它并不存在于分子中既与主链结构的剩余部分作用或与多核苷酸互补链作用的部分。但是，优选在此部分具有下列结构的分子，如下所列，它们可代表X，在两个可能的取向：-OCH2-，-SCH2-，-NHCH2-，和 -CL2(CH2)n-，其中，L代表H，F，Cl，I或Br，且n＝0，1，或2。
其它(但较少)优选的化合物是那些其中X含有5-或6-员碳的环结构或杂环(后者含有一个O，S或N原子)，如环戊烷，环己烷，二氢呋喃，吡咯或吡啶。
在交联部分，Y和Z如果是烷基一般具有5或更少的碳，优选3或更少，且最优选甲基。优选其中W、Y和Z都是氢的化合物，尤如其中W如是稠合于该式的苯环的吡喃酮或呋喃环时的化合物。在后面的化合物中优选其中通式I的X右侧的整个结构式代表香豆素，补骨脂素，顺-苯并二吡喃酮，或反-苯并二吡喃酮或在通式范围内它们的衍生物。
核苷酸或多核苷酸一般(但不总是)通过含磷的连接基团与通式I化合物相连。优选的含磷连接基团，以及其它连接基团还将予以讨论。这些化合物是本发明的优选化合物，因为它们可直接用于分析和交联过程，这是本发明最主要的最终应用。这些化合物具有分子式(Nm1Qm4Nm2)m3，其中m1和m2是整数(一般少于200，优选少于100；m1和m2之一一般优选最少是14，优选最少是17，更优选最少是20)；m3是1-10的整数，优选1-5(m3一般少于(m1+m2)/10)；每个N分别代表所需多核苷酸序列的一个核苷；Q代表插入正常多核苷酸序列的本发明的核苷酸替代分子；且m4是1-5，优选1-3。也可在多核苷酸序列中相隔几个(一般是一或两个)正常碱基存在一个或多个Q部分，只要存在连续的核苷序列以保证杂化物的稳定。这类序列一般被认为等价于连续的Q序列。优选的连续正常核苷酸序列的长度如上根据m1和m2测定。
Q可既可存在于多核苷酸中间也可存在于其一个末端。当在中间位置时，必须至少存在两个R1基团以使Q分子可与两个分开的链的末端相连；如果Q插入末端位置，只需要一个R1，尽管在两种情况下可存在其它的可能。
应理解在m3大于1的多核苷酸序列中，每个Nm1Qm4Nm2可以彼此不同；即多个Q部分可沿着分子的长度任意存在，只要上述剩余参量照作。
优选的一组多核苷酸具有在分子一个或两个末端带有1-5个Q部分的连续正常碱基长序列(优选1-3个Q部分)。如前所述，Q部分可连续也可被几个正常核苷酸间隔开。两个以上的Q部分(连续或不连续)存在于探针中间并在交联Q单元的两边具有相对长的连续序列也是优选的实施方案。
在所有优选方案中，至少一个核苷连续序列与相应的靶核苷酸互补。此连续序列在杂交过程中要稳定以保证对靶核苷酸的正确确认。在本发明方法中导致稳定性和选择性的因素与在其它杂交过程中相同。接有Q部分的互补核苷酸的连续序列与接有非互补正常碱基的靶核苷酸的连续序列在这方面没有什么不同。因此，含有本发明交联部分的多核苷酸的稳定性可从核酸杂交的标准方法预测出。
还优选其中B部分中存在两个R1基团，且它们都代表不同的羟基偶联或羟基保护基的化合物，因为这类化合物易于合成可交联的多核苷酸。这些保护基和活化基团在本说明书的其它部分有讨论。
本发明另一组优选的化合物具有以下通式II结构，它们中大多数在通其中
n1是0-10(优选0-5，更优选1-3)；
n2是0-5(优选0-2，更优选0或1)；
n3是0-5(优选0-2，更优选0或1)；
每个W分别是小的稳定的取代基含有不超过15个原子(特别是低级烃基；卤素，硝基，硫代，氰基，羰基，羧基，羟基，氨基，酰氨基，或多氟烷基；或含有一个或多个杂原子的烃基取代基(即，非碳原子或氢原子可在25℃在水中与碳形成稳定的共价键)；
Y和Z分别代表H，F，或低级烷基；
X是有机基团，含有(a)1-10个碳原子和(b)0-10个，优选0-2个，选自O，S和N的杂原子，且X在与它相连的该式中的其它原子之间具有1-10个原子的最短连接链；
R2是H或OR1；且
R1是H或在多核苷酸自动合成过程中可与羟基偶联或保护羟基(前者优选只在主链部分末端的羟基上存在)的基团。另外，R1代表通过磷酸二酯键或其它典型地用于在多核苷酸中偶联糖的连接基团连接到化合物上的核苷酸或多核苷酸。优选的偶联基团包括含磷基团如亚磷酸酯，氨基磷酸酯(phospohramidite)，磷酸酯，H-膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，和膦酸甲酯。非含磷偶联基团包括氨基甲酸酯和酰胺。低级烃基包括C1-C6链烯基和链烯基以及C3-C6环基，优选包括C1-C4烷基和链烯基；特别是甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，和叔丁基。具有杂原子取代基的典型烃基包括-COCH3，-CH2OH，-CF3，-NHCH3，-CO2CH2CH3，和-CON(CH3)2。
本发明的化合物既可作制备中间体也可用作用于例如在杂交分析中作为探针的光活性多核苷酸组分。由于本发明的目的是一个或多个这些分子最终成为多核苷酸的一部分，形成分子的主链部分一般可从甘油或不同的多羟基烃分子衍生得到。甘油基或其它多羟基烃分子可被插入核酸主链的任何位置，一般通过磷酸二酯型键与分子中邻近的核苷的3′和/或5′羟基连接，一般在此插入之前交联部分先连接到主链部分上。
本发明化合物的交联部分可从香豆素本身或一系列取代的香豆素衍生得到。在交联部分前体中要与甘油或其它主链部分连接位置的有机功能基一般用于在终产物中连接交联部分和主链部分。由于最终产物可使用不同的合成路线合成，任何所给产物都将有几个可能的前体。连接部分可从分开的分子衍生得到，或从交联部分前体的反应部分和主链部分前体的反应部分形成。
除了连接位置的其它位置，香豆素(或其它)环系既可以是未取代的也可以是取代的。一般在苯环上的取代基是小的，稳定的常在有机化合物的芳香环中出现的取代基。可根据改变香豆素的刺激波长选择所需的取代基。在3-和4-位的取代基一般是非极性的，且大多数为烃基取代基，甲基是最常见的。尽管香豆素的取代基位置可变化，取代通常在4-，5-，6-，7和8位。
在香豆素部分前体的优选方案中，在与主链部分前体反应之前，具有如下结构式：其中，
Y，Z，n2，M和W定义如前；且
X1是全部或部分X连接部分的前体。X1将与连接部分前体上的有机功能基反应形成共价键。一般的反应性功能基包括羟基，胺，卤素，硫代，羰基，羧酸酯，羧酰胺，甲硅烷基和乙烯基。可从香豆素本身或许多商业可得的香豆素衍生物使用有机合成的标准方法合成这些前体。
在某些优选方案中，甘油主链部分前体具有如下通式：其中
R1，R2和n1，以及n3定义如前，且
X2是全部或部分X连接基团的前体。
X2将与香豆素部分上的有机功能基反应形成在最终连接部分X中的共价键。X2一般选自反应活性功能基以及能进行亲核或亲电取代或加成的亲核和亲电基团。具体的功能基的例子包括羟基，氨基，卤素，硫代。羰基，羧酸酯，羧酰胺，乙烯基，和硅烷衍生物。这些前体可使用有机合成的标准方法从(多)羟基烃如甘油，商业可得的1，2-或1，3-二羟基烷衍生物，或在指定羟基上有羟基保护基的这些化合物合成。参见Misiura，K.，Durrant，I.，Evans，M.R.，和Gait，M.J.，核酸研究(Nucleic Acids Res.)(1990)18，4345-4354，此篇文章讨论了类似于本发明主链部分结构的连接部分在多核苷酸合成中与碱基的连接，此文章在此引用作参考。
本发明化合物可被有机化学的标准合成技术，并按照本说明书中列出的路线合成。例如，一般从商业可得的起始材料开始，按照下述反应流程进行。
一般合成的反应过程如下(a)氢化钠(NaH)/CH3-O-CH2CH2-O-CH3(b)7-溴甲基香豆素(c)HCl(aq.)，THF(四氢呋喃)(d)DMTrCl(4，4′-二甲氧三苯甲基氯)，吡啶(e)ClPN(ipr)2OCH2CH2CN，CH3CH2-N(ipr)2，CH2Cl2
实施例1
7-香豆素基甲基溶胶酮缩醇(solketal)
向120g乙二醇二甲醚中加入solketal(2.64g，19.0mmole)和氢化钠(0.88g，22.0mmole，60％在矿物油中)。向所得悬浮液中用7分钟分批加入7-溴代甲基香豆素(4.8g，19.0mmole)。10分钟后，向其中加入1.5ml冰醋酸中止反应。离心过滤从悬浮液中分出固体。将溶液浓缩成固体。将固体用硅胶色谱纯化，使用氯仿/乙酸乙酯97∶3作为洗脱剂。用TLC检测并合并含有产物的部分，真空浓缩得到白色固体。产量630mg；熔点75-80℃，在CHCl3/乙酸乙酯9∶1中，Rf2＝0.55。
实施例2
1-0-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-0-(7-香豆素基甲基)甘油
将7-香豆素基甲基solketal(800mg，2.74mmol)溶于四氢呋
喃(12ml)的溶液，并在盐酸(6ml)中处理20分钟。将此溶液
与无水乙醇(2×5ml)共沸蒸发干燥得到油状物。所得溶液用25ml
饱和碳酸钠溶液洗涤，然后用3×25ml乙醚萃取。所得溶液在真空
浓缩成油状物。将油状物与吡啶(2×5ml)共沸蒸发干燥得到干燥
产物。向液体中加入吡啶(30ml)，4-二甲基氨基吡啶(25mg)
和三乙胺(200μl)。向所得溶液中加入4，4′-二甲氧三苯甲基氯
(905mg，2.95mmole)。将反应混合物搅拌2小时。向其中加入37.5ml
水中止反应，所得溶液用乙醚2×180ml萃取。合并乙醚萃取物在真
空浓缩，然后溶于15ml二氯甲烷中，用硅胶色谱纯化，使用丙酮/
己烷4∶6为洗脱剂。收集Rf＝0.5的部分，并蒸发至干，得到产物
(770mg，产率55％)。
实施例3
1-0-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-0-(7-香豆素基甲基)-
2-0-[(N，N-二异丙基)(2-氰基乙基)氨基磷酸酯)]甘油
将1-0-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-0-(7-香豆素基甲基)甘油(1.20g，2.18mmol)与混合溶液(5ml吡啶和1.5二氯甲烷)2×6.5ml共沸蒸发两次。向干燥的反应物中加入二氯甲烷(4.6ml)和二异丙基乙基胺(1.87ml，8.59mmol)。搅拌此悬浮液直至它澄清。然后，向溶液中加入2-氰基乙基N，N-二异丙基氯氨基磷酸酯(0.62ml，3.24mmol)。所得溶液搅拌65分钟。将反应混合物用45ml乙酸乙酯和2.2ml三乙胺稀释，依次用10％碳酸钠水溶液(2×30ml)，饱和碳酸钠溶液(2×30ml)，和饱和氯化钠溶液(2×30ml)萃取。在真空浓缩有机相。所得产物用硅胶色谱纯化，使用溶剂系统为(二氯甲烷/乙醚/三乙胺90∶7.5∶1)。收集Rf＝0.73的部分，并将所得物在真空浓缩得到固体。产量1.06g(1.41mmole，64％)。
实施例4
含有非核苷的香豆素官能度的寡脱氧核苷酸的制备
使用上述实施例3制备的试剂，用DNA合成的β-氰基乙基磷酰胺方法制备寡核苷酸，所制备的寡核苷酸等同于人乳头瘤病毒16型的一个片断，它含有E6基因的397-417核苷，其中第20个碱基(腺嘌呤)被3-(7-香豆素基甲基)甘油取代。
装配完毕后，用3ml 30％NH4OH在室温处理1.5小时将寡核苷酸从固体载体上切除。将氨溶液加热至55℃保持1.5小时。冷却后。真空除去NH4OH。使用反相高效液相色谱纯化粗品寡核苷酸至均一物质。
将寡核苷酸与互补的5′-32P-标记的靶寡核苷酸在0.75M NaCl缓冲液(20μl)中，40℃杂交(探针/靶的摩尔比＝10∶1)1小时。此时，此溶液用302nm波长的光照射10分钟。使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析照射的混合物表明，相对于放射性标记的靶所得光化学交联水平是80％。使用类似的含有一个Saba等，在美国专利No.5,082,934中描述的核苷的香豆素衍生物的寡核苷酸平行地进行对比试验。这些试剂所得的最佳的交联效果是60％。因此，本发明化合物进行的光化学交联具有高于20％的效率(大于对比效率1/3)。
实施例5
按照前面实施例1，2和3的类似方法，合成了具有下式结构的产物。
此化合物用于制备含非核苷补骨脂素衍生物的寡脱氧核苷酸。
实施例6
使用上述实施例3制备的试剂，用DNA合成的β-氰基乙基氨基磷酸酯方法制备寡核苷酸，所制备的寡核苷酸等同于人乳头瘤病毒16型的基因组的一个片断。此寡核苷酸分别互补于E6基因的89-108和283-302核苷酸(此序列作为参考在此引入)。在每个分子中，正常序列中5′_末端的核苷酸(腺嘌呤)被3-(7-香豆素基甲基)甘油取代。3′_末端带有生物素部分。
平行地，合成另外两个DNA分子。这些寡核苷酸既具有E6基因的89-108核苷也具有283-302核苷酸的互补序列；但是，在这些修饰的寡核苷酸中由Saba等，在美国专利No.5,082,934中描述的核苷的香豆素衍生物代替3-(7-香豆素基甲基)甘油，在2′_-脱氧核糖核苷酸的5′_位使用3′_-O-(N，N-二异丙基氨基磷酸酯)5′_-O-(4，4′_-二甲氧三苯甲基)衍生物，这里称作“Saba化合物”。
装配完毕后，用1ml 30％NH4OH在室温处理1.5小时将4个寡核苷酸从固体载体上切除。将氨溶液加热至55℃保持1.5小时。冷却后，真空除去NH4OH。使用高效液相色谱纯化粗品寡核苷酸至均一物质。
将寡核苷酸与互补的5′_-32P-标记的寡核苷酸在0.75M NaCl缓冲液(20μl)中，在40℃杂交(未标记的寡核苷酸与标记的寡核苷酸的摩尔比＝100∶1)1小时。此时，此溶液用UV-B波长的光(XL 1500UV交联剂，Spectronic，Inc.)照射15分钟。使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后间断频带(excised bands)闪烁计数测定交联的程度(相对于放射性标记的靶)。所得结果列于下表：E6基因序 列位置在寡核苷酸中使用的交 联剂交联反应位点 5′→3′ 交联效率 ％ 89-108 3-(7-香豆素基甲基)甘 油 TTT 64％ 89-108 Saba化合物 TTT 54％ 283-302 3-(7-香豆素基甲基)甘 油 TTT 76％ 283-302 Saba化合物 TTT 68％
上述结果表明，本发明化合物进行的光化学交联比美国专利5,082,934中的化合物更有效(比对比效率高＞10％)。
实施例71-0-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-0-(7-香豆素基)-2-0-(2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯)甘油
本发明的另一方案是使用7-羟基香豆素代替实施例1中的7-溴甲基香豆素合成。合成1-0-(4，4′_-二甲氧三苯甲基)-3-0-(7-香豆素基)-2-0-(2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯)甘油的反应过程如下：
此反应路线与使用7-溴甲基香豆素的路线相比可使用较少的时间完成，且可比使用7-溴甲基香豆素的路线节省约50％的开支。7-羟基香豆素衍生物可被引入寡核苷酸，且与美国专利5,082,934中的化合物相比在寡核苷酸脱保护过程(在室温暴露于浓NH3中)中特别稳定。7-羟基香豆素衍生物(最大λ为325nm)与7-溴甲基香豆素衍生物(最大λ为310nm)相比显示出不同的吸收光谱。7-羟基香豆素衍生物相对于7-溴甲基香豆素衍生物有红移，这可减少终止剂(如核酸)的作用。谱移还使7-羟基香豆素衍生物的激发物有更多的选择。7-缩水甘油基香豆素的合成
反应中间体7-缩水甘油基香豆素是在装备有回流冷凝器的反应烧瓶中制备的，反应瓶中含有16.2g 7-羟基香豆素，15.8g表溴代醇(epibromohydrin)，13.8g碳酸钾和270ml丙酮(“反应溶液”)。使反应溶液沸腾并回流过夜，冷却，用100ml 5％NaOH水溶液处理，用80ml二氯甲烷萃取三次。蒸发溶剂后得到粗品黄色固体。将粗品固体(1.5g)在50℃溶于30ml己烷和20ml丙酮的溶液。然后将己烷/丙酮溶液在0℃冷却2-3小时。过滤收集形成的白色晶体，并干燥成白色粉末。得到290mg白色粉末。此新化合物(7-缩水甘油基香豆素)的熔点为110-112℃。使用8％(v/v)乙酸乙酯/CHCl3进行薄层色谱(TLC)；7-缩水甘油基香豆素的Rf值为0.6。缩水甘油基香豆素的水解
将7-缩水甘油基香豆素(2.0g)溶于80ml丙酮和50ml 1.8M含水H2SO4的溶液中。将此丙酮/酸溶液加热至沸20分钟。冷却此溶液，并用1.6MNH4OH水溶液中和达到pH7-8。此中和的溶液用50ml乙酸乙酯萃取三次。蒸发溶剂后，得到产物7-(1-0-甘油基氧)香豆素，熔点为118-120℃。1-0-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-0-(7-香豆素基)甘油的合成
使用旋转蒸发将香豆素基甘油(1.37g)和11ml纯吡啶三次共蒸发。将共蒸发过的香豆素基甘油加入44mg 4-二甲基氨基吡啶，330μl三乙胺，45ml吡啶和1.78g二甲氧三苯甲基氯。将溶液在室温搅拌3小时。加入66ml去离子水终止反应。反应溶液用35ml二氯甲烷萃取3次。有机相用硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到粗产物，使用硅胶柱色谱纯化，用70％己烷，28％丙酮和2％三乙胺溶液洗脱。得到2.6g纯的产物(1-0-(4，4′_-二甲氧三苯甲基)-3-0-(7-香豆素基)甘油)，得到单一TLC点，使用相同的溶剂系统Rf值为0.43。1-0-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-0-(7-香豆素基)-2-0-(2-氰乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯)甘油的合成
将1-0-(4，4′_-二甲氧三苯甲基)-3-0-(7-香豆素基)甘油(2.5g)与12ml 75％吡啶和25％二氯甲烷2次共蒸发。将5ml二氯甲烷溶液和5ml吡啶加入干燥粘稠液体(二氯甲烷/香豆素溶液)。将二氯甲烷/香豆素溶液在氩气氛围下加入含有3ml二异丙基乙基胺，10ml二氯甲烷和1.8g 2-氰乙基N，N-二异丙基氯代氨基磷酸酯溶液的50ml烧瓶中。将此溶液搅拌90分钟。将反应混合物用60ml乙酸乙酯和3ml三乙胺溶液稀释。反应混合物用50ml饱和氯化钠水溶液萃取2次。有机相用硫酸钠干燥。粗产物用硅胶柱色谱纯化。得到2.6g纯产物，TLC得到单一点，使用80％己烷和20％丙酮作洗脱剂，Rf值为0.2。
实施例8
使用上述实施例7制备的试剂，用DNA合成的β-氰基乙基氨基磷酸酯方法制备寡核苷酸，所制备的寡核苷酸等同于Chlamydia trachomatis的隐性质粒。此寡核苷酸互补于隐性质粒876-900，6857-6878，7118-7140，和6725-6752核苷(此序列作为参考在此引入)。前两个寡核苷酸在每个寡核苷酸中，含有一个交联化合物，后两个寡核苷酸在每个寡核苷酸中含有两个交联化合物。
自动合成后，用3ml 30％NH4OH在室温处理2小时将寡核苷酸从固体载体上切除并脱保护。真空除去NH4OH，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化粗品寡核苷酸至均一物质。
将寡核苷酸与互补的5′_-32P-标记的寡核苷酸在0.75M NaCl缓冲液(195μl)中，在40℃杂交(未标记的寡核苷酸与标记的寡核苷酸的摩尔比＝100∶1)20分钟。此时，此溶液用UV-A波长的光(8W灯)照射20分钟。使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用间断频带(excised bands)闪烁计数键测定交联的程度(相对于放射性标记的寡核苷酸)。所得结果列于下表： Chlamydia trachomatis 隐性质粒 在寡核苷酸中交联剂的数 交联反应位点 5′_→3′_交联效率 ％ 876-900 1 TAA 88 6857-6878 1 TTT 86 7118-7140 2 TTT，TAT 99 6725-6752 2 TAC，TTT 98
上述结果表明，本发明化合物进行的光化学交联比美国专利5,082,934中的化合物更有效。
实施例9
可合成含有不同侧链的香豆素衍生物，包括，(1)短侧链，如甘油，(2)长侧链，如聚乙二醇，(3)芳香环，和(4)脂环环，如亚乙基二氧环(ethylene-dioxy ring)。这些香豆素衍生物可从适当的香豆素起始物，如，7-甲基香豆素，7-羟基香豆素，七叶亭(6，7-二羟基香豆素)或7-缩水甘油基香豆素合成得到。连接到每个香豆素起始物上的是所需含活性功能基的侧链。
制备含有脂肪族杂环的香豆素衍生物的反应过程1-0-[2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯]-2，3-0-(6，7-二香豆素基)甘油
此化合物虽本身不是上述通式化合物中的化合物，但它是可用于制备这样的化合物的中间体，此化合物是通过X和/或B单元前体与被在反应过程最后步骤中形成氨基磷酸酯(phosphoramidite)活化的羟基反应形成的。试剂(a)碳酸钾/丙酮(b)氢氧化钾(c)2-氰基乙基N，N-二异丙基氯氨基磷酸酯/二异丙基乙基胺/吡啶*以下二化合物的混和物
反应在步骤(a)使用2，3-二溴-1，4-二羟基丁烷代替表溴代醇得到类似的化合物2，3-0-(6，7-香豆素基)-1，2，3，4-四羟基丁烷；它可转化为如下式所示的1-0-0-(4，4′_-二甲氧三苯甲基)-4-O-(β-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯)-2，3-0，0-(6，7-香豆素基)-1，2，3，4-四羟基丁烷。6，7-(羟甲基亚乙基二氧)香豆素的制备(步骤AI&AII)
将七叶亭(0.9g)与碳酸钾(1.40g)和200ml无水丙酮的溶液在室温搅拌1小时。向溶液中加入表溴醇(1.05g)。将黄色悬浮液回流过夜。然后加入氢氧化钾(0.7g)并回流1小时。离心除去固体，将溶液通过水泵蒸发。所得产物溶于50ml水中。水溶液用35ml二氯甲烷萃取三次。有机溶液用50ml 2M的氢氧化钠萃取两次。所得有机相用硫酸钠干燥。蒸发溶剂后，得到200mg白色固体。TLC在50％丙酮/己烷中显示Rf为0.42。产率26％(重量)。脂肪族杂环衍生物的制备(步骤AIII)
6，7-(羟甲基亚乙基二氧)香豆素(200mg)与1ml干燥吡啶两次共蒸发。向干燥的反应剂中加入0.9ml二氯甲烷和0.9ml吡啶。将2-氰基乙基-N，N-二异丙基氯氨基磷酸酯(phosphoramidit)(280mg)溶于0.2ml二异丙基乙基胺和0.9ml二氯甲烷的溶液中。将氨基磷酸酯溶液加入香豆素溶液。所得溶液在室温搅拌2小时。将反应混和物用10ml乙酸乙酯和0.5ml三乙胺的溶液稀释。溶液用6ml饱和氯化钠溶液萃取三次。蒸发溶剂后，所得产物用硅胶柱色谱纯化，使用丙酮/己烷/三乙胺＝36/60/4洗脱。得到纯产物(100mg)，具有Rf＝0.57(在TLC中使用相同的洗脱剂)。制备连接到芳香侧链的香豆素的反应过程3-0-(7-香豆素基甲氧)-1-0-[2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯]-1，3-二羟基苯试剂(a)2-氰基乙基-N，N-二异丙基氯氨基磷酸酯，二异丙基乙基胺/吡啶/二氯甲烷。7-溴甲基香豆素的制备(步骤BI)
在1升烧瓶中，向140ml氯仿中加入7-甲基香豆素(28g)，70％过氧化苯甲酰(1.68g)，和N-溴代琥珀酰亚胺(30.8g)，并将悬浮液回流过夜。将溶液用100ml氯仿稀释。所得粗产物从750ml丙酮中重结晶。得到白色固体(21g)，具有熔点172-176℃。3-0-(7-香豆素基甲基)-1，3-二羟基苯的制备(步骤BII)
向间苯二酚(2.25g)，碳酸钾(1.75g)和丙酮(200ml)的悬浮液中加入7-溴甲基香豆素(0.7g)。将溶液加热并搅拌4小时。将溶液中的固体去除。蒸发溶剂后，将粗产物溶于40ml二氯甲烷。有机溶液用40ml水萃取三次。TLC使用20％(v/v)乙酸乙酯/氯仿，得到Rf＝0.32。蒸发溶剂后，产物从CH2Cl2/乙酸乙酯溶液中重结晶；得到300mg纯产物。3-0-(7-香豆素基甲氧)-1-0-[2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯]-1，3-二羟基苯的制备(步骤BIII)
使2-氰基乙基N，N-二异丙基氯氨基磷酸酯与步骤BII的产物按照步骤AIII基本相同的方式反应。制备含有长侧链香豆素的反应过程3-0-(7-香豆素基)-2-0-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯)-1-0-(2-[2-(4，4′-二甲氧三苯甲基氧)乙氧]乙基)甘油试剂(a)碳酸钾/丙酮(b)氢氧化钠/乙二醇二甲醚(c)4，4′_-二甲氧三苯甲基氯/吡啶(d)2-氰基乙基N，N-二异丙基氯氨基磷酸酯，二异丙基乙基胺/二氯甲烷7-缩水甘油基香豆素的制备(步骤CI)
此化合物按照实施例6的描述制备。3-0-(7-香豆素基)-1-0-(2-[2-羟基乙氧]乙基)甘油的制备(步骤CII)
将7-缩水甘油基香豆素(1g)溶于10mg氢氧化钠，2.65g二甘醇和5ml乙二醇二甲醚的溶液中。将溶液加热至回流6小时。反应混合物用10ml去离子水稀释，并用10ml二氯甲烷萃取三次。有机相用硫酸钠干燥。蒸发溶剂后，粗产物用硅胶柱色谱纯化，用50％(v/v)丙酮/己烷洗脱。得到主要产物具有Rf0.09(260mg)，且少量产物具有Rf0.34(50mg)(TLC溶剂50％(v/v)己烷/丙酮)。3-0-(7-香豆素基)-1-0-(2-[4，4′-二甲氧三苯甲基氧)乙氧]乙基)甘油的制备(步骤CIII)
将步骤CII得到的二羟基香豆素衍生物(230mg)与干燥吡啶共蒸发。向香豆素衍生物中加入二甲氧三苯甲基氯(320mg)，60ml三乙胺和10mg 4-二甲基氨基吡啶。将溶液在室温搅拌16小时。溶液用水稀释，用二氯甲烷萃取，然后用硫酸钠干燥。蒸发溶剂后，粗产物用硅胶柱色谱纯化，以40％(v/v)丙酮/己烷作为洗脱剂。3-0-(7-香豆素基)-2-0-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基磷酸酯)-1-0-(2-[2-(4，4′-二甲氧三苯甲基氧)乙氧]乙基)甘油的制备(步骤CIV)
使2-氰基乙基-N，N-二异丙基氯氨基磷酸酯与步骤CIII的产物按照上述步骤AIII的方法反应。制备在步骤AIII，BIII和CIV中使用的氨基磷酸酯
制备氨基磷酸酯的一般方法如下。在惰性气体氛围中，在加盖隔膜的玻璃容器中，将1.2eq的2-氰基乙基-N，N-二异丙基氯氨基磷酸酯和2.4eq的N，N-二异丙基乙基胺溶于0.9ml二氯甲烷。将香豆素前体(1.0eq)(如步骤AII，BII或CIII的产物)溶于9.9ml吡啶和0.9ml二氯甲烷。在搅拌氯氨基磷酸酯溶液的条件下，加入香豆素溶液。再搅拌2小时。加入乙酸乙酯，有机溶液用NaCl(水溶液)洗涤三次并用Na2SO4干燥。除去溶剂，粗产物用柱色谱纯化，使用丙酮/己烷/三乙胺(36∶60∶4)。收集适当的部分并在真空浓缩。
本发明已被详细描述，应理解本领域普通技术人员可根据其进行许多修改和变化而不脱离本发明的权利要求的精神和范围。
说明书中提到的所有公开出版物和专利申请在此引作参考，与每个公开出版物或专利申请被具体分别的指出被引作参考相同。