分离棒酸及其药学上可接受的盐的新方法 技术领域(IPC C12P 17/18，C07D 498/04)
本发明属于制药工业领域，涉及从Streptomyces sp.p6621 FERM P2804的发酵肉汤中分离棒酸及其药学上可接受的盐的新的改进方法。
技术问题
人们始终寻求从产棒酸微生物得到的发酵肉汤中分离制备纯棒酸及其药学上可接受的盐(如棒酸钾)的新的改进方法，在该方法中可避免繁杂的常规分离方法和所需产物的色谱提纯法。现有技术
棒酸是下式所示(2R，5R，Z)-3-(2-羟基亚乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂二环〔3.2.0〕庚烷-2-羧酸的俗名，其碱金属盐和酯是活性β-内酰胺酶抑制剂，这种酶是由某些G+或G-微生物产生的。
除了抑制β-内酰胺酶的作用之外，棒酸及其碱金属盐与青霉素类和头孢菌素类β-内酰胺类抗生素合用还具有协同作用。因此，棒酸及其盐被用在盖仑派医学制剂中以预防内酰胺类抗生素的失活。市售制剂含较稳定的棒酸的钾盐(酸单独是相当不稳定地)和阿莫西林三水合物。
通过产棒酸微生物的发酵制备棒酸。这些微生物是属于不同的链霉菌属菌株的各种微生物，如S.clavuligerus NRRL 3585，S.iumoninensis NRRL5741，S.katsurahamanus IFO 13716和Streptomyces sp.P 6621 FERM P2804。
发酵后得到的水性培养基肉汤可按常规方法提纯和浓缩，例如，在用有机溶剂萃取水溶液以得到不纯的棒酸在有机溶剂中的溶液前，如GB1,508,977所述，进行过滤和色谱提纯。
GB1,508,977特别教导，通过将经过滤的肉汤中有棒酸阴离子吸附在阴离子交换树脂上并用电解质从中洗脱下来，将形成的溶液脱盐，然后除去溶剂，从而可得到棒酸的盐。此方法可用来获得可接受量的所需物质，但是它需要用色谱法进行繁杂的提纯，树脂柱的使用需要重要的投资，这限制了大规模的生产操作。
GB1,543,563公开了一种使用S.clavuligerus NRRL3585菌株的改良的发酵法，其中培养基的pH值维持在6.3和6.7之间的范围内，从而所需产物的产量增加。通过从棒酸锂再成盐制得棒酸钾等棒酸的盐，从而所需化合物也被纯化了。
EP-A-0026044阐述了棒酸叔丁胺盐作为有用的中间体在棒酸制备中的应用。此盐在BE86221中已为人知，但仅作为药物配方中的一种成分。
EP-B-0182522公开了一种用微生物S.clavuligerus的发酵制备棒酸的方法。通过在该方法的进程中连续地或间断地加碳源(如甘油)到发酵培养基中来获得方法的重要改进，而非常重要的是将碳水平维持在足够低的浓度，即低于0.5％(w/v)且不能超过2％。实施例阐述了发酵过程中加入碳源时观察到棒酸产量增加的基本改进，阐述了160小时后发酵肉汤中棒酸的浓度为约1400μg/ml，这是对以前方法的重要改进。
进一步的改进是棒酸以锂盐形式从溶液中提纯的新方法。但是，为了获得较高纯度的棒酸锂，加入了另一种锂盐(如氯化锂)的浓溶液。用上述文献中已知的方法，可将所得到的重结晶棒酸锂进一步提纯，然后可任意地转变为其它盐，如棒酸钾。
用已知的方法，例如离心或过滤，附去菌丝体、蛋白质和其他固体，离心或过滤前用选择的凝聚剂对发酵肉汤进行可能的前处理，使菌丝体凝聚，过滤可能更容易。过滤后的发酵肉汤用离子交换树脂或通过丙酮之类溶剂沉淀，进行进一步处理，以便除去蛋白质，重复离心和过滤，分离沉淀。原存在于发酵肉汤悬浮液中的菌丝体、蛋白质和其它伴随的颗粒的这种分离方法是费时的，需要几道工序。
在公开的EP-A-0385552和EP-A-0387178中所揭示的方法中，避免了除去菌丝体、蛋白质和其它悬浮颗粒，接着从所得的透明发酵肉汤中分离以及制备纯的棒酸及其盐的这些费时的方法。
整个方法包括三步，即：提纯菌丝体、蛋白质和其它固体颗粒的发酵肉汤；用伯胺、仲胺或叔胺形成稳定的棒酸的中间体盐，从Streptomyces clavuligerus肉汤的纯化滤液中提纯以不纯物形式存在的棒酸，从而分出了棒酸中所伴随的大部分杂质；最后一步，将棒酸的中间体胺盐(85％纯度)转变为所需的碱金属盐，如棒酸钾。
在EP-A-0385552中，第一步揭示得更详细，其中，用凝聚——絮凝物理化学方法，从微生物Streptomyces clavuligerus发酵所得的水性培养基肉汤中除去菌丝体、蛋白质和其它固体颗粒。在此方法中得到的絮状物足够大，足够紧密，从而可能做到容易沉降和分离，用滚动筛可获得最好的分离。这样即获得透明的肉汤，它还可任选地用反渗透加以浓缩。
以这样的方法得到纯化的发酵肉汤，避免了诸如离心、活性炭吸附、与共佐剂一起过滤等常规的提纯方法。
在所有已知方法中，还必须，不同于所公开的絮凝方法，用各种去蛋白质和离子交换方法处理经提纯的培养物肉汤，这引起所需物质最终产量明显的总丢失。与公知的方法相反，絮凝方法中总产量为85-95％。
所公开的从Streptomyces clavuligerus发酵肉汤凝聚——絮凝的方法基于如下方面：将无机电解质加到肉汤培养物中以增加凝聚作用；在搅拌下，在培养基pH值为6-8之间的条件下，应用该无机凝集剂作为凝聚过程的引发剂；在絮凝开始时加入有机电解质；然后用滚动筛或过滤法从发酵肉汤分离所得的絮状物；当絮凝作用发生在水不混溶性溶剂中时，可任选地滗析两相，分离絮状物；及可任选地用反渗透或蒸发来浓缩液体。
EP-A-0562583公开了在含棒酸的发酵后形成的水性培养物肉汤进行溶剂萃取后得到的乙酸乙酯萃取物中，用棒酸和有机二胺的盐，如二棒酸N，N′-二异丙基亚乙基二铵，作为有用的中间体，分离和制备纯的棒酸或其碱金属盐，如棒酸钾。
技术方案
本发明的目的是改进从产棒酸微生物，如Streptomyces sp.P6621 FERMP2804，所得的发酵肉汤中分离棒酸的方法，其中避免了除去存在于水性培养物肉汤的菌丝体、蛋白质和其它悬浮固体颗粒的费时的常规方法，然后制备高纯度盐，如棒酸钾。
按本发明的合适的盐为药学上可接受的碱金属和碱土金属盐，如钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。在这些盐中，钠盐和钾盐，特别是钾盐，最为合适。
本发明对于借助产棒酸微生物所得发酵肉汤的提纯通常是有用的。
从上面的现有技术中显然看出，已知的方法包括费时的分离方法，仅EP-A-0385552公开了一种改进的方法，其中得到完全透明的肉汤。但是，该方法的缺点是：为了达到所需目的，必须使用几种试剂，如无机电解质，凝聚剂和有机聚电解质；发酵肉汤的沉降或过滤需要比较长的生产时间，这影响到所需产物的纯度。
在第2页第二栏第22-35行，给出了提纯发酵肉汤的一些可能性，但所述方法导致棒酸产量明显降低，还进一步阐述了在分离和提纯过程中几种复杂的技术(如超滤和反渗透)的使用，不能简化方法，因为那些方法的使用需要在活性炭或离子树脂上的前过滤。
与这些陈述相反，当按照本发明使用微量过滤法时，其中菌丝体、大部分蛋白质(存在于肉汤中的至少80％)和其它悬浮颗粒被除去，令人惊奇地发现，能避免使用EP-A-0385552所公开的方法中使用的几种试剂及该文献中所公开的提纯水性发酵肉汤的其它费时的方法。
本发明恰当地使用连续微量过滤多级装置，使分离菌丝体和水滤液的过程能在少于半小时的停顿时间内进行，该装置包括几个(5个)顺序连接的独立的部分(过滤圈)。每个部分有其自己的循环泵，使发酵肉汤以所需的速度(5-8米/秒)通过孔径0.05μm的陶瓷滤心的通道。在约20℃和40℃之间的温度(不应超过40℃)下发生的微量过滤过程中，切向速度调节成能在固体部分保留住分子量超过30,000的分子。这样，我们成功地除去了存在的蛋白质的约80-90％。微量过滤方法中分离出的菌丝体再用水洗，以便增加合并的滤液中棒酸的产量。用本发明的所公开的通过微量过滤提纯水性发酵肉汤的方法，在提纯的水相中保留了95％以上棒酸，这甚至超过了EP-A-0385552絮凝方法的结果，代表了本发明的进一步改进。
微量过滤后，滤液可任选地用超滤法提纯。该提纯的目的是分离剩下的大部分蛋白质杂质和分子量高于棒酸的其它伴随的杂质。这样，成功地除去不需要的杂质，这些杂质在用与水不相混的有机溶剂提取时可沉淀出来，从而，用微量过滤法提纯后得到的水滤液的颜色大大减少，所需产品的纯度进一步改善。
在超滤装置中使用了具有约20,000道尔顿(在10,000-30,000道尔顿之间)的高分辨率聚合物膜。该过程是连续进行的，以使停顿时间尽可能短，有两个以上顺序连接的超滤装置(增加杂质和棒酸的分离选择性)；通过加入纯的洗涤水及逆流输送超滤过程中得到的保留物(水相)，水相中棒酸的丢失降低到少于5％。
然后，将合并的水滤液在反渗透装置中在大致室温的温度下浓缩至原体积的1/5，以得到不纯的棒酸的浓缩水相，然后，在通过加硫酸等无机酸调节pH范围在1-3之间的酸性介质中，用与水不相混溶的有机溶剂(如乙酸乙酯)，在15-25℃温度下直接萃取所得到的浓缩液(保留物)(萃取也可在低于15℃的温度下进行)。除了乙酸乙酯外，也可用其它与水不相混溶的有机溶剂，如乙酸甲酯、甲基异丁基酮或正丁醇。
因为采用微量过滤法，我们成功地除去了菌丝体和所存在的大部分蛋白质，不采用上述文献中公开的已知方法中所用的费时的提纯方法，而用与水不相混溶的合适的有机溶剂(如乙酸乙酯)直接萃取经提纯的和浓缩的水性发酵肉汤是可能的，并且避免了提纯发酵肉汤的凝聚——絮凝方法中所采用的外加的试剂。因此，除了上述改进外，本发明的方法还降低了肉汤提纯方法的成本。在将不纯的棒酸从水相萃取进有机相的过程中，为了避免因与有机溶剂或硫酸相互作用而使水相浓缩物中剩余蛋白质变性，最好在一系列离心抽提器中进行萃取，在其中一个离心抽提器中，即在自动出料离心分离器中，分离出的蛋白即时、连续地被除去。
在所得的不纯棒酸水不互溶有机溶剂提取物中，也可能存在水溶性杂质，如棒酸的各种分解产物，它们比单单棒酸极性大，因此通过用水洗涤合并的有机相来除去水溶性杂质。这样即得到棒酸在有机相(如乙酸乙酯)中的纯提取物。
如我们的EP-A-0562583方法中所揭示的那样，可从有机相中分离出棒酸并加以提纯。如该专利申请所描述的分离棒酸的最好方法是这样的：在大致室温的温度下，将棒酸的乙酸乙酯提取物与N，N′-二异丙基亚乙基二胺反应，接着，在室温下，在异丙醇水溶液中用2-乙基己酸钾转化所得的中间体二棒酸N，N′-二异丙基亚乙基二铵，得到棒酸钾，它以高纯度分离出来。
现已发现，中间体二棒酸N，N′-二异丙基亚乙基二铵的制备最好这样进行：与水不混溶的有机相(如棒酸的乙酸乙酯提取液)和N，N′-二异丙基亚乙基二胺之间的反应采用有机相，其中水已完全被除去，因为少量水即可干扰中间体盐的制备，因为分出的盐溶解在有机相中存在的水中，并可得到沥青样副产物，使干燥更困难。
如果从有机相中完全除去了水，有机相即提取物的稳定性增加，因为众所周知，在提取过程中棒酸在水溶液和酸性pH介质中的稳定性很差。因此，为了干燥有机相，如棒酸的乙酸乙酯提取液，采用真空精馏塔(分馏的要素)干燥，因为中间体盐在较高温度下稳定性差。本方法的一个基本特征是有机相(如乙酸乙酯)与水形成沸点最小的共沸物，因此在所公开的方法中，有机相(如乙酸乙酯)提取液被完全干燥。从而，有机相(如乙酸乙酯提取液)含水量总是低于0.1体积％，平均为0.03-0.05体积％。然后，在很短的停顿时间内，完全无水的有机相(如棒酸的乙酸乙酯提取液)被蒸发浓缩成原来体积的1/20，接着与N，N′-二异丙基亚乙基二胺反应。
二棒酸N，N′-二异丙基亚乙基二铵继而与2-乙基己酸钾反应生成高纯度棒酸钾，可按我们的EP-A-0562583中所揭示的来进行，最好按实施例中揭示的、用具有上述改进的方法来进行。
本发明以如下实施例加以阐述，但决不受其限制。
实施例1
含不纯棒酸的乙酸乙酯提取物浓缩液的连续制备
在搅拌和冷却下，在含33％硫酸水溶液(5升)的容器(容量50M3)中加入微生物Streptomyces sp.P 6621 FERM P2804发酵所得的水性发酵肉汤(10,000升)(棒酸浓度计为3580mg/l)，使介质的pH值维持在5.8和6.2之间。然后，以1200升/小时的流速将肉汤连续加到微量过滤装置中，该装置包括5个顺序连接的部分。每个部分有其自己的循环泵，使发酵肉汤通过孔径0.05μm的陶瓷滤心通道的速度为8米/秒。用微量过滤法(注意温度不超过40℃)，除去了菌丝体及大部分蛋白质和其它悬浮固体颗粒。
分出的固体用流速300升/小时的水洗涤，然后，以1500升/小时流速将合并的发酵后滤液(渗透液)连续加入反渗透装置，渗透液在其中浓缩成原体积的1/5。
向以300升/小时流速反渗透后得到的浓缩液(保留物)中，加入33％硫酸水溶液(4升/小时)，使介质的pH维持在1.5和2.0之间，然后在一系列5个离心抽提器中，以900升/小时流速加入乙酸乙酯，室温下逆流抽提酸性保留物，其中，在第二个自动出料离心分离器中，仍存留的分离的蛋白质被同时除去。
从离心抽提器系列中得到的乙酸乙酯提取液合并后，在第一离心抽提器中用30升/小时流速的软化水洗涤，从而除去仍存留的水溶性杂质。
将流速为900升/小时的乙酸乙酯提取液在精馏塔中在30℃温度下真空干燥，使水含量达到0.03体积％，然后将提取液在薄层蒸发器中在30℃温度下真空蒸发至原体积的1/20。所得的流速为45升/小时的乙酸乙酯浓提取液(不纯棒酸的浓度为50克/升)通过连续加入活性炭(0.45克)进行脱色，将混合物搅拌30分钟，然后在1巴氮气压下加压过滤，从乙酸乙酯浓缩液的悬浮液中滤去炭，得到含不纯棒酸的乙酸乙酯提取液的干燥浓缩液(45升)。
实施例2
二棒酸N，N′-二异丙基亚乙基二铵的制备
在25℃温度和剧烈搅拌下，向实施例1的连续过程中所得到的乙酸乙酯提取液的干燥浓缩液(45升)(棒酸含量为50克/升)中，经5分钟加入N，N′-二异丙基亚乙基二铵(1.4升)，将所得悬浮液过滤，所得结晶再悬浮于丙酮(45升)中，搅拌，并将悬浮液冷却于10℃以下，分离所需物质的结晶，过滤，用丙酮洗涤，30℃真空干燥，得到二棒酸N，N′-二异丙基亚乙基二铵(3.3公斤，棒酸含量为60％)。
实施例3
棒酸钾的制备
将从实施例2得到的二棒酸N，N′-二异丙基亚乙基二铵(3.3公斤)溶于异丙醇/水混合液(82.5升，水的比例为1.5％)，在搅拌和室温下，经30分钟向所得的溶液中加入活性炭(1.5公斤)和2-乙基己酸钾(0.5升，2M)。然后滤去炭和所得的沉淀。在室温下，经20分钟边搅拌边向所得滤液(80升)中加入2-乙基己酸钾(2M)异丙醇溶液(6升)。然后，在冷却至0-5℃温度下将所得悬浮液再搅拌2小时，然后将分离出的结晶过滤，用异丙醇和丙酮洗涤，30℃真空干燥。得到棒酸钾(2公斤，USP级，用HPLC法测得棒酸含量80.6％)。