尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RTPCR检测试剂及其制备方法与用途.pdf

本发明公开了一种尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途，设计合成了二套分别针对尼帕病毒M基因和猪流感M病毒基因的特异性的引物及Taqman探针和阳性对照，并利用这二套引物及探针建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的二重荧光RT-PCR检测体系，可在3～4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地同时检出尼帕病毒和猪流感病毒核酸，可用于同时检测家猪及其相关样本中微量的尼帕病毒和猪流感病毒的核酸。

1.  一种尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂，其特征在于，包括用于分别检测尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的二对特异性引物、二条特异性探针和二个阳性对照，扩增目标长度分别为79bp和80bp，引物和探针序列为：
尼帕病毒:
上游引物：NIPHA-M-F:5’-GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3’ SEQ ID NO.1
下游引物：NIPHA-M-R：5’-AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3’ SEQ ID NO.2
探针：NIPHA-M-P:5’-FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3’-MGB SEQ ID NO.3
阳性对照：NIPHA-M:GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTCATTGACAATACAGGGAG SEQ ID NO.4
猪流感病毒:
上游引物：SIV-M-F:5’-CGGTCTCACAGACAGATGGCTAC-3’ SEQ ID NO.9
下游引物：SIV-M-R：5’-GTGCTAGCCAACACCATTCTG-3’ SEQ ID NO.10
探针：SIV-M-P:5’-VIC-ACCACCAATCCACTAATCAGGCA-3’-MGB SEQ ID NO.11
猪流感病毒M基因阳性对照序列：CTGATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCTACTACCACCAATCCACTAATCAGGCATGAGAACAGAATGGTGTTGGCTAGCACTACGGCA SEQ ID NO.12。

2.  如利要求1所述的尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择尼帕病毒M基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为：
GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTCATTGACAATACAGGGAG；
(2)选择猪流感病毒M基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，为：
CTGATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCTACTACCACCAATCCACTAATCAGGCATGAGAACAGAATGGTGTTGGCTAGCACTACGGCA；
(3)设计4条引物，以之PCR扩增和制备尼帕病毒M基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8如下：
NIPHA-F1:5’-CCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCC-3’
NIPHA-R1:5’-GGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTGCTACTCGGCTGATCTCACAACTGTTGTTCCAGG-3’
NIPHA-F2:5’-GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATC-3’
NIPHA-R2:5’-GAAGACATCATCATAGATCATGAACTCTCTTGGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTG-3’
(4)设计4条引物，以之PCR扩增和制备猪流感病毒M基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.16，如下：
SIM-M-F1:5’-CTGATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCTACTA-3’
SIM-M-R1:5’-TGCCGTAGTGCTAGCCAACACCATTCTGTTCTCATGCCTG-3’
SIV-M-F2:5’-CACAGACAGATGGCTACTACCACCAATCCACTAATCAGGCATGAGAACAGAATGGT-3’
SIM-M-R2:5’-ACCATTCTGTTCTCATGCCTGATTAGTGGATTGGTGGTAGTAGCCATCTGTCTGTG-3’
(5)分别根据尼帕病毒M基因阳性对照序列和猪流感病毒M基因阳性对照序列设计多对引物和多条探针,经过大量的对比筛选试验，确定最适的引物对和标记探针组合：
尼帕病毒:
上游引物：NIPHA-M-F:5’-GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3’ SEQ ID NO.1
下游引物：NIPHA-M-R：5’-AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3’ SEQ ID NO.2
探针：NIPHA-M-P:5’-FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3’-MGB SEQ ID NO.3
猪流感病毒:
上游引物：SIV-M-F:5’-CGGTCTCACAGACAGATGGCTAC-3’ SEQ ID NO.9
下游引物：SIV-M-R：5’-GTGCTAGCCAACACCATTCTG-3’ SEQ ID NO.10
探针：SIV-M-P:5’-VIC-ACCACCAATCCACTAATCAGGCA-3’-MGB SEQ ID NO.11
(6)检测尼帕病毒M基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；检测猪流感病毒M基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；
(7)经过大量的对比试验和反应条件优选，确定二重荧光RT-PCR最适的反应条件、引物及探针的特异性和灵敏度。

3.  根据权利要求2所述的尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂，其特征在于，所述(5)中的最适的反应条件为检测尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的上、下游引物使用浓度均为15pmol/μL，探针的使用浓度均为5pmol/μL，在25μL体系中均加入0.5μL的引物及探针，引物及探针的特异性使其区别于猪源其它病毒，检测尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的灵敏度分别达到46个拷贝～58个拷贝。

4.  如权利要求1所述的尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂在生产标准化试剂盒中的应用。

5.  如权利要求1所述的尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂在绘制尼帕病毒和猪流感病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途。

尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途。
背景技术
尼帕病毒是一种严重危害人和猪只健康的人畜共患病—尼帕病的病原体，临床表现以神经系统和呼吸系统疾病为特征，不同年龄的猪临床症状也有所不同。人主要通过创口与感染猪的分泌物、排泄物直接接触而感染，也可通过空气而感染，导致发病死亡。因此，尼帕病毒感染猪是人的尼帕病的重要传染源。猪流感是由A型流感病毒引起猪或人的一种急性、人畜共患呼吸道传染病。由于猪的尼帕病和猪流感在临床表现上相似，仅凭临床症状不易区分，因此对临床疑似发病猪的尼帕病毒和猪流感病毒的鉴别检测，对于及早发现和控制这两种动物疫病，进而防止人的尼帕病和流感的发生及流行具有重要的应用价值。多重荧光RT-PCR方法可同时检测多种病原核酸，具有一次RT-PCR反应就能简便、快速地鉴别和检测多种病原的优点，能够同时满足多种疾病诊断的要求。目前检测单一尼帕病毒和猪流感病毒的荧光RT-PCR方法和公开专利均有报道，而能够同时检测尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光定量RT-PCR检测试剂及其制备方法与应用，还罕见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途，具体涉及一种分别以尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因为扩增靶序列而研制的检测试剂，该检测试剂包括二对引物、二条标记探针和二个阳性对照。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是通过以下步骤实现的：一种尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂，包括用于分别检测尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的二对特异性引物、二条特异性探针和二个阳性对照，扩增目标长度分别为79bp和80bp，引物和探针序列为：
尼帕病毒:
上游引物：NIPHA-M-F:5’-GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3’            SEQ ID NO.1
下游引物：NIPHA-M-R：5’-AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3’              SEQ ID NO.2
探针：NIPHA-M-P:5’-FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3’-MGB            SEQ ID NO.3
阳性对照：NIPHA-M:GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTCATTGAC AATACAGGGAG                                             SEQ ID NO.4
猪流感病毒:
上游引物：SIV-M-F:5’-CGGTCTCACAGACAGATGGCTAC-3’       SEQ ID NO.9
下游引物：SIV-M-R：5’-GTGCTAGCCAACACCATTCTG-3’        SEQ ID NO.10
探针：SIV-M-P:5’-VIC-ACCACCAATCCACTAATCAGGCA-3’-MGB   SEQ ID NO.11
猪流感病毒M基因阳性对照序列：CTGATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCTACTACCACCAATCCACTAATCAGGCATGAGAACAGAATGGTGTTGGCTAGCACTACGGCA     SEQ ID NO.12。
上述的尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择尼帕病毒M基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为：
GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTCATTGACAATACAGGGAG；
(2)选择猪流感病毒M基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，为：
CTGATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCTACTACCACCAATCCACTAATCAGGCATGAGAACAGAATGGTGTTGGCTAGCACTACGGCA；
(3)设计4条引物，以之PCR扩增和制备尼帕病毒M基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8如下：
NIPHA-F1:5’-CCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCC-3’
NIPHA-R1:5’-GGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTGCTACTCGGCTGATCTCACAACTGTTGTTCCAGG-3’
NIPHA-F2:5’-GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATC-3’
NIPHA-R2:5’-GAAGACATCATCATAGATCATGAACTCTCTTGGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTG-3’
(4)设计4条引物，以之PCR扩增和制备猪流感病毒M基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.16，如下：
SIM-M-F1:5’-CTGATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCTACTA-3’
SIM-M-R1:5’-TGCCGTAGTGCTAGCCAACACCATTCTGTTCTCATGCCTG-3’
SIV-M-F2:5’-CACAGACAGATGGCTACTACCACCAATCCACTAATCAGGCATGAGAACAGAATGGT-3’
SIM-M-R2:5’-ACCATTCTGTTCTCATGCCTGATTAGTGGATTGGTGGTAGTAGCCATCTGTCTGTG-3’
(5)分别根据尼帕病毒M基因阳性对照序列和猪流感病毒M基因阳性对照序列设计多对引物和多条探针,经过大量的对比筛选试验，确定最适的引物对和标记探针组合：
尼帕病毒:
上游引物：NIPHA-M-F:5’-GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3’          SEQ ID NO.1
下游引物：NIPHA-M-R：5’-AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3’            SEQ ID NO.2
探针：NIPHA-M-P:5’-FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3’-MGB            SEQ ID NO.3
猪流感病毒:
上游引物：SIV-M-F:5’-CGGTCTCACAGACAGATGGCTAC-3’          SEQ ID NO.9
下游引物：SIV-M-R：5’-GTGCTAGCCAACACCATTCTG-3’           SEQ ID NO.10
探针：SIV-M-P:5’-VIC-ACCACCAATCCACTAATCAGGCA-3’-MGB      SEQ ID NO.11
(6)检测尼帕病毒M基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；检测猪流感病毒M基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；
(7)经过大量的对比试验和反应条件优选，确定二重荧光RT-PCR最适的反应条件、引物及探针的特异性和灵敏度。
所述(5)中的最适的反应条件为检测尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的上、下游引物使用浓度均为15pmol/μL，探针的使用浓度均为5pmol/μL，在25μL体系中均加入0.5μL的引物及探针，引物及探针的特异性使其区别于猪源其它病毒，检测尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的灵敏度分别达到46个拷贝～58个拷贝。
所述的尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂在生产标准化试剂盒中的应用。
所述的尼帕病毒和猪流感病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂在绘制尼帕病毒和猪流感病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途。
本发明的有益效果是：(1)具有特异、敏感、准确、快速的特点，可用于同时检测家猪及其相关样本中的微量尼帕病毒和猪流感病毒核酸。(2)本发明中的尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因对照制备方法，既不涉及尼帕病毒和猪流感病毒及其基因组核酸的使用，也不需要人工合成较长的尼帕病毒M基因RNA片段和猪流感病毒M基因RNA片段，具有简便、安全和经济的优势。
附图说明
图1为最适引物对与标记探针对尼帕病毒M基因阳性对照的荧光RT-PCR扩增曲线。
图2为最适引物对与标记探针对尼帕病毒M基因阳性对照的荧光特异性扩增曲线。
图3为对4.6×10⁷～4.6×10¹copies/μL浓度范围内的尼帕病毒M基因阳性对照的荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线。
图4为尼帕病毒M基因的荧光定量RT-PCR标准曲线。
图5为最适引物对与标记探针对猪流感病毒M基因阳性对照的荧光RT-PCR扩增曲线。
图6为最适引物对与标记探针对猪流感病毒M基因的荧光RT-PCR特异性扩增曲线。
图7为对5.8×10⁷～5.8×10¹copies/μL浓度范围内的猪流感病毒M基因阳性对照的荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线。
图8为猪流感病毒M基因的荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细描述。
本发明的尼帕病毒和猪瘟病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途，包括以下步骤。
第一步骤是制备尼帕病毒M基因的阳性对照物质(RNA)，过程包括：
(1)在NCBI网站中，对尼帕病毒M基因序列进行BLAST比对，选择一段保守序列用于尼帕病毒M基因阳性对照制备，如SEQ ID NO.4所示。
(2)基于SEQ ID NO.4序列设计合成4条引物，引物序列如下：
NIPHA-M-F1:5’-CCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCC-3
NIPHA-M-R1:5’-GGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTGCTACTCGGCTGATCTCACAACTGTTGTTCCAGG-3
NIPHA-M-F2:5’-GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATC-3’
NIPHA-M-R2:5’-GAAGACATCATCATAGATCATGAACTCTCTTGGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTG-3’
(3)以两条互补引物作为扩增模板，另外二条与用作模板的引物序列部分重叠的引物作为扩增引物进行常规PCR扩增；
(4)回收、纯化含有SEQ ID NO.4序列的PCR扩增产物，与PCR2.1克隆载体连接，转化至DH5α大肠杆菌基因工程菌，挑取、提取阳性克隆质粒；
(5)对上述纯化的阳性克隆质粒用Bam HⅠ酶切，回收酶切产物，以线性化的阳性克隆质粒DNA为模板，使用DNA体外转录试剂盒进行体外转录，用DNA酶消化DNA模板，提取RNA。
(6)用核酸分析仪进行质量测定，按公式换算成拷贝数，即得已知拷贝数浓度的尼帕病毒M基因阳性对照(RNA)。
以下通过具体的实施方式对本发明进行更加详细的描述。
第二步骤是是制备猪流感病毒M基因阳性对照，过程包括：
(1)在NCBI网站中，对猪流感病毒M基因序列进行BLAST比对，选择一段保守序列用于猪流感病毒M基因阳性对照(RNA)制备，如SEQ ID NO.8所示。
(2)基于SEQ ID NO.12序列设计合成4条引物，引物序列如下：
SIV-M-F1:5-GTGCCTGAGTCCATGAGGGAAGAATATCAGCAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGTTG-3
SIV-M-R1:5-CAACATCCACAGCACTCTGCTGTTCCTGCTGATATTCTTCCCTCATGGACTCAGGCAC-3
SIV-M-F2:5-ATACGGTTTGAAAAGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCTGAGTCCATGAGGGAA-3
SIV-M-R2:5-TTACTCTAGCTCTATGTTGACAAAATGACCATCGTCAACATCCACAGCACTCTGCTG-3
(3)以两条互补引物作为扩增模板，另外二条与用作模板的引物序列部分重叠的引物作为扩增引物进行常规PCR扩增；
(4)回收、纯化含有SEQ ID NO.8序列的PCR扩增产物，与PCR2.1克隆载体连接，转化至DH5α大肠杆菌基因工程菌，挑取、提取阳性克隆质粒；
(5)对上述纯化的阳性克隆质粒用Bam HⅠ酶切，回收酶切产物，以线性化的阳性克隆质粒DNA为模板，使用DNA体外转录试剂盒进行体外转录，用DNA酶消化DNA模板，提取RNA。
(6)用核酸分析仪进行质量测定，按公式换算成拷贝数，即得已知拷贝数浓度的猪流感病毒M基因阳性对照(RNA)。
第三步骤是设计合成与筛选检测尼帕病毒M基因的引物、探针，过程包括：
(1)基于SEQ ID NO.4所示序列，设计合成多对引物和多个标记探针；
(2)以第一步骤制备的1000倍稀释的尼帕病毒M基因阳性对照(RNA)为模板，采用One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂及推荐的反应扩增条件，在Light480荧光PCR仪对所设计合成的多对引物和标记探针进行筛选试验；
(3)在相同荧光PCR反应扩增试剂及推荐的反应扩增条件下,以出现最小的Ct值、最高荧光强度增加值(ΔRn)以及典型的S型扩增曲线的综合判定标准，见图1,最终确定的检测尼帕病毒M基因的最适引物和标记探针序列分别为：
上游引物：NIPHA-M-F:5’-GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3’       SEQ ID NO.1
下游引物：NIPHA-M-R：5’-AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3’       SEQ ID NO.2
探针：NIPHA-M-P:5’-FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3’-MGB    SEQ ID NO.3
第四步骤是设计合成与筛选检测猪流感病毒M基因的引物、探针，过程包括：
(1)基于SEQ ID NO.4所示序列，设计合成多对引物和多个标记探针；
(2)以第一步骤制备的1000倍稀释的猪流感病毒M基因的阳性对照(RNA)为模板，采用One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂及推荐的反应扩增条件，在Light480荧光PCR仪对所设计合成的多对引物和标记探针进行筛选试验；
(3)以出现最小的Ct值、最高的荧光强度增加值(ΔRn)以及典型的S型扩增曲线的综合判定标准，见图5,最终确定的检测猪流感病毒M基因的最适引物对和标记探针序列分别为：
上游引物：SIV-M-F:5’-CGGTCTCACAGACAGATGGCTAC-3’SEQ ID NO.9
下游引物：SIV-M-R：5’-GTGCTAGCCAACACCATTCTG-3’SEQ ID NO.10
探针：SIV-M-P:5’-VIC-ACCACCAATCCACTAATCAGGCA-3’-MGB。SEQ ID NO.11
第五步骤是优化检测尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的二重荧光RT-PCR反应体系与扩增条件，过程包括：
(1)对第三步骤和第四步骤确定的引物和标记探针，用无菌水分别配制成10pmol/μL、8pmol/μL、6pmol/μL、4pmol/μL、2pmol/μL的工作浓度，将探针用无菌水分别配制成3.5pmol/μL、3pmol/μL、2.5pmol/μL、2.0pmol/μL、1.5pmol/μL的工作浓度；
(2)采用One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂及推荐的反应扩增条件，在Light480荧光PCR仪上对不同使用浓度组合的引物和标记探针进行荧光PCR方阵筛选试验；
(3)以获得最小Ct值、最高的荧光强度增加值(ΔRn)以及典型的S型扩增曲线为 综合判定依据，最终确定的检测尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的最适上、下游引物的使用浓度均为15pmol/μL，最适探针的使用浓度均为5pmol/μL，在25μL体系中加入0.5μL引物及探针；
(4)在最适引物和标记探针浓度以及通用荧光RT-PCR反应扩增试剂条件下，对退火延伸温度在61℃～56℃范围内进行筛选试验，最终确定的最适荧光PCR扩增条件为：42℃反应5min；94℃预变性10s；94℃变性10s，60℃延伸20s，共40个循环。
第六步骤是基于第三步骤、第四步骤和第五步骤确定的引物和标记探针的二重荧光RT-PCR方法，分别建立检测尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的荧光RT-PCR扩增标准曲线和确定最低检测限，过程包括：
(1)对尼帕病毒M基因阳性对照进行10倍系列稀释，以第五步骤确定的最适反应体系与扩增条件进行荧光RT-PCR扩增,荧光RT-PCR扩增的动力学曲线见见图3；
(2)以扩增曲线的Ct值为横坐标，以尼帕病毒M基因阳性对照的拷贝数浓度的对数为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.4168X+37.526，相关系数(r)为0.9995，见图4,表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到46个拷贝的尼帕病毒M基因阳性对照RNA分子，可用于微量尼帕病毒M基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
(3)对猪流感病毒M基因阳性对照进行10倍系列稀释，以第五步骤确定的最适反应体系与扩增条件进行荧光RT-PCR扩增,荧光RT-PCR扩增的动力学曲线见见图7；
(4)以扩增曲线的Ct值为横坐标，以猪流感病毒M基因阳性对照拷贝数浓度的对数为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.2618X+37.649，相关系数(r)为0.9983，见图8,表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到58个拷贝的猪流感病毒M基因阳性对照RNA分子，可用于猪流感病毒M基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
第七步骤是对基于第三步骤、第四步骤和第五步骤确定的引物和标记探针的二重荧光RT-PCR方法进行特异性试验，过程包括：
(1)对于猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒的细胞培养物和猪口蹄疫疫苗，采用TRIZOL试剂按操作说明书提取基因组RNA；
(2)对于伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的细胞培养物，采用TIANGEN的Tissure/Blood DNA kit按操作说明书提取基因组DNA。
(3)以基于第三步骤、第四步骤和第五步骤确定的引物和标记探针的二重荧光RT-PCR方法，对猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒的细胞培养物和猪口蹄疫疫苗的基因组RNA以及伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒的基因组DNA进行荧光RT-PCR扩增，检测结果显示基于第三步骤、第四步骤和第五步骤确定的引物和标记探针的二重荧光RT-PCR方法具有良好的特异性，与上述猪相关病毒核酸不出现非特异性扩增曲线,见图2和图6。
第八步骤是确定检测家猪及其相关样本中尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的操作方法，过程包括：
(1)建立处理家猪及其相关样本方法；
(2)同时提取样本基因组RNA的方法；
(3)利用基于第三步骤、第四步骤和第五步骤确定的引物和标记探针的二重荧光RT-PCR方法，对这些样本进行尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因检测及结果判定。
实施例1尼帕病毒M基因阳性对照的制备
1.参照基因序列的选择
对尼帕病毒M基因序列(GenBank收录号：AJ564621.1)进行BLAST，选取一段保守且适宜设计荧光RT-PCR引物和探针的序列作为制备尼帕病毒M基因阳性对照(RNA)的参考序列，如SEQ ID NO.1所示。
2.扩增引物设计与合成
基于上述序列，设计合成4条PCR扩增引物，其中NIPHA-M-F1和NIPHA-M-R1序列完全互补用做模板，NIPHA-M-F2和NIPHA-M-R2分别与NIPHA-M-F1和NIPHA-M-R1序列部分重叠，合成的序列如下：
NIPHA-M-F1:5’-CCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCC-3
NIPHA-M-R1:5’-GGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTGCTACTCGGCTGATCTCACAACTGTTGTTCCAGG-3
NIPHA-M-F2:5’-GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATC-3’
NIPHA-M-R2:5’-GAAGACATCATCATAGATCATGAACTCTCTTGGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTG-3’；
3.PCR扩增
在50μL PCR扩增体系中，依次加入10×Buffer(含MgCl₂)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，TaKaRa Taq聚合酶(5.0U/μL)0.2μL，NIPHA-M-F1(1pmmol/μL)和NIPHA-M-R1(1pmmol/μL)各1μL，NIPHA-M-F2(25pmmol/μL)和NIPHA-M-R2(25pmmol/μL)各1μL，补足ddH₂O至50μL。
PCR扩增反应参数条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸6min；4℃保温1min。
4.PCR产物的回收、纯化
取PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，切割大小为121bp的目的扩增条带，按照小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明书纯化回收目的DNA片段。
5.PCR产物与克隆载体的连接、转化
按照PCR2.1克隆载体操作说明书，将纯化的目的DNA片段与PCR2.1克隆载体在16℃条件下过夜连接，将该连接产物与DH5α大肠杆菌基因工程菌混合，42℃热激90s，冰浴2min后，加入1mL LB培养基37℃振摇培养1h，然后于AMP⁺LB平板上涂布后37℃过夜培养。
6.插入尼帕病毒尼帕病毒M基因阳性质粒的挑选、鉴定
挑取10个单菌落，于3mL LB培养基中37℃振摇过夜培养，然后用小量质粒提取试剂盒按操作说明书提取和纯化克隆质粒，用PCR方法筛选插入尼帕病毒M基因保守序列的阳性克隆质粒；
7.尼帕病毒M基因阳性对照(RNA)的制备及拷贝数测定
对上述纯化的阳性克隆质粒用Bam HⅠ酶切，回收酶切产物，以线性化的阳性克隆质粒DNA为模板，使用DNA体外转录试剂盒RiboMAXTM Large Scale RNA Production SystemT7,按照操作说明书进行体外转录，用DNA酶消化DNA模板，提取RNA，分装。用核酸含量分析仪对纯化的阳性克隆质粒进行质量测定，并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数：

由上述方法即制备成尼帕病毒M基因阳性对照(RNA)。
实施例2猪流感病毒M基因阳性对照(RNA)的制备
1.参照基因序列的选择
对猪流感病毒M基因序列(GenBank收录号：KF986907)进行BLAST，选取一段保守且适宜设计荧光RT-PCR引物和探针的序列作为制备猪流感病毒M基因阳性对照(RNA)的参A)的参如SEQ ID NO.1所示。
2.扩增引物设计与合成
基于上述序列，设计合成4条PCR扩增引物，其中SIV-M-F1和SIV-M-R1序列完全互补用做模板，SIV-M-F2和SIV-M-R2分别与SIV-M-F1和SIV-M-R1序列部分重叠，合成的序列如下：
SIV-M-F1:5-GTGCCTGAGTCCATGAGGGAAGAATATCAGCAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGTTG-3
SIV-M-R1:5-CAACATCCACAGCACTCTGCTGTTCCTGCTGATATTCTTCCCTCATGGACTCAGGCAC-3
SIV-M-F2:5-ATACGGTTTGAAAAGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCTGAGTCCATGAGGGAA-3
SIV-M-R2:5-TTACTCTAGCTCTATGTTGACAAAATGACCATCGTCAACATCCACAGCACTCTGCTG-3
3.PCR扩增
在50μL PCR扩增体系中，依次加入10×Buffer(含MgCl₂)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，TaKaRa Taq聚合酶(5.0U/μL)0.2μL，CSFV-F1(1pmmol/μL)和CSFV-R1(1pmmol/μL)各1μL，CSFV-F2(25pmmol/μL)和PRRSV-NSP2-R2(25pmmol/μL)各1μL，补足ddH₂O至50μL。
PCR扩增反应参数条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸6min；4℃保温1min。
4.PCR产物的回收、纯化
取PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，切割大小为128bp的目的扩增条带，按照小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明书纯化回收目的DNA片段。
5.PCR产物与克隆载体的连接、转化
按照PCR2.1克隆载体操作说明书，将纯化的目的DNA片段与PCR2.1克隆载体在16℃条件下过夜连接，将该连接产物与DH5α大肠杆菌基因工程菌混合，42℃热激90s，冰浴2min后，加入1mL LB培养基37℃振摇培养1h，然后于AMP⁺LB平板上涂布后37℃过夜培养。
6.插入猪流感病毒M基因阳性质粒的挑选、鉴定
挑取10个单菌落，于3mL LB培养基中37℃振摇过夜培养，然后用小量质粒提取试剂盒按操作说明书提取和纯化克隆质粒，用PCR方法筛选插入猪流感病毒M基因保守序列性克隆质粒；
7.猪流感病毒M基因阳性对照(RNA)的制备及拷贝数测定
对上述纯化的阳性克隆质粒用Bam HⅠ酶切，回收酶切产物，以线性化的阳性克隆质粒DNA为模板，使用DNA体外转录试剂盒RiboMAXTM Large Scale RNA Production SystemT7,按照操作说明书进行体外转录，用DNA酶消化DNA模板，提取RNA，分装。用核酸含量分析仪对纯化的阳性克隆质粒进行质量测定，并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数：

由上述方法即制备成猪流感病毒M基因阳性对照(RNA)。
实施例3尼帕病毒M基因荧光定量PCR检测标准曲线的绘制
1.尼帕病毒M基因阳性对照(质粒)的稀释
对浓度为4.6×10⁹的尼帕病毒M基因阳性对照(RNA)进行10倍系列稀释，选择4.6×10⁷～4.6×10¹倍稀释的M基因阳性对照作为标准品模板。
2.荧光RT-PCR体系配制及扩增
采用TaKaRa公司的采用TaKaRa公司的One Step PrimeScript^TMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)荧光RT-PCR反应试剂，按表1的反应体系组成配制反应体系，充分混合均匀后向每个荧光PCR管中分装24.0μL，然后依次加入1.0μL 10倍系列稀释的尼帕病毒M基因阳性对照(RNA)，每个稀释度做3个平行检测体系，密封后离心后，放置于Light480荧光PCR仪上的样本检测槽中。反应参数为42℃5min，95℃10sec，然后95℃10sec，56℃10sec，60℃30sec，40个循环，在每一次循环60℃退火结束前采集FAM通道荧光信号。
表1 荧光RT-PCR反应体系组成

3.标准曲线的绘制
反应结束后，获得的尼帕病毒M基因阳性对照荧光RT-PCR扩增动力学曲线见图3,尼帕病毒M基因阳性对照的拷贝数浓度与对应的Ct值见表2。
表2 尼帕病毒M基因阳性对照的荧光定量RT-各拷贝数对应Ct值

以扩增曲线的Ct值为横坐标，以尼帕病毒M基因阳性对照的拷贝数浓度为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.4168X+37.526，相关系数(r)为0.9995，见图4,表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到至少46个拷贝的尼帕病毒M基因RNA分子，可用于微量尼帕病毒M基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
实施例4猪流感病毒M基因荧光定量RT-PCR检测标准曲线的绘制
1.猪流感病毒M基因(RNA)的稀释
对浓度为5.8×10⁹的猪流感病毒M基因阳性对照(RNA)进行10倍系列稀释，选择5.8×10⁷～5.7×10¹倍稀释的猪流感病毒M基因阳性对照(RNA)作为标准品模板。
2.荧光PCR反应的体系配制及扩增
采用TaKaRa公司的One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)荧光RT-PCR反应试剂，按表3的反应体系组成配制反应体系，充分混合均匀后向每个荧光PCR管中分装24.0μL，然后依次加入1.0μL10倍系列稀释的猪流感病毒M基因阳性对照(RNA)，每个稀释度做3个平行检测体系，密封后离心后，放置于Light480荧光PCR仪上的样本检测槽中。反应参数为42℃5min，95℃10sec，然后95℃10sec，56℃10sec，60℃30sec，40个循环，在每一次循环60℃退火结束前采集荧光信号。
表3 荧光RT-PCR反应体系组成

3.标准曲线的绘制
反应结束后，获得的猪流感病毒M基因荧光RT-PCR扩增动力学曲线见图7,猪流感病毒M基因阳性对照的拷贝数浓度与对应的Ct值见表4。
表4 猪流感病毒M基因阳性对照的荧光定量RT-PCR各拷贝数对应Ct值


以扩增曲线的Ct值为横坐标，以猪流感病毒M基因阳性对照的拷贝数浓度为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.2618X+37.649，相关系数(r)为0.9983，见图8,表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到至少58个拷贝的猪流感病毒M基因阳性对照RNA分子，可用于微量猪流感病毒M基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
实施例5实际样本中尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的检测
1.样本的处理及其基因组RNA提取
(1)样本的处理
对于猪血液血液样本，直接吸取200μL，用于基因组RNA提取；对于猪肌肉及脏器组织(肝、脾、淋巴结、肺、肾)肉样本，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中，充分研磨，再加10mL PBS混匀，或置于组织匀浆器中，加入10mL PBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，3000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌1.5mL离心管中，吸取200μL悬液，用于基因组RNA提取。
(2)基因组RNA提取
使用Trizol试剂，按照操作说明书提取样本RNA，最后加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。同时提取尼帕病毒M基因阳性对照RNA和猪流感病毒阳性对照RNA以及阴性组织对照RNA。
2.荧光RT-PCR反应体系配制及扩增条件
(1)反应体系配制
采用TaKaRa公司的One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)荧光RT-PCR反应试剂，按表3的反应体系组成配制反应体系，充分混合均匀后向每个荧光PCR管中分装16.5μL，然后加入8.5μL核酸检测样本，密封后离心后，放置于Light480荧光PCR仪上的样本检测槽中。
表3 二重荧光RT-PCR反应体系组成


(2)扩增条件
反应参数为42℃5min，95℃10sec，然后95℃10sec，56℃10sec，60℃30sec，40个循环，在每一次循环60℃退火结束前采集荧光信号。
3.结果判定
试验结束后，观察FAM通道和VIC通道的阳性对照、阴性对照和样本的扩增曲线和Ct值，判定试验是否成立及样本检测的结果。当阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线，则试验成立，否则此次实验视为无效。Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在病毒，判为阳性结果，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无病毒，判为阴性结果。
本发明建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的二重荧光定量RT-PCR检测体系，可在3～4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地同时检出尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因，可用于来自猪血液、肌肉及脏器组织样本中微量尼帕病毒M基因和猪流感病毒M基因的同时检测。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。