针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法.pdf

本发明公开了一种针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，包括如下步骤：构建3个初筛模板，进行亲本初筛引物；构建16个样品小群体，进行亲本间有差异引物的复筛，符合约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选；构建38个样品小群体，选取目的条带在此群体中符合约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选；构建24个样品小群体，保留在此群体中符合约定规律的标记；初步确定目标基因所在染色体，集中筛选预备标记；对另外互补的基因利用如上方法进行筛选；群体验证筛出的互补作用的基因的分子标记，定位并作出遗传图谱。本发明结合SSR等分子标记使用，使此类二或多对基因互补产生的质量性状的基因的分子标记筛选变得相对简单易行。

1.  针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建3个初筛模板，按照相应引物的退火温度做SSR-PCR，然后把PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照同一个引物的3个不同模板为一组，以不同引物不同组的先后顺序点样，然后分析每一组即相同引物的3个样品之间的带型差异，进而筛选出在两亲本间有差异的SSR引物，以便进一步筛选验证；
S2、构建16个样品小群体，并以此为模板做SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，选取符合在此群体中约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选；
S3、构建38个样品小群体，并以此为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，选取符合在此群体中约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选；
S4、构建24个样品小群体，并以此为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，保留在21个隐性性状群体中，有不少于5个且小于15个隐性带型的引物，然后准备进一步用扩大了的显性性状群体验证；
S5、初步确定目标基因所在染色体，集中筛选预备标记；
S6、对另外互补的基因利用上述方法进行筛选；
S7、群体筛出的互补作用的基因的分子标记，定位出基因并作出遗传图谱。

2.  根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中初筛模板的构建方法为：以两个亲本分别建池后的基因池DNA样品作为待研究相对性状的样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品。

3.  根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S2中选取的在13个F2样本之中主要目的条带只有≤2个与具有隐性条带亲本的条带一致，其余至少11个样品的主要目的条带均保持与具有显性条带的亲本一致或具有杂合条带的引物作为疑似标记。

4.  根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S3中选取在35个F2样本之中主要目的条带只有≤3个有差异，其余至少32个样品的目的条带均保持一致，或在包括复筛时的13个F2样品在内的48个F2样品中只有≤5个样品有差异目的条带的作为疑似标记。

5.  根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S4的作用是以隐性性状样本作为对照，用以从反面辅证S2、S3中所筛选出引物的可靠性。

6.  根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S5的具体方法为：分析上述S1-S4步筛出的SSR标记，有多个标记集中在同一染色体上，初步断定此染色体为目标基因所在的染色体，然后集中筛选此染色体上对应的SSR标记，选出足够多的标记以便之后上群体验证并作图。

7.  根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S6中对另外互补的基因进行初步筛选的方法为：以一对一对基因依次重复步骤S1-S5。

针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法
技术领域
本发明涉及基因的分子标记筛选领域，具体涉及一种针对由互补作用控制的质量性状的基因的分子标记筛选方法。
背景技术
在现在的生物技术研究领域，基因定位是基因克隆以及进一步深入研究基因的产物、功能、作用通路、作用机理及应用的基础，目标基因连锁的分子标记的筛选是基因定位的关键。随着生物技术的发展，利用SNP芯片技术并结合以集团分离分析法(BSA)为基础的多种分子标记对质量性状对应的单基因的分子标记的筛选已经相对比较容易。
在基因连锁的分子标记的筛选中，现在广泛使用的集团分离分析法(BSA)首先从一对具有目标基因的表型差异的亲本所产生的任何一种分离群体中，根据目标基因的表型分别选取一定数量的植株，构成2个亚群或集团。将每群的DNA等量混合，形成两个针对所研究的相对性状的“基因池”(gene pool)，然后用合适的分子标记对两个基因池进行分析，在两群间表现多态性的分子标记遗传上与目标性状基因座位相连锁。在获得了与目标基因相连锁的分子标记以后，可以利用某一作图群体进行分析以便进一步检测所得分子标记与目标性状基因的连锁程度，以及其在某已知分子图谱中或染色体上的位置，这样就完成了真正意义上的对基因的标记定位。此方法由于建池时使用了特定的分离群体，并且在分组时仅对目标性状进行选择，这样可以保证其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上就应主要在目标基因区段存在差异，此方法得以实现的关键即在于此。
但是，生物的质量性状除了能够有效建池的单基因决定的质量性状外，值得注意的是还有通过不能够轻易有效建池的两对或多对基因互补产生的质量性状。研究基因互补产生的质量性状时，因为互为相对性状的两个群体之内的某一个特定基因不是完全一致的(不是或均为显性或均为隐性)，所以不能有效地针对其中的某一个基因有针对性地构建“阴、阳基因池”，所以不能简单有效地利用以集团分离分析法(BSA)为基础的分子标记进行目的基因的定位，这将严重制约之后的系列研究或应用。
现有的集团分离分析法(BSA)仅对能够形成两个针对性“基因池”(gene pool)的相对性状的基因连锁的分子标记的筛选有效，对于不能有效构建“阴、阳基因池”的二或多对基因互补产生的质量性状的基因的分子标记筛选则无效。而本方法不仅对能够构建“基因池”(gene pool)的相对性状的基因的分子标记筛选有效，且能够对于不能有效构建“阴、阳基因池”的二或多对基因互补产生的质量性状的基因的分子标记筛选仍然有效，且能够分别筛选出互补的各个基因的相关分子标记。
集团分离分析法(BSA)的关键在于建池时使用了特定的分离群体，并且在分组时仅对目标性状进行选择，保证了其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上就应仅存在目标基因区段的差异，一旦一个性状对应的基因池混入另一个对应相对性状的DNA，则导致两个基因池之间针对主要在目标基因区段存在的差异不明显或丧失，从而导致不能有效地对目标基因的分子标记进行筛选。
发明内容
针对不能有效构建“阴、阳基因池”的由二或多对基因互补控制质量性状的基因的标记筛选难题，本发明提供了一种针对由互补作用控制的质量性状的基因的分子标记筛选方法，结合SSR等分子标记使用本方法，使此类性状基因的标记筛选变得相对简单易行。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，包括如下步骤：
S1、构建3个初筛模板(2亲本1对照)，按照相应引物的退火温度做SSR-PCR，然后把PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，按照同一个引物的3个不模板为一组，以不同引物不同组的先后顺序点样，然后分析每一组即相同引物的3个样品之间的带型差异，进而筛选出在两亲本间有差异的SSR引物，以便进一步筛选验证；
S2、构建16个样品小群体(2个亲本1个对照13个F2显性性状样本)，并以此为模板做SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，选取符合在此群体中约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选；
S3、构建38个样品小群体(2个亲本1个对照35个F2显性性状样本)，并以此为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，选取符合在此群体中约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选；
S4、构建24个样品小群体(2个亲本1个对照21个F2隐性性状样本)，并以此为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，以两对基因显性互补为例，理论上对隐性性状群体而言，任何一对基因显性带型：隐性带型＝3∶4，考虑到采样时的误差、此样本数较小等多种因素的影响，又因为此步骤只是作为辅证，显隐性带型的分离比在隐性性状群体中和在显性性状群体中具有显著差异即可，所以保留在21个隐性性状群体中，有不少于5个且小于15个隐性带型的引物，然后准备进一步用扩大了的显性性状群体验证，此步是以隐性性状样本作为对照，用来从反面辅证S2、S3中所筛选出引物的可靠性；
S5、初步确定目标基因所在染色体，集中筛选预备标记；
S6、对另外互补的基因利用上述方法进行筛选；
S7、群体验证筛出的互补作用的基因的分子标记，，定位出基因并作出遗 传图谱。
其中，所述步骤S1中初筛模板的构建方法为：以两个亲本分别建池后的基因池DNA样品作为待研究相对性状的样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品，这样即构建成立3个样品组成的亲本初筛模板，以两对基因互补为例，那么这个互补产生的性状的显性基因每个亲本分别一个。
其中，所述步骤S2中选取在13个F2样本之中主要目的条带只有≤2个与具有隐性条带亲本的条带一致，其余至少11个样品的主要目的条带均保持与具有显性条带的亲本一致或具有杂合条带的引物作为疑似标记。
其中，所述步骤S3中选取在35个F2样本之中主要目的条带只有≤3个有差异(与具有隐性条带亲本的条带一致)，其余至少32个样品的目的条带均保持一致(与具有显性条带的亲本一致或具有杂合条带)，即在包括复筛13个F2样品在内的48个F2样品中只有≤5个样品有差异目的条带(与具有隐性条带亲本的条带一致)的引物作为疑似标记。
其中，所述步骤S5的具体方法为：分析上述S1-S4步筛出的SSR标记，有多个标记集中在同一染色体上，初步断定此染色体为目标基因所在的染色体，然后集中筛选此染色体上对应的SSR标记，选出足够多的标记以便之后上群体验证并作图。
其中，所述步骤S6中对另外互补的基因进行初步筛选的方法为：以一对一对基因依次重复步骤S1-S5。
本发明具有以下有益效果：
对不能有效构建“阴、阳基因池”的二或多对基因互补产生的质量性状的基因的分子标记筛选的难题，以一种相对简单有效的方式提出了解决办法，结合SSR等分子标记使用本方法，使此类性状的基因的分子标记筛选变得相对简单易行。
附图说明
图1为步骤S1中的参考PAGE胶图；
图中：1-4组分别表示4种不同引物样本；同一组内，从左到右模板顺序依次为亲本1、亲本2和对照样本。
图2为步骤S2中的参考PAGE胶图；
图中：a、b、c分别表示显性条带亲本、隐性条带亲本、对照样本；1-13分别表示F2小群体的样本；
其中只有标记为12的样本的条带与隐性条带亲本一致，为异常条带样本。
图3为步骤S3中的参考PAGE胶图。
图中：左侧横线标出的a、b、c分别表示显性条带亲本、隐性条带亲本、对照样本；后面为F2代显性性状群体，其中1-4标出的样本条带与隐性条带样本的条带一致，为异常条带；其余条带或者与显性条带样本的条带一致或者为杂合条带。
图4为步骤S4中参考PAGE胶图；
图中：左侧横线标出的a、b、c分别表示显性条带亲本、隐性条带亲本、对照样本；后面21个F2代隐性性状群体中有标记为1-8的8个样本的条带与隐性条带亲本的条带一致，其余样本的条带或者与显性条带样本的条带一致或者为杂合条带总样本数为13，隐性条带样本数介于5和15之间。
图5为本发明实施例针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本具体实施还包括实验前期基础，具体为：
1)研究性状的发现
发现感兴趣或对生产研究有用的性状后，通过至少两年多点多次连续的性状调查，确定性状的可靠性。
2)针对性设计实验，普通遗传分析，确定遗传方式。
根据亲本及F1、F2代的表现型，设计杂交、回交、测交实验，根据需要调查其对应F1、F2代的分离比，以此作为普通遗传分析的基础，进而确定遗传方式，为二或多对基因互补作用产生则使用此方法，其他遗传方式根据具体情况再另行分析，以下是以二或多对基因互补作用为实验前提。
3)分群体取样，提取DNA
根据遗传分析的结果及调查所得的相对性状把F2代分为以相对性状为依据的两个群体，提取其中显性性状样本的DNA作为主要实验样品，隐性性状样本作为辅助实验样本。
如图5所示，本发明实施例提供了一种针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，包括如下步骤：
S1、亲本初筛引物(使用普通PCR及PAGE方法)
以两个亲本分别建池后的基因池DNA样品作为待研究相对性状的样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品，这样即构建成立3个样品组成的亲本初筛模板，以两对基因互补为例，那么这个互补产生的性状的显性基因每个亲本分别一个。
以上述构建的3个初筛模板，按照SSR(简单重复序列)引物所在染色体分类，批量筛选。具体方法就是按照相应引物的退火温度做SSR-PCR，然后把PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，按照同一个引物的3个不模板为一组，以不同引物不同组的先后顺序点样，其参考PAGE胶图如图1所示，然后分析每一组即相同引物的3个样品之间的带型差异，进而筛选出在两亲本间有差异的SSR引物，以便进一步筛选验证。
S2、16个显性性状含亲本小群体复筛(使用普通PCR及PAGE方法)
a.构建16个样品小群体
随机选取13个明显具有显性性状主要实验样品个体的DNA样品，加上两个亲本分别建池后的基因池DNA样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品，共同组成16个样品的小群体。
b.实验分析筛选疑似标记
以此16个样品小群体为模板做SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，其参考PAGE胶图如图2所示，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，选取在亲本中有差异，在13个F2样本之中主要目的条带只有≤2个与具有隐性条带亲本的条带一致，其余至少11个样品的主要目的条带均保持与具有显性条带的亲本一致或具有杂合条带的引物作为疑似标记进入下一轮筛选。
S3、38个显性性状含亲本小群体验证复筛结果(使用普通PCR及PAGE方法)
a.构建38个样品小群体
随机选取不同于前述2中13个样品的另外的35个明显具有显性性状主要实验样品个体的DNA样品，加上两个亲本分别建池后的基因池DNA样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品，共同组成38个样品的小群体。
b.实验分析验证复筛出的疑似标记
以此38个样品小群体为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，其参考PAGE胶图如图3所示，选取表现为在亲本中有差异，在35个F2样本之中主要目的条带只有≤3个有差异，其余至少32个样品的目的条带均保持一致，即在包括复筛13个F2样品在内的48个F2样品中只有≤5个样品有差异目的 条带的引物作为疑似标记进入下一轮筛选。
S4、24个隐性性状含亲本小群体重复验证复筛结果(使用普通PCR及PAGE方法)
a.构建24个样品小群体
随机选取21个明显具有阴性性状主要实验样品个体的DNA样品，加上两个亲本分别建池后的基因池DNA样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品，共同组成24个样品的小群体。
b.实验分析验证复筛出的疑似标记
以此24个样品小群体为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，其参考PAGE胶图如图4所示，以两对基因显性互补为例，理论上对隐性性状群体而言，任何一对基因显性带型∶隐性带型＝3∶4，考虑到采样等多种因素的影响，又因为此步骤只是作为辅证，显隐性带型的分离比在隐性性状群体中和在显性性状群体中具有显著差异即可，所以在21个隐性性状群体中，有不少于5个且小于15个隐性带型即可保留此引物，然后准备进一步用扩大了的显性性状群体验证。
S5、初步确定目标基因所在染色体，集中筛选预备标记；
分析通过上述1-4步筛出的SSR标记，会有多个标记集中在同一染色体上，这样就初步断定目标基因所在的染色体，然后集中筛选此染色体上对应的SSR标记，选出足够多的标记以便之后上群体验证并作图。
S6、对另外互补的基因利用上述方法进行筛选；具体流程同1-5步。
两对以上互补基因虽然具体遗传分离比仍要具体计算，但也可以一对一对基因依次按照1-5步重复操作，具体方法步骤类似。
S7、群体验证筛出的互补作用的基因的分子标记，定位出基因并作出遗传图谱。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。