植物花青素的微生物或/和生物酶提取方法.pdf

本发明涉及植物花青素的微生物或/和生物酶提取方法。它属生物工程技术领域。它是由下列步骤组成的：含花青素植物的分类粉碎、吸水、冰冻、加热解冻、压榨、过滤制汁，以裂解花色苷糖苷键的微生物或/和生物酶对花色苷进行裂解和降解，以阴离子表面活性剂进行反应沉淀，再到微生物对沉淀物进行降解，沉淀分离，蒸发浓缩。本发明技术可得到真实含量在95％以上的阳离子花青素即花色基元而非花色苷。本发明制得的阳离子花青素不需人体肠道微生物降解，而直接被人体吸收利用或直接进入人体血液。其医疗保健价值远远高于花色苷。

1.  植物花青素的微生物或/和生物酶提取方法，其特征在于它是由下列步骤组成的：
一、原材料预处理：新鲜含植物花青素的原材料，如葡萄皮、胡萝卜、蓝靛果，进行分类→粉碎→食用软水浸泡吸水→冰冻破坏植物组织细胞壁→加热解冻→压榨→过滤制汁备用(1)→残渣适当加水→浸泡搅拌→压榨→过滤制汁备用(2)。
二、将上述压榨过滤水溶液(1)和(2)合在一起，并将其水温调节到下述降解微生物或/和生物酶的最适范围。
三、将上述产物以可裂解花色苷糖苷键、降解碳水化合物的微生物或/和生物酶进行生物降解，先低速搅拌，100-600转/分，后静置，使含花青素的花色苷降解为阳离子花青素。
具体可用人体肠道菌的乳酸菌和双歧杆菌等或黑曲霉菌再加上β-葡萄糖苷酶、苦杏仁苷酶、转化糖酶、麦芽糖苷酶、β-糖苷酶、果胶裂解酶中的一种或几种复配协同增效。
裂解和降解时间10-24小时，温度25℃-40℃、PH2.5-6.9。
以上各种酶可用淀粉底物吸附沉淀回收再利用。
此步降解前需要先用微生物或/和生物酶降解蛋白质。
四、将上述产物再加入相对于阳离子花青素稍微过量的阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸铵(C₁₂H₂₅OSO₃NH₄)，以中速搅拌，600-1400转/分，使之充分反应后静置，使阳离子花青素大多被化合沉淀为止。此步反应最好辅以0℃以上的较低的温度，这有利于反应物的快速完全沉淀。
五、取出上述含水化合物进行微生物降解，可加入少量无菌饮用水，在先低速搅拌后静置中进行，搅拌速度100转/分左右，使所加入的阴离子表面活性剂被微生物降解，恢复花青素的阳离子活性和水溶性。
具体可用假单孢菌属、无色杆菌属、节杆菌属、微球菌属、诺卡氏菌属、不动杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、黄杆菌属这些微生物中的一种或几种的组合进行生物降解。
降解时间10-24小时，降解温度20℃-40℃，PH3-8。
六、将上述降解产物加热干燥杀菌，干燥温度70℃-100℃，得阳离子花青素产品。
七、制取高纯度医药用阳离子花青素产品时，可将上述方法所得花青素产品用蒸馏水或食用乙醇溶解，使失活蛋白质残体沉淀析出。
八、要制得高纯度的阳离子花青素干品，还需将上述花青素溶液进一步蒸发浓缩干燥。

植物花青素的微生物或/和生物酶提取方法
所属技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域的一种植物阳离子花青素的提取方法，尤其是植物花青素的微生物或/和生物酶提取方法。
背景技术：
随着人们生活水平的提高和对天然植物性来源的无毒无害的有利于保护人们身体健康、防病治病的天然有机物质的追求，同时也由于人工合成花青素对人体有较大的毒副作用，已被世界卫生组织所禁止使用，因此高效无毒的天然植物阳离子花青素及其提取方法已成为21世纪新兴前沿研究课题。
但是现有的分离提取技术只是得到含花青素的花色苷，且含量太低，杂质太多，因此其大多用在食品染色和化妆品的着色，医疗保健价值低。现有的超声波、微生物降解破坏植物组织细胞壁，萃取等分离纯化技术提取得到的花色苷与真正对人体有保健、防病治病作用的阳离子花青素有着本质的区别。花色苷是植物体内阳离子花青素即花色基元与各种单糖通过糖苷键结合形成的糖苷，这是一种中性物质，生物活性低，在人体内只有通过人体肠道菌降解脱糖形成阳离子花青素即花色基元才能被人体吸收利用，消除人体内有害的自由基，防病治病，但这种中性的花色苷在人体中降解、代谢率很低，生物利用率低，因而人体对其吸收率也很低。
再加上人的个体生物转化功能差异很大，特别是中老年人和病人的肠道对花色苷的降解吸收程度更低。因而人体外工业化植物花色苷的降解和阳离子花青素的分离提取就显得特别重要。这对于从根本上保护人们的身体健康、防病治病具有重大的现实意义。
发明内容：
为有效地克服目前现有花色苷分离提取技术的缺陷，确实有力保护人们的身体健康、防病治病，本发明提供一种简单可靠、技术可操作性强、生产成本低、效果好、阳离子花青素提取物纯度高的植物花青素的微生物或/和生物酶提取方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
1、本发明提取方法包括以下步骤：
一、原材料预处理：新鲜含植物花青素的原材料，如葡萄皮、胡萝卜、蓝靛果，进行分类→粉碎→食用软水浸泡吸水→冰冻破坏植物组织细胞壁→加热解冻→压榨→过滤制汁备用(1)→残渣适当加水→浸泡搅拌→压榨→过滤制汁备用(2)。
二、将上述压榨过滤水溶液(1)和(2)合在一起，并将其水温调节到下述降解微生物或/和生物酶的最适范围。
三、将上述产物以可裂解花色苷糖苷键、降解碳水化合物的微生物或/和生物酶进行生物降解，先低速搅拌，100-600转/分，后静置，使含花青素的花色苷降解为阳离子花青素。具体可用人体肠道菌的乳酸菌和双歧杆菌等或黑曲霉菌再加上β-葡萄糖苷酶、苦杏仁苷酶、转化糖酶、麦芽糖苷酶、β-糖苷酶、果胶裂解酶中的一种或几种复配协同增效。
裂解和降解时间10-24小时，温度25℃-40℃、PH2.5-6.9。
以上各种酶可用淀粉底物吸附沉淀回收再利用。
此步降解前需要先用微生物或/和生物酶降解蛋白质。
四、将上述产物再加入相对于阳离子花青素稍微过量的阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸铵(C₁₂H₂₅OSO₃NH₄)，以中速搅拌，600-1400转/分，使之充分反应后静置，使阳离子花青素大多被化合沉淀为止。此步反应最好辅以0℃以上的较低的温度，这有利于反应物的快速完全沉淀。
五、取出上述含水化合物进行微生物降解，可加入少量无菌饮用水，在先低速搅拌后静置中进行，搅拌速度100转/分左右，使所加入的阴离子表面活性剂被微生物降解，恢复花青素的阳离子活性和水溶性。
具体可用假单孢菌属、无色杆菌属、节杆菌属、微球菌属、诺卡氏菌属、不动杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、黄杆菌属这些微生物中的一种或几种的组合进行生物降解。
降解时间10-24小时，降解温度20℃-40℃，PH3-8。
六、将上述降解产物加热干燥杀菌，干燥温度70℃-100℃，得阳离子花青素产品。
七、制取高纯度医药用阳离子花青素产品时，可将上述方法所得花青素产品用蒸馏水或食用乙醇溶解，使失活蛋白质残体沉淀析出。
八、要制得高纯度的阳离子花青素干品，还需将上述花青素溶液进一步蒸发浓缩干燥。
2、所述提取方法优选为：
它是由下列步骤组成的：
一、原材料预处理：新鲜含植物花青素的原材料，如葡萄皮、胡萝卜、蓝靛果，进行分类→粉碎→食用软水浸泡吸水→冰冻破坏植物组织细胞壁→加热解冻→压榨→过滤制汁备用
(1)→残渣适当加水→浸泡搅拌→压榨→过滤制汁备用(2)。
二、将上述压榨过滤水溶液(1)和(2)合在一起，并将其水温调节到下述降解微生物或/和生物酶的最适范围。
三、用人体肠道菌的乳酸菌和双歧杆菌等再加上β-葡萄糖苷酶、苦杏仁苷酶、转化糖酶、麦芽糖苷酶、β-糖苷酶、果胶裂解酶复配协同增效，进行生物降解。先低速搅拌，100-600转/分，后静置，使含花青素的花色苷降解为阳离子花青素。
裂解和降解时间10-24小时，温度25℃-40℃、PH2.5-6.9。
以上各种酶可用淀粉底物吸附沉淀回收再利用。
此步降解前需要先用微生物或/和生物酶降解蛋白质。
四、将上述产物再加入相对于阳离子花青素稍微过量的十二烷基硫酸铵(C₁₂H₂₅OSO₃NH₄)，以中速搅拌，600-1400转/分，使之充分反应后静置，使阳离子花青素大多被化合沉淀为止。此步反应最好辅以0℃以上的较低的温度，这有利于反应物的快速完全沉淀。
五、取出上述含水化合物用不动杆菌属微生物进行生物降解。
可加入少量无菌饮用水，在先低速搅拌后静置中进行，搅拌速度100转/分左右，使所加入的阴离子表面活性剂被微生物降解，恢复花青素的阳离子活性和水溶性。
降解时间10-24小时，降解温度20℃-40℃，PH3-8。
六、将上述降解产物加热干燥杀菌，干燥温度70℃-100℃，得阳离子花青素产品。
七、制取高纯度医药用阳离子花青素产品时，可将上述方法所得花青素产品用蒸馏水或食用乙醇溶解，使失活蛋白质残体沉淀析出。
八、要制得高纯度的阳离子花青素干品，还需将上述花青素溶液进一步蒸发浓缩干燥。
本发明的有益效果是：
1、本发明有利于含阳离子花青素植物资源的有效、合理和充分利用，减少植物资源的浪费和废弃物排放，避免环境污染。
2、本发明有利于提取得到高纯度的阳离子花青素产品而非含花青素的低纯度的花色苷。实现植物阳离子花青素的医疗价值，防病治病、医疗急救功效显著。
3、本发明技术方案简单，易于操作，生产成本低，易于产业化。
4、本发明的降解产物阳离子花青素以阴离子表面活性剂化合反应沉淀步骤及其与花色苷的微生物或/和生物酶裂解和降解、阳离子花青素与阴离子表面活性剂化合物的微生物降解步骤的有序组合是本发明的核心技术即创新必要技术特征。
5、本发明需在无有害微生物的环境中进行。
6、本发明所采用的阴离子表面活性剂的选择要求：
(一)对微生物无毒或低毒；(二)分子量较小，碳链较短(C₁₀-C₂₂)含直链亲油基；(三)生物降解性好，降解比较迅速、彻底；(四)只含C、H、O、S、N、P这些可转化为气态物质和水的元素或维持微生物生命活动所必需的元素。
7、本发明的微生物裂解和降解过程中要将待降解底物的温度和PH调控到各种微生物生命活动的最适范围，并保持微生物在裂解和降解前的生长繁殖阶段及裂解和降解过程中有全面、充足和比例协调的维持其生命活动所必需的C、H、O、S、N、P等及其他各微量元素营养源。
如以葡萄糖和煮熟的淀粉或果胶等补充C源，也以此引导微生物裂解花色苷的糖苷键。以尿素补充N源。以(NH₄)₃PO₄补充N和P。以(NH₄)₂SO₄补充S和N。以K₂SO₄补充S和K，以Ca(HCO₃)₂、Mg(HCO₃)₂补充Ca和Mg。以FeSO₄、Fe₂(SO₄)₃补充S和Fe。
8、本发明的提取方法也是其他需经人体肠道降解、代谢和吸收的植物性苷类，进行人体外裂解和降解，分离提取其活性苷元的基本方法或重要参考。
具体实施方式：
下面就实施例对本发明作进一步说明：
实施例：
提取时按如下步骤进行：
一、原材料预处理：新鲜含植物花青素的原材料，如葡萄皮、胡萝卜、蓝靛果，进行分类→粉碎→食用软水浸泡吸水→冰冻破坏植物组织细胞壁→加热解冻→压榨→过滤制汁备用(1)→残渣适当加水→浸泡搅拌→压榨→过滤制汁备用(2)。
二、将上述压榨过滤水溶液(1)和(2)合在一起，并将其水温调节到下述降解微生物或/和生物酶的最适范围。
三、将上述产物用人体肠道菌的乳酸菌和双歧杆菌等再加上β-葡萄糖苷酶、苦杏仁苷酶、转化糖酶、麦芽糖苷酶、β-糖苷酶、果胶裂解酶配合使用，也可将上述人体肠道菌与上述各种酶分开使用，并调节PH值，进行生物降解。先低速搅拌，100-600转/分，后静置，使含花青素的花色苷降解为阳离子花青素。
裂解和降解时间10-24小时，温度25℃-40℃、PH2.5-6.9。
以上各种酶可用淀粉底物吸附沉淀回收再利用。
此步降解前需要先用微生物或/和生物酶降解蛋白质。
四、将上述产物再加入相对于阳离子花青素稍微过量的十二烷基硫酸铵(C₁₂H₂₅OSO₃NH₄)，以中速搅拌，600-1400转/分，使之充分反应后静置，使阳离子花青素大多被化合沉淀为止。此步反应最好辅以0℃以上的较低的温度，这有利于反应物的快速完全沉淀。
五、取出上述含水化合物用不动杆菌属这些微生物进行生物降解。
可加入少量无菌饮用水，在先低速搅拌后静置中进行，搅拌速度100转/分左右，使所加入的阴离子表面活性剂被微生物降解，恢复花青素的阳离子活性和水溶性。
降解时间10-24小时，降解温度20℃-40℃，PH3-8。
六、将上述降解产物加热干燥杀菌，干燥温度70℃-100℃，得阳离子花青素产品。
七、制取高纯度医药用阳离子花青素产品时，可将上述方法所得花青素产品用蒸馏水或食用乙醇溶解，使失活蛋白质残体沉淀析出。
八、要制得高纯度的阳离子花青素干品，还需将上述花青素溶液进一步蒸发浓缩干燥。