一种人脐带间充质干细胞的培养方法.pdf

本发明涉及干细胞领域，公开了一种脐带间充质干细胞的培养方法。本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，剪碎后加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养。本发明所述培养方法操作简单、安全有效。实验表明，与现有方法相比，本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法原代时间短，增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，培养至P15代后仍然保持良好的增殖能力，且能很好保持脐带间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性，适用于脐带间充质干细胞的大量培养。

1.  一种脐带间充质干细胞的培养方法，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，剪碎后加入完全培养基，于37℃，5％CO₂静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养。

2.  根据权利要求1所述的培养方法，所述完全培养基配方为lonzaUltraCULTURE MEDIUM无血清培养基+10v/v％PALL血清替代物+1v/v％200mM/L-谷氨酰胺+1×NEAA、5～50ng/mL EGF。

3.  根据权利要求1或2所述的培养方法，所述培养前完全培养基的加入量为0.07mL/cm²-0.1mL/cm²。

4.  根据权利要求1-3任意一项所述的培养方法，所述清洗后完全培养基的加入量为0.15mL/cm²-0.21mL/cm²。

5.  根据权利要求1-4任意一项所述的培养方法，所述传代培养为去掉细胞培养上清，清洗后加入含胰酶和EDTA的消化液消化，用完全培养基终止消化，离心，弃上清，用完全培养基重悬后，传代。

6.  根据权利要求5任意一项所述的培养方法，所述传代培养中含胰酶和EDTA的消化液的加入量为0.015mL/cm²-0.04mL/cm²。

7.  根据权利要求5任意一项所述的培养方法，所述传代培养中含胰酶和EDTA的消化液中胰酶浓度为0.05％-0.3％，EDTA浓度为0.01％-0.04％。

8.  根据权利要求5任意一项所述的培养方法，所述传代培养中消化液消化的时间为1-3min。

9.  根据权利要求5任意一项所述的培养方法，所述传代培养中所述离心为200g-400g离心5min。

10.  根据权利要求5任意一项所述的培养方法，所述传代密度为8000个细胞/cm²-15000个细胞/cm²。

一种人脐带间充质干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞的培养方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、多向分化、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性的细胞，产生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生医学领域有重要作用。
目前，主要从脂肪、骨髓、脐带、胎盘组织中提取间充质干细胞。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。脐带间充质干细胞(UCMSCs)是存在于脐带华尔通胶(Wharton'sjelly)和血管周围组织中的一种干细胞。来源于脐带的间充质干细胞，取材方便，来源丰富，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，成本低，对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，使其成为未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想选择。
目前脐带间充质肝细胞的原代分离的方法主要有酶解法及组织块培养法。酶解法中使用到的胶原酶等来源可能涉及动物来源，且价格昂贵，对细胞损伤较大。而组织块培养法细胞爬出的时间较长，原代培养时间过长使得细胞容易长老，细胞纯度不够，容易受到脐带中其他细胞的污染。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，本发明所述培养方法原代培养时间短、简单经济，可获得大量高纯度脐带间充质干细胞，且能保持脐带间充质干细胞良好的干细胞特性。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞的培养方法，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，剪碎后加入完全培养基，于37℃，5％CO₂静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养。
本发明脐带间充质干细胞的培养方法，所述脐带可以取自产后弃置的脐带组织，采用含有双抗的PBS保存。所述含有双抗的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液，其中青霉素工作浓度为100U/mL，链霉素工作浓度为0.1mg/mL。
本发明脐带间充质干细胞的培养方法中所述脐带预先清洗表面血迹并消毒。在一些实施方案中，所述脐带用50mL～150mL无菌的PBS清洗脐带表面血迹，用50mL～150mL75％乙醇消毒脐带表面，再用50mL～150mL PBS清洗数遍尽量去除血迹。
本发明脐带间充质干细胞的培养方法，脐带去除最外层膜及静脉跟动脉后剪碎以充分与培养基接触。在一些实施方案中，脐带去除最外层膜及静脉跟动脉后剪至大小为1mm³～3mm³的小块，以0.5cm～1cm的间隔把组织块分布于培养皿中。
在一些实施方案中，所述培养方法将将间隔放置的组织块静止风干20min～60min。
本发明脐带间充质干细胞的培养方法，将剪碎的组织块加入完全培养基培养进行原代细胞分离。其中，所述完全培养基配方为lonzaUltraCULTURE MEDIUM无血清培养基+10v/v％PALL血清替代物+1v/v％200mM/L-谷氨酰胺+1×NEAA、5ng/mL～50ng/mL EGF。
在一些实施方案中，所述培养前完全培养基的加入量为0.07mL/cm²-0.1mL/cm²。
本发明脐带间充质干细胞的培养方法，在培养期间需要补加完全培养基直至组织块有细胞爬出。在一些实施方案中，所述培养期间补加完全培养基的加入量为0.07mL/cm²-0.1mL/cm²。
本发明脐带间充质干细胞的培养方法，在组织块有细胞爬出后去掉组织块，并对细胞进行清洗。所述清洗可以采用PBS清洗。
本发明脐带间充质干细胞的培养方法，在清洗后加入完全培养基培养细胞至集落成片进行传代。在一些实施方案中，所述清洗后完全培养基的加入量为0.15mL/cm²-0.21mL/cm²。
在一些实施方案中，所述传代培养为去掉细胞培养上清，清洗后加入含胰酶和EDTA的消化液消化，用完全培养基终止消化，离心，弃上清，用完全培养基重悬后，传代。
在一些实施方案中，所述传代培养中含胰酶和EDTA的消化液的加入量为0.015mL/cm²-0.04mL/cm²。
在一些实施方案中，所述传代培养中含胰酶和EDTA的消化液中胰酶浓度为0.05％～0.3％。
在一些实施方案中，所述传代培养中含胰酶和EDTA的消化液中EDTA浓度为0.01％～0.04％。
在一些实施方案中，所述传代培养中消化液消化的时间为1-3min。
在一些实施方案中，所述终止消化的完全培养基的加入量为消化液体积的5倍～10倍。
在一些实施方案中，所述传代培养中所述离心为200g-400g离心5min。
在一些实施方案中，所述传代密度为8000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2。
在一个具体实施例中，用不去除脐带外膜的组织块培养法作为对比例，比较本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法原代培养时间及原代传代时获得的细胞总数，结果显示本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法原代培养时间明显短于不去除脐带外膜的组织块培养法，传代前获得的脐带间充质干细胞也更多。
在一个具体实施例中，用不去除脐带外膜的组织块培养法作为对比例，比较本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法传代至15代细胞形态，结果显示本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法培养的脐带间充质干细胞一直传至P15代仍然保持良好的增殖能力，两到三天即可融合至80％，而不去除脐带外膜的组织块培养法在P6代开始，增殖速度明显降缓，细胞变大，老化。。
在一个具体实施例中，本发明采用CCK-8法检测本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法培养的脐带间充质干细胞的增殖能力，结果显示，本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法培养的脐带间充质干细胞在P1-P10代均保持 旺盛的增殖能力，增殖曲线变化不明显，而不去除脐带外膜的组织块培养法在P10代即表现出明显的增殖减缓现象。
进一步的，在一个具体实施例中，本发明采用流式细胞仪分析本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法培养的脐带间充质干细胞细胞的表面标志物CD45、CD59、CD90、HLA-DR等的表达情况，结果显示本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法培养的细胞可获得较多的脐带间充质干细胞，细胞纯度更高，在持续培养至P15代，细胞表面标记没有明显变化。
由此可见，采用本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法培养的脐带间充质干细胞能够很好保持干细胞的形态及良好的干细胞特性。
本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，剪碎后加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养。本发明所述培养方法操作简单、安全有效。实验表明，与现有方法相比，本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法原代时间短，增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，培养至P15代后仍然保持良好的增殖能力，且能很好保持脐带间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性，适用于脐带间充质干细胞的大量培养。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例4原代培养5天的细胞状态图，其中图a和b为组一实施例1所述方法培养的细胞图，a放大倍数为40倍，b放大倍数为100倍；图c和d为组二的细胞图，c放大倍数为40倍，d放大倍数为100倍；
图2示实施例5传代培养的细胞状态图，其中图a和b为组一实施例1所述方法培养的P1代培养48h的细胞图，a放大倍数为40倍，b放大倍数为100倍；图c和d为组二的P1代培养48h的细胞图，c放大倍数为40倍，d放大倍数为100倍；图e和f为组一实施例1所述方法培养的P10代培养48h的细胞图，e放大倍数为40倍，f放大倍数为100倍；图g和h为组二的P10代培养48h的细胞图，g放大倍数 为40倍，h放大倍数为100倍；图i和j为组一实施例1所述方法培养的P15代培养72h的细胞图，i放大倍数为40倍，j放大倍数为100倍；
图3示实施例6培养的脐带间充质干细胞的增殖曲线，其中为组一P1代的增殖曲线图，为组一P5代的增殖曲线图，为组一P10代的增殖曲线图，为组二P1代的增殖曲线图，为组二P5代的增殖曲线图，为组二P10代的增殖曲线图；
图4示实施例7脐带间充质干细胞的CD45、CD59、CD90、HLA-DR等细胞表面标志物的表达结果图，其中图a-c为组一P0代对照组，图d-f为组一P0代样品组，图g-i为组二P0代对照组，图j-l为组二P0代样品组，图m-o为组一P15代对照组，图p-r为组一P15代样品组；图a为FSC及SSC表达情况图，图b为HLA-DR及CD59表达情况图，图c为CD45及CD90表达情况图，图d为FSC及SSC表达情况图，图e为FL3及FL2表达情况图，图f为FL1及FL4表达情况图，图g为FSC及SSC表达情况图，图h为HLA-DR及CD59表达情况图，图i为CD45及CD90表达情况图，图j为FSC及SSC表达情况图，图k为HLA-DR及CD59表达情况图，图l为CD45及CD90表达情况图，图m为FSC及SSC表达情况图，图n为HLA-DR及CD59表达情况图，图o为CD45及CD90表达情况图，图p为FSC及SSC表达情况图，图q为HLA-DR及CD59表达情况图，图r为CD45及CD90表达情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、人脐带间充质干细胞的培养
在无菌条件下，取产后弃置的脐带组织至于含有双抗的PBS中运回实验室。用100mL无菌的PBS清洗脐带表面血迹，用100mL 75％乙醇消毒脐带表面，再用100mLPBS清洗数遍尽量去除血迹，把脐带剪成长约1-3cm小段后，去除 脐带最外层膜及静脉跟动脉，把脐带剪至大小为1mm³到3mm³的小块，以0.5cm-1cm的间隔把组织块分布于培养皿中，静止风干40min，加入0.08mL/cm²完全培养基，置于37摄氏度，5％CO₂培养箱中静止培养3天后，补加0.08mL/cm²的培养基，待多数组织块有细胞爬出后，去掉组织块，用PBS清洗数遍，加入0.18mL/cm²完全培养基。待大部分细胞集落成片生长后，即可传代。
传代时先去掉细胞培养上清，用PBS洗3遍后，往细胞中加入0.02mL/cm²的0.1％的胰酶+0.02％EDTA消化2min，用8倍于消化液的完全培养基终止酶解，400g离心5min,用完全培养基重悬后，接种于培养皿或培养瓶中，传代密度为10000个细胞/cm²。
其中，所述完全培养基配方为lonzaUltraCULTURE MEDIUM无血清培养基+10v/v％PALL血清替代物+1％200mM/L-谷氨酰胺+1×NEAA、20ng/mL EGF。
实施例2、人脐带间充质干细胞的培养
在无菌条件下，取产后弃置的脐带组织至于含有双抗的PBS中运回实验室。用50mL无菌的PBS清洗脐带表面血迹，用150mL75％乙醇消毒脐带表面，再用150mLPBS清洗数遍尽量去除血迹，把脐带剪成长约1-3cm小段后，去除脐带最外层膜及静脉跟动脉，把脐带剪至大小为1mm³到3mm³的小块，以0.5cm-1cm的间隔把组织块分布于培养皿中，静止风干20min，加入0.07mL/cm²完全培养基，置于37摄氏度，5％CO₂培养箱中静止培养3天后，补加0.07mL/cm²的培养基，待多数组织块有细胞爬出后，去掉组织块，用PBS清洗数遍，加入0.15mL/cm²完全培养基。待大部分细胞集落成片生长后，即可传代。
传代时先去掉细胞培养上清，用PBS洗3遍后，往细胞中加入0.015mL/cm²的0.05％的胰酶+0.01％EDTA消化3min，用5倍于消化液的完全培养基终止酶解，400g离心5min,用完全培养基重悬后，接种于培养皿或培养瓶中，传代密度为8000个细胞/cm²。
其中，所述完全培养基配方为lonzaUltraCULTURE MEDIUM无血清培养基+10v/v％PALL血清替代物+1v/v％200mM/L-谷氨酰胺+1×NEAA、5ng/mL EGF。
实施例3、人脐带间充质干细胞的培养
在无菌条件下，取产后弃置的脐带组织至于含有双抗的PBS中运回实验室。用150mL无菌的PBS清洗脐带表面血迹，用50mL75％乙醇消毒脐带表面，再用50mLPBS清洗数遍尽量去除血迹，把脐带剪成长约1-3cm小段后，去除脐带最外层膜及静脉跟动脉，把脐带剪至大小为1mm³到3mm³的小块，以0.5cm-1cm的间隔把组织块分布于培养皿中，静止风干60min，加入0.1mL/cm²完全培养基，置于37摄氏度，5％CO₂培养箱中静止培养3天后，补加0.1mL/cm²的培养基，待多数组织块有细胞爬出后，去掉组织块，用PBS清洗数遍，加入0.21mL/cm²完全培养基。待大部分细胞集落成片生长后，即可传代。
传代时先去掉细胞培养上清，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.04mL/cm²的0.3％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，200g离心5min,用完全培养基重悬后，接种于培养皿或培养瓶中，传代密度为15000个细胞/cm²。
其中，所述完全培养基配方为lonzaUltraCULTURE MEDIUM无血清培养基+10v/v％PALL血清替代物+1v/v％200mM/L-谷氨酰胺+1×NEAA、50ng/mL EGF。
实施例4、
用不去除脐带外膜的组织块培养法(组织块培养法参见《改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞》，中国生物制品学杂志2014年3月第3期，416页1.4细胞培养)作为对比例，实施例1-3方法为组一，不去除脐带外膜的组织块培养法为组二(设三个重复)，比较原代培养时间及原代传代时获得的细胞总数结果见表1和图1。
表1不同培养方法原代培养时间及原代传代时获得的细胞总数的比较

由表1和图1结果可见，组一即本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法原代培养时间明显短于组二，传代前获得的细胞也更多。
实施例5、
按照实施例4的方法用不去除脐带外膜的组织块培养法(组织块培养法同实施例4)作为对比例，实施例1方法为组一，不去除脐带外膜的组织块培养法为组二(设三个重复)，所述传代密度为8000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2，每2～3天换一次液，待细胞长至融合度为75～90％即可传代，一直传至15代。观察细胞形态，结果见图2。
结果显示，组一的细胞一直传至P15代仍然保持良好的增殖能力，两到三天即可融合至80％，而组二在P6代开始，增殖速度明显降缓，细胞变大，老化。实施例2和实施例3所述方法培养得到的细胞与实施例1的结果相似。
实施例6、培养的脐带间充质干细胞的增殖曲线
按照实施例4的方法用不去除脐带外膜的组织块培养法作为对比例，实施例1方法为组一，不去除脐带外膜的组织块培养法为组二。采用CCK-8法来检测培养的脐带间充质干细胞的增殖活力。分别用胰酶消化收集组一组二P1、P5、P10MSCs，接种细胞于96孔板中，2000个/孔。在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养7d。分别在1d、3d、5d、7d对细胞进行检测。在待检测孔中加入10μL染色剂，37℃，5％CO₂培养2h。用酶标仪测450nm处的吸光值，每个样本做6个重复，结果见图3。
由图3结果可以看出，组一在P1-P10代均保持旺盛的增殖能力，增殖曲线变化不明显，而组二在P10代即表现出明显的增殖减缓现象。实施例2和实施例3所述方法培养得到的细胞与实施例1的结果相似。
实施例7、脐带间充质干细胞的流式鉴定
按照实施例4的方法用不去除脐带外膜的组织块培养法作为对比例，实施例1方法为组一，不去除脐带外膜的组织块培养法为组二。取两组原代人脐带间充质干细胞及组一P15代细胞，待生长至80％-90％时，胰酶消化后收集细胞，取两个1.5mLEP管,每管1×10⁶个细胞，用染色缓冲液(10％FBS+90％PBS)洗 两遍，每管加入200μL染色缓冲液，样品加入下列四个抗体CD45、CD59、HLADR、CD90各5μL，阴性对照不加抗体，4℃孵育20min，用染色缓冲液洗两遍，后用500μL1640培养基重悬，用流式细胞仪采集30000个样本，检测其表面标志物CD45、CD59、CD90、HLA-DR等的表达情况。结果如图4。
由图4结果可知，两组均可获得较多的脐带间充质干细胞，但组一细胞纯度更高。组一在持续培养至P15代，细胞流式检测结果显示，细胞表面标记没有明显变化。实施例2和实施例3所述方法培养得到的细胞与实施例1的结果相似。