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本发明涉及使用共聚物从细胞培养液中分离重组和/或生物治疗蛋白质以便捕获或澄清化。根据本发明的方法使用的共聚物包含疏水残基和阴离子残基。

1.  从样品中分离目标分子的方法，其包括：
a) 提供所述样品
b) 将一种或多种包含疏水和阴离子基团的共聚物与所述样品混合，由此形成目标分子-共聚物沉淀物
c) 从所述步骤b)的混合物中分离沉淀物。

2.  根据权利要求1的方法，其特征在于所述共聚物的35至65%的疏水和阴离子基团是阴离子基团。

3.  根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述阴离子基团包含磺酸、硫酸、羧酸和/或膦酸或磷酸官能。

4.  根据权利要求1至3的一项或多项的方法，其特征在于所述疏水基团包含直链、支链或环状烷基、卤素取代的烷基、芳基、杂芳基、卤素取代的芳基和/或杂芳基。

5.  根据权利要求1至4的一项或多项的方法，其特征在于所述共聚物具有10.000至120.000 g/mol的重均分子量和/或1,05-2,5的多分散性。

6.  根据权利要求1至5的一项或多项的方法，其特征在于所述目标分子是抗体。

7.  根据权利要求1至6的一项或多项的方法，其特征在于在所述步骤a)中，将所述样品的pH调节到目标分子的等电点以下的pH。

8.  根据权利要求1至7的一项或多项的方法，其特征在于在所述步骤a)中，将所述样品的pH调节到4至5.5之间的pH。

9.  根据权利要求1至8的一项或多项的方法，其特征在于将所述样品的离子强度调节到在20℃下测得的等于17mS/cm或更低的电导率。

10.  根据权利要求1至5的一项或多项的方法，其特征在于所述目标分子是片段抗原结合区。

11.  根据权利要求10的方法，其特征在于将所述样品的离子强度调节到在20℃下测得的等于9至18 mS/cm的电导率。

12.  根据权利要求1至11的一项或多项的方法，其特征在于在附加步骤d)中，将来自所述步骤c)的沉淀物再溶解。

13.  根据权利要求12的方法，其特征在于用带有聚合电解质的珠粒处理所述步骤d)的再溶解混合物。

14.  根据权利要求13的方法，其特征在于所述带有聚合电解质的珠粒是玻璃或二氧化硅薄片。

15.  根据权利要求14和15的方法，其特征在于所述聚合电解质包含DMAE和/或TMAE基团。

用于蛋白质沉淀的共聚物
本发明涉及使用共聚物从细胞培养液中提纯目标分子，如重组和/或生物治疗蛋白质以便捕获或澄清化。根据本发明的方法使用的共聚物包含疏水残基和阴离子残基。
发明背景
单克隆抗体（mAb）广泛用于临床用途、诊断系统和不同的研究领域。自1986年生产首个获批的mAb以来，利用哺乳动物细胞表达系统生产这些蛋白质已获得巨大发展。迄今，用于mAb生产的主要是三种不同的细胞系：中国仓鼠卵巢（CHO）、小鼠骨髓瘤（NS0）和Sp2/0细胞，同时在5000至25000升的生物反应器中进行生产。抗体和生物治疗蛋白质的下游处理一般使用一系列提纯步骤，以收获发酵罐的产物（例如使用碟片式离心机（disk stack centrifuge））开始，接着通过深度过滤系统和膜过滤系统澄清化。此后，使用几个色谱分离步骤，以最初使用亲和色谱法用蛋白质A捕获开始，接着是阴离子交换色谱法和阳离子交换色谱法。另外的色谱分离步骤可包括疏水或亲水作用色谱法和尺寸排阻色谱法。通过低pH洗脱实现病毒灭活，且附加的过滤除去残余病毒粒子。但是，与25年前的1g l^-1相比如今提高到10-13g l^-1的细胞培养表达水平以及提高的经济压力需要与现有色谱基系统的性能相比具有更高收率和吞吐量的增强的提纯方法。可通过提高色谱柱材料容量、柱尺寸或开发对色谱法的替代提纯方法来满足这些需求，它们应该获得相当的收率和纯度，但降低成本并且更好地规模化。对于大规模面积，已经开发出分批提纯法，其中从收获的细胞溶液中沉淀出所需蛋白质。蛋白质沉淀的常用方法因此是硫酸铵沉淀（AS）（Venkiteshwaran, Heider等人, 2008）、聚乙二醇（PEG）沉淀或使用辛酸作为沉淀剂（Wang, Diehl等人, 2009；Temponi, Kageshita等人, 1989）。但是，在大规模提纯中使用PEG或AS需要大量的这些沉淀剂和更高的蛋白质浓度，仅产生中等纯度级，生成高废物负荷。现有提纯方法昂贵、非常费力、具有大缓冲容积和低吞吐量（色谱法）或缺乏足够的纯度和收率（沉淀）。在低pH下从蛋白质A中洗脱结合的mAb可形成免疫原性聚集体，除去它们和沥滤蛋白质A进一步提高成本。因此，迫切需要对蛋白质A色谱法的替代方法以及对蛋白质和抗体提纯的改进。另外，抗体的片段抗原结合区在诊断学和治疗中的应用越来越受关注。为了获得这样的片段，可以使用内肽酶。用木瓜蛋白酶处理单克隆抗体是制造抗原结合片段或片段抗原结合的常见方式，也导致生成Fc片段，代表抗体的恒定区。可以使用蛋白质A亲和色谱法分离Fab和Fc，但是，由于蛋白质A与衍生自属于V_H3亚家族的mAb的Fab的结合亲合力，这种分离技术对这种类型的Fab而言无法胜任。人源化mAb极大依赖于具有V_H3丰度的基因序列。另外，人噬菌体展示库表现出V_H3's的大量存在。因此，需要用于分离Fab和Fc片段的替代策略。改性蛋白质A是一种选项，但相当成本密集。
最近寻求的方法是使用聚合物作为沉淀剂，其可用于更大量的抗体而不需要定制。
US 6,927,282公开了具有不同电荷密度的阴离子聚合物用于聚合物絮凝的用途。US 5,922,531涉及用聚合电解质层处理的可控孔径玻璃（controlled pore glass）用于蛋白质吸附的用途。WO 2008/079280公开了使用在某些条件下可溶并在条件改变时从溶液中沉淀出来的聚合电解质。
WO 2008/091740公开了聚阴离子或聚阳离子聚合物用于蛋白质沉淀的用途。
这表明使用聚合物作为沉淀剂的方法受到越来越多的关注。然而找出足够有效以适用于生物制药生产的方法仍成问题。此外，对不同目标分子调节和优化该程序仍成问题。
发明概述
已经发现，具有阴离子性质和疏水性质的聚合物 - 所谓的阴离子混合型聚合物 – 是用于蛋白质沉淀的理想聚合物。通过使用包含疏水基团和阴离子基团的聚合物，可以以高达90%的收率和更高的抗体回收率以良好纯度从澄清的细胞培养基中沉淀出抗体。
本发明因此涉及一种从样品中分离或离析目标分子的方法，其包括：
a) 提供所述样品
b) 将一种或多种包含疏水基团和阴离子基团的共聚物添加到所述样品中，由此形成目标分子-共聚物沉淀物
c) 从步骤b)的混合物中分离沉淀物。
在一个优选实施方案中，该共聚物包含35至65%阴离子基团。
在一个优选实施方案中，该阴离子基团包含磺酸、硫酸、羧酸和/或膦酸或磷酸。
在另一优选实施方案中，该疏水基团包含直链、支链或环状烷基、卤素取代的烷基、芳基、杂芳基和/或卤素取代的芳基或杂芳基。
在另一优选实施方案中，该共聚物具有10.000至120.000 g/mol的重均分子量和/或1,05-2,50的多分散性。
在一个优选实施方案中，该目标分子是抗体。
在另一优选实施方案中，该目标分子是抗体的Fc（片段恒定区）部分或Fab（片段抗原结合）区。
在一个优选实施方案中，在步骤a)中，将该样品的pH调节到目标分子的等电点以下和如果适用，应与其分离的该样品的其它组分的等电点以上的pH。
在一个优选实施方案中，在步骤a)中，将该样品的pH调节到4至5.5之间的pH。
在另一优选实施方案中，将该样品的离子强度调节到在20℃下测得的类似于17mS/cm或更低的电导率。
在另一优选实施方案中，在附加步骤d)中，将来自步骤c)的沉淀物再溶解。
在另一优选实施方案中，用二氧化硅或玻璃薄片处理步骤d)的再溶解混合物。
在另一优选实施方案中，该二氧化硅或玻璃薄片用DMAE和/或TMAE基团官能化。
附图
图1显示用于本发明的方法的共聚物的不同类型的合适结构单元的化学结构。
图2显示作为光谱叠加的中红外光谱以比较
a) 已用本发明的提纯技术处理的单克隆抗体Cetuximab（西妥昔单抗）
b) 未经沉淀的单克隆抗体Cetuximab的二级结构
并表明该抗体的二级结构在沉淀后没有明显改变。
图3显示
a) 未沉淀的单克隆抗体
b) 用本公开的提纯技术处理的沉淀和再溶解的单克隆抗体
在生物层干涉测量（BLI）后的传感图，
其表明沉淀和未沉淀抗体的结合亲合力没有差异。红线代表将数据全局拟合到1:1相互作用模型。使用Octet Red. Kinetics收集在含相同抗原的孔（6、4、3、2和1 nM）中测得的未沉淀和沉淀抗体的数据。
定义
在详细描述本发明之前，要理解的是，本发明不限于具体组成或方法步骤，因为这些可变。必须指出，除非上下文清楚地另行规定，本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数对象。因此，例如，提到“一配体”包括许多配体，提到“一抗体”包括许多抗体，诸如此类。
除非另行定义，本文所用的所有技术和科学术语具有如本发明所涉领域中的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所述，为本发明的目的定义下列术语。
本文所用的术语“目标分子”是指应与样品中的一种或多种其它组分，例如杂质隔离、分离或提纯的任何分子、物质或化合物。目标分子的实例是抗体、抗原结合片段（Fab）、片段恒定区（Fc）、蛋白质、肽、重组蛋白质、其它天然化合物、其它生物制药化合物、疫苗或生物制药化合物的聚集体。在一个优选实施方案中，该目标分子是生物分子，优选蛋白质。在一个非常优选的实施方案中，该目标分子是抗体。该目标分子通常是应通过采用本发明的方法分离的产物，但也可以使用本发明的方法沉淀不是待分离的产物的目标分子。在这种情况中，该目标分子是应除去的组分，而最终产物留在上清液中并通过除去目标分子来提纯。当利用本发明提纯和分离Fab和Fc片段时，沉淀的目标分子例如可以是想要的产物，但也可以使一种类型的片段沉淀，而想要的产物是留在上清液中的片段。在任一情况中，沉淀的组分都被称作目标分子。
术语“抗体”是指具有特异性结合到抗原上的能力的蛋白质。通常，抗体具有由两个重链和两个轻链构成的四多肽链基础结构，所述链例如通过链间二硫键稳定化。抗体可以是单克隆或多克隆的并可以以单体或聚合形式存在，例如以五聚形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚或多聚形式存在的IgA抗体。抗体还可包括多特异性抗体（例如双特异性抗体）和抗体片段，只要它们保留或被改性成包含配体特异性结合域。术语“片段”是指包含比完全或完整抗体或抗体链少的氨基酸残基的抗体或抗体链的一部分。可通过完全或完整抗体或抗体链的化学或酶法处理获得片段。也可以通过重组手段获得片段。当重组制造时，片段可能独自表达或作为所谓融合蛋白的更大蛋白质的一部分表达。示例性片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fc和/或Fv片段。示例性的融合蛋白包括Fc融合蛋白。根据本发明，术语“抗体”也包括融合蛋白。
如上论述，在一些实施方案中，抗体是含Fc区的蛋白质，例如免疫球蛋白。在一些实施方案中，含Fc区的蛋白质是包括融合到另一多肽或其片段上的免疫球蛋白的Fc区的重组蛋白质。示例性的多肽包括，例如，肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素α-链；胰岛素β-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands（血管性血友病）因子；抗凝血因子，如蛋白质C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES（调节活化的正常T细胞表达和分泌的因子）；人巨噬细胞炎性蛋白（MIP-1-α）；血清白蛋白，如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质；松弛素α-链；松弛素β-链；肾素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA）（例如CTLA-4）；抑制素；活化素；血管内皮生长因子（VEGF）；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨源性神经营养因子（BDNF）、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6（NT-3、NT-4、NT-5或NT-6）或神经生长因子，如NGF-β；血小板源性生长因子（PDGF）；成纤维细胞生长因子，如αFGF和βFGF；表皮生长因子（EGF）；转化生长因子（TGF），如TGF-α和TGF-β，包括TGF-βl、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II（IGF-I和IGF-II）；des(l-3)-IGF-I（脑IGF-I）、胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD 19 CD20、CD34和CD40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白（BMP）；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子（CSF），例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素（IL），例如IL-I至IL-IO；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，如CDl Ia、CDl Ib、CDl Ic、CD 18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如HER2、HER3或HER4受体；和任何上列多肽的片段和/或变体。此外，本发明的抗体是特异性结合到任何上列多肽上的任何蛋白质或多肽、其片段或变体。
如本文所用和除非另有说明，术语“样品”是指含有目标分子的任何组合物或混合物。样品可来自生物来源或其它来源。生物来源包括真核和原核来源，如植物和动物细胞、组织和器官。优选的样品来自细胞培养液，如哺乳动物细胞培养液，例如CHO、NS-0、SP2/0、BioWa，细菌细胞培养液，例如大肠杆菌、枯草杆菌，酵母细胞培养液或丝状真菌。该样品还可包括被发现与目标分子混合的稀释剂、缓冲剂、洗涤剂和污染物类、碎片等。该样品可以是“部分提纯的”（即已经过一个或多个提纯步骤，如过滤步骤）或可直接获自产生该目标分子的宿主细胞或生物体（例如该样品可包含收获的细胞培养液）。
如本文所用的术语“杂质”或“污染物”是指任何外来或可反感的分子，包括含有使用本发明的方法与一种或多种所述外来或可反感的分子分离的目标分子的样品中可能存在的生物大分子，如DNA、RNA、一种或多种宿主细胞蛋白、核酸、内毒素、脂质、合成来源的杂质和一种或多种添加剂。另外，此类杂质可包括在本发明的方法前进行的步骤中使用的任何试剂。
如本文中可互换使用的术语“提纯”、“分离”或“离析”是指通过从包含目标分子和一种或多种其它组分，例如杂质的组合物或样品中分离目标分子来提高目标分子的纯度。通常，通过从该组合物中（完全或部分）除去至少一种杂质来提高目标分子的纯度。
术语“色谱法”是指将相关被分析物（例如目标分子）与混合物中存在的其它分子分离的任何种类的技术。通常，由于该混合物的各分子在流动相的影响下穿过固定相的速率不同或在结合和洗脱法中将目标分子与其它分子分离。
术语“亲和色谱法”是指一种蛋白质分离技术，其中目标分子（例如含Fc区的相关蛋白质或抗体）特异性结合到该目标分子的特异性配体上。这样的配体通常被称作生物特异性配体。在一些实施方案中，该生物特异性配体（例如蛋白质A或其功能变体）共价结合在色谱基质材料上并在溶液接触色谱基质时可接触到溶液中的目标分子。目标分子通常在色谱分离步骤的过程中保持其对生物特异性配体的特异性结合亲合力，而该混合物中的其它溶质和/或蛋白质不明显或特异性结合到该配体上。目标分子结合到固定化配体上能使污染蛋白质或蛋白质杂质穿过色谱基质，而目标分子仍特异性结合到固相材料上的固定化配体上。然后在合适的条件（例如低pH、高pH、高盐、竞争性配体等）下以活性形式从固定化配体上脱除特异性结合的目标分子，并借助洗脱缓冲液穿过该色谱柱，不含更早就能穿过该柱的污染蛋白质或蛋白质杂质。任何组分都可用作用于提纯其各自的特异性结合蛋白（例如抗体）的配体。但是，在根据本发明的各种方法中，使用蛋白质A作为含Fc区的目标分子的配体。本领域普通技术人员容易确定从生物特异性配体（例如蛋白质A）中洗脱目标分子（例如含Fc区的蛋白质）的条件。在一些实施方案中，可以使用蛋白质G或蛋白质L或它们的功能变体作为生物特异性配体。在一些实施方案中，在5-9的pH范围内使用生物特异性配体，如蛋白质A以结合到含Fc区的蛋白质上，洗涤或再平衡该生物特异性配体/目标分子缀合物，接着用含有至少一种盐的具有大约或低于4的pH的缓冲液洗脱。
如本文中用于描述目标分子（例如含Fc区的蛋白质）和共聚物分子之间的相互作用的术语“结合”是指目标分子通过例如蛋白质和共聚物结构在结合位点的空间互补性与在结合位点的静电力、氢键合、疏水相互作用和/或范德华力相结合的联合效应通常可逆地结合到共聚物分子上。通常，在结合位点的空间互补性越大和其它力越强，蛋白质对其各自的配体的结合特异性越大。特异性结合的非限制性实例包括抗体-抗原结合、酶-底物结合、酶-辅助因子结合、金属离子螯合、DNA结合蛋白-DNA结合、调节蛋白-蛋白质相互作用等。理想地，在亲和色谱法中，在游离溶液中以大约10^"4至10^"8 M的亲合力发生特异性结合。
“缓冲液”是通过其酸-碱共轭组分的作用抵抗pH变化的溶液。根据缓冲液的例如所需pH，可用的各种缓冲液描述在Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)中。缓冲液的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵缓冲液以及这些的组合。
根据本发明，术语“缓冲液”用于具有下列作用的任何液体组合物
a) 用于调节含目标分子或本发明的范围内使用的任何其它分子的溶液的pH和/或离子强度或其它化学或物理属性，
b) 用于洗涤沉淀的目标分子或本发明的范围内使用的任何其它分子，
c) 用于再溶解沉淀的目标分子或本发明的范围内使用的任何其它分子。
根据本发明，术语“聚合”或“共聚物的合成”可互换使用并可能是指使用下列技术之一的共聚物或聚合物合成，但不限于此：自由基聚合、活性自由基聚合（ATRP、RAFT、NMP等）、阴离子或阳离子聚合、缩聚或任何种类的开环聚合。可以例如热、光化学、通过氧化还原反应或电化学引发自由基聚合。
根据本发明，单体比率是该共聚物中存在的一种单体类型与该共聚物中存在的所有其它单体类型的摩尔比。
根据本发明，共聚物的分子量以通过凝胶渗透色谱法（用于测定共聚物的分子量的标准方法，因此是本领域技术人员已知的）测得的重均分子量（在本发明中提到共聚物时，缩写为Mw）给出。根据本发明，术语多分散性是给定共聚物的重均分子量与数均分子量的比率。
“脂族”或“脂族基团”是指任选取代的非芳烃部分。该部分可以是例如直链、支链或环状的（例如单环或多环，如稠合、桥连或螺稠合的多环）或它们的组合。除非另有规定，脂族基团含有1-30个碳原子，优选1至20个碳原子。优选的脂族基团是烷基。
本文所述的“烷基”优选是在主链中含有1至20个碳原子，优选1至8个碳原子和总共最多30个碳原子的低碳烷基。它们可以是直链、支链或环状的并包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。
术语“芳基”是指具有总共5至14个环成员的任选取代的单环、双环和三环环体系，其中该体系中的至少一个环是芳族的且其中该体系中的各环含有3至7个环成员。优选的是在环部分中含有6至12个碳的单环或双环基团，如苯基、联苯基、萘基、取代苯基、取代联苯基或取代萘基。
“疏水基团”是在代替氢原子共价连接到一个分子，如单体或聚合物上时提高该分子的疏水性的部分，如取代基或残基。
发明详述
共聚物的合成/性质
根据本发明，共聚物是由至少两种不同类型的单体构成的聚合物。优选地，该共聚物是线性的并可溶于水和水性缓冲液（优选在生理盐条件下，包含例如在20℃下测得的10-20 mS/cm的电导率）。本发明的方法中所用的共聚物包含至少一种类型的阴离子基团和至少一种类型的疏水基团。在一个实施方案中，其仅含阴离子基团和疏水基团。根据本发明，术语“阴离子基团”是指该共聚物中存在的带负电荷的基团。对于本领域技术人员显而易见的是，该阴离子基团的电荷仅在一定pH条件下存在，但在不带电状态下，该阴离子基团能够例如在除去亲电体（例如质子(H(+))，例如以依赖于pH的方式）后变得带阴离子电荷。该阴离子基团能发生静电相互作用并可以是强离子交换剂、弱离子交换剂和/或能络合金属离子。阴离子基团可以是但不限于下列官能团之一：磺酸和它们的盐–SO₃^-、硫酸酯/酰胺和它们的盐–SO₄^-、-NHSO₃^-、膦酸-PO₃^2-、磷酸酯和它们的盐–PO₄^2-、羧酸和它们的盐-COO^-。适用于在该共聚物中引入阴离子基团的单体单元的实例是2-丙烯酰胺基(Acylamido)-2-甲基丙磺酸（AMPS）、乙烯基磺酸VS、苯乙烯磺酸或(甲基)丙烯酸。
该疏水基团可以是直链、支链或环状脂族基团、卤素取代的脂族基团、芳基、杂芳基或卤素取代的芳基。适用于在该共聚物中引入疏水基团的单体单元的实例是苄基丙烯酰胺（BzAAm）或甲基丙烯酸苄酯（BzMA）、N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）、丙烯酸丁酯或丙烯酸叔丁酯。在一个优选实施方案中，该疏水基团用阴离子基团，如磺酸、羧酸或膦酸进一步官能化。这种官能化疏水基团的一个实例是苯甲酸。适用于在该共聚物中引入官能化疏水基团的单体单元的一个实例是4-(丙烯酰胺基)苯甲酸（4-ABZ）。
本发明的共聚物通常包含共聚物骨架，该阴离子基团和疏水基团连接在其上。通常通过单体单元的聚合来合成该共聚物。共聚物骨架可以是可通过任何类型的聚合，如自由基聚合（例如自由基聚合、活性自由基聚合（ATRP、RAFT、NMP等）、阴离子或阳离子聚合、缩聚或任何种类的开环聚合制成的任何聚合物。可以例如热、光化学、通过氧化还原反应或电化学引发自由基聚合。典型的聚合物骨架可以是，但不限于：乙烯基聚合物（例如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯基吡啶、聚乙烯基吡咯烷酮）、聚醚（例如聚乙二醇或聚环氧乙烷）、聚酯、聚酰胺。
在式I至IV中，给出可能的共聚物的示意性图式。该共聚物可以是无规或嵌段共聚物，优选无规。适用下列定义：
R = 聚合物骨架
R’ = 该聚合物中可能存在或不存在的间隔基
F = 官能团（F1 = 阴离子基团，F2 = 疏水基团，F3和F4 = 彼此独立地为任何官能团或-H，
n >0，m >0，l ≥ 0，k ≥ 0
            I
                                                  II
                                                 III
                                                 IV
在表1中，限定该聚合物的聚合物骨架(R)和侧基的合适实例，由此所谓的侧基由官能团(F)和间隔基(R’)构成或如果不存在间隔基(R’)，仅由官能团(F)构成。
在一个优选实施方案中，用于合成该共聚物的各单体单元具有至少一个疏水基团或一个阴离子基团。
表1: 聚合物的结构单元

用至少由AMPS和4-ABZ以及AMPS和BzAAm制成的共聚物可获得极好结果。
可用于本发明的方法的共聚物通常具有大约一千（1000）g/mol至大约1,100,000 g/mol的重均分子量和/或1,05-2,5的多分散性。本发明的共聚物可作为包含相同类型的单体单元但具有宽链长范围，即大约1000 g/mol至大约一百万（1,000,000）g/mol的重均分子量范围，优选具有1,05-2,5的多分散性的共聚物混合物使用。该混合物也可具有窄的重均分子量范围，例如大约35.000至大约45.000 g/mol，或大约50.000 g/mol至大约55.000 g/mol，优选都具有1,05-2,5的多分散性。可以在单体单元的特定聚合条件，如浓度、聚合引发剂或催化剂、温度或时间下控制重均分子量和分子量分布状况。该共聚物的重均分子量优选为10.000至120.000 g/mol，最优选35.000至60.000 g/mol，优选具有1,05-2,5的多分散性。
在阴离子基团和疏水基团的总数中，通常10至90%的基团是阴离子基团。阴离子基团和疏水基团的总数的优选35至65%，最优选45至60%是阴离子基团。
可以合成该共聚物以具体符合选择性沉淀各种目标分子的要求，例如通过使用具有指定分子量、链长或指定疏水程度和组成的共聚物。
沉淀法
本发明的方法涉及使用包含阴离子基团和疏水基团的共聚物提纯通常存在于生物制药样品中的目标分子。在将该共聚物添加到样品溶液中时，该共聚物结合到目标分子上并沉淀。为了获得最佳沉淀结果，提供该样品并调节至一定的条件，如目标分子浓度、pH和离子强度。这可以在添加该共聚物之前进行或同时进行。已经发现，使用根据本发明的方法的共聚物，即使该样品具有高离子强度（在20℃下测得的最多22,5 mS/cm的电导率），也可以实现良好的沉淀结果。通常，应该使用适当的稀释方法将该样品的离子强度调节到0mS/cm至22,5mS/cm的电导率，优选调节到0mS/cm至17mS/cm的电导率，在20℃下测定电导率。不同于许多已知的程序，本发明的方法甚至在20℃下测得的在10mS/cm至22,5mS/cm的电导率之间的离子强度下也能有效沉淀目标分子。可以使用适当的稀释技术或缓冲液交换技术改变或降低离子强度。
在具体情况中，尤其是在单克隆抗体的酶法处理后将Fab与Fc区分离时，可能要求将离子强度调节到8mS/cm至22,5mS/cm的电导率以便能够选择性沉淀。优选地，为了将Fab与Fc区分离，将离子强度调节到9mS/cm至18mS/cm，最优选10至16 mS/cm的电导率。
优选使用适当的方法调节pH以实现比目标分子的等电点（pI）低的pH，和如果适当，比杂质蛋白或大多数杂质蛋白的等电点高的pH。已经发现，通常应该将pH调节到4至7，优选调节到4至5.5。尤其在从细胞培养液，如NS0、CHO-S或SP2/0细胞培养液中沉淀具有7至9的等电点的单克隆抗体时，4至5.5的pH，尤其是5.0至5.2的pH非常合适。
在具体情况中，尤其是在单克隆抗体的酶法处理后将Fab与Fc区分离时，将pH调节到4至5.5的pH，尤其是5.0至5.2的pH是非常合适的。
用于本发明的方法的共聚物的量取决于样品中存在的目标分子的量。通常，在每毫克目标分子使用0.2至1.2毫克共聚物时可获得良好结果。优选地，每毫克目标分子加入0.35至0.9毫克共聚物。
为了实现最佳沉淀，在将该共聚物添加到样品溶液中后，优选培养该混合物。典型培养时间为10分钟至2小时。优选在培养期间，例如在摇振器上或借助搅拌器搅动该混合物。
此后，将包含该目标分子和该共聚物的共沉淀物与上清液分离，例如通过过滤、沉降、离心或任何其它手段。通常，随后对包含目标分子的共沉淀物施以用于分离或进一步提纯目标分子的附加工艺步骤。但也可以对上清液施以附加工艺步骤。例如在目标分子是应从样品中除去的已知物质（例如抗体的Fc区），但是要从样品中最终分离和提纯的产物是在实施本发明的方法后存在于上清液中的另一分子（例如抗体的Fab区）的情况下。
但在大多数情况中，已通过添加该共聚物沉淀的目标分子是应该进一步提纯的化合物。在这种情况中，包含目标分子的共沉淀物可以例如用酸性缓冲液洗涤一次或数次。该洗涤缓冲液优选具有与将该共聚物添加到样品中后获得的混合物相同的pH和相同或更低的离子强度。
然后可以再溶解该共沉淀物。这可以在pH比目标分子的等电点低大于1个pH单位的水性缓冲液中进行。具有7至9的pH的缓冲液通常用于再溶解该共沉淀物，例如Tris-缓冲液pH 8,0或K-Na-Phosphate缓冲液pH 7,4（PBS）。可以例如通过摇振或搅拌，例如在300至600 rpm下摇振5至20分钟来辅助再溶解。
在本发明的一个实施方案中，为了获得高纯目标分子，在本发明的方法的附加步骤中，可以从包含再溶解的共沉淀物的溶液中除去该共聚物。这可以通过几种方法进行，如色谱法，例如阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、疏水作用色谱法、亲水作用色谱法或亲和色谱法。也可以通过添加沉淀剂使该共聚物再沉淀。合适的沉淀剂是例如聚合电解质共价连接到其上的珠粒。聚合电解质是其重复单元带有电解质基团的聚合物。聚阳离子和聚阴离子是聚合电解质。合适的珠粒的实例是例如玻璃珠粒、二氧化硅珠粒或聚合物珠粒。合适的聚合电解质是例如能够实现H-键合的阳离子聚合电解质、混合型聚合电解质、疏水聚合电解质或亲水聚合电解质。
例如在US 5,922,531中公开了合适的珠粒。
在一个优选实施方案中，该珠粒是玻璃或二氧化硅珠粒，更优选玻璃或云母或二氧化硅薄片。已经发现，具有0.8至1.2 cm/min的沉降速度的玻璃或二氧化硅薄片尤其适用于该再沉淀。通常，具有10-200微米直径和100至1000纳米厚度的二氧化硅或玻璃薄片表现出这种合适的沉降速度并尤其适用于使该共聚物再沉淀。在一个优选实施方案中，该玻璃或二氧化硅珠粒以及其它类型的珠粒用阳离子基团或阳离子和疏水或亲水基团官能化。优选通过阳离子聚合电解质或具有阳离子和疏水或亲水官能的聚合电解质的共价键合实现该官能化。
尤其优选的是包含TMAE或DMAE的聚合电解质。
通常将该珠粒添加到再悬浮的目标分子-共聚物溶液中以达到该珠粒或薄片在最终混合物中0.0001至0.5毫克/毫升的最终浓度。
通常在将该溶液的pH调节到pH 7.0-8.5后将该珠粒添加到再悬浮的目标分子-共聚物溶液中。
在例如通过离心、沉降或过滤除去附带着共聚物的珠粒后，获得包含高纯目标分子并且完全或几乎没有共聚物污染的上清液。通常，与样品内的初始共聚物浓度相比，使用这些二氧化硅薄片可以除去>90%（重量/重量）的共聚物。通过调节这些二氧化硅薄片的浓度，与样品内的初始共聚物浓度相比，可以除去通常>95%（重量/重量）至99%（重量/重量）的共聚物。
本发明的方法减少杂质并防止后续提纯步骤，如色谱法、过滤或离心的堵塞。本发明的方法可通过选择性沉淀和随后以指定体积再溶解来浓缩(up-concentrate)目标分子，以实现最多100的浓缩系数，由此提高后续提纯步骤的加工时间和降低色谱法的工作负荷（小时/千克在色谱法中提纯的目标分子）。
尽管现有技术中公开的用于沉淀的聚合物通常产生高提纯收率，但如这些公开文献中所示，其仅在低至5mS/cm或更低电导率的离子强度下才能充分发挥作用。
但是，这种限制要求在聚合物用于沉淀之前稀释细胞培养液，例如与25000升初始细胞培养液相比，增加至75000升和更多的稀释细胞培养液。
这些大体积需要在提纯后热处理（tempered）、储存并具有高废物负荷，这些都导致高成本。
与这些限制和缺点相比，本发明的方法允许用户使用专门优化的共聚物以甚至在与生理盐条件类似的离子强度下获得目标分子的高收率和纯度。由此不需要过度预稀释步骤。
本发明可以部分或完全替代生物制药或重组蛋白的提纯中迄今使用的提纯步骤，以带来同等或更好的收率、提纯时间、效率、纯度。
上下文中引用的所有申请、专利和出版物和2012年12月20日提交的相应EP申请EP 12008475.1的整个公开内容经此引用并入本文。
实施例
下列实施例代表用于获得本发明的方法中所用的共聚物的可能的合成步骤。
实施例1a:
将4.92克2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸和6.82克4-丙烯酰胺基苯甲酸溶解在300毫升水/DMF（1/1）和3.4毫升NaOH溶液（32%）的混合物中。该溶液用氮气脱气。将溶解在脱气水中的0.436克过氧二硫酸钠添加到该溶液中。将温度提高到80℃。反应时间为5小时。将反应混合物冷却至室温并暴露在空气中。用旋转蒸发器除去溶剂。将该固体聚合物再溶解在水中并在2-丙醇中沉淀。过滤并干燥该聚合物。重均分子量为大约Mw = 100 000 g/mol，多分散性为1.3。
实施例1b:
与实施例1a相同，但使用Sephadex?柱（交联葡聚糖凝胶）提纯聚合物。用5 x 5毫升水洗涤该柱，“注入”2,5毫升反应混合物并用3,5毫升水洗涤该柱。收集洗出液并用7 x 5毫升水再平衡。将该程序重复3次。使用旋转蒸发器从洗出液中除去溶剂并将该聚合物干燥。
实施例1c:
与实施例1a相同，但通过渗析或切向流过滤法提纯。在反应后，将该混合物冷却至室温并用旋转蒸发器除去溶剂。将该固体聚合物再溶解在水中并借助使用例如12 000 – 14 000 Da的适当MWCO的渗析或切向流过滤提纯该聚合物。
实施例2a:
将4.92克2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸和6.82克4-丙烯酰胺基苯甲酸溶解在300毫升水/DMF（1/1）和3.4毫升NaOH溶液（32%）的混合物中。加入95微升1-丁硫醇（作为链转移剂）。该溶液用氮气脱气。将溶解在脱气水中的0.436克过氧二硫酸钠添加到该溶液中。将温度提高到80℃。反应时间为5小时。将反应混合物冷却至室温并暴露在空气中。用旋转蒸发器除去溶剂。将该固体聚合物再溶解在水中并在2-丙醇中沉淀。过滤并干燥该聚合物。重均分子量为大约Mw = 55 000 g/mol，多分散性为1.16。
实施例2b:
与实施例2a相同，但加入380微升1-丁硫醇。所得聚合物的重均分子量为大约Mw = 35 000 g/mol，多分散性为1.6。
实施例3:
与实施例1相同，但使用不同的摩尔单体比率：