具有超强抗癌活性的总草苔虫内酯的提取分离方法 本发明涉及采用乙醇提取法和层析法从海洋生物草苔虫中提取分离的总草苔虫内酯，抗肿瘤活性试验显示对K562肿瘤细胞具有超强的抗癌活性。
草苔虫又称苔藓虫，属真体腔动物，是海洋底栖动物的重要组成之一。最常见的种是总合草苔虫Bugula neritina(Linnaeus,1758)。其群体常附着于船底、鱼排及网箱等水下设施上，是海洋主要污损物之一。1982年美国亚利桑那州立大学Pettit教授领导的研究小组成功地从生长于加利福尼亚海域的总合草苔虫中分离到第一个具有抗癌活性单体，用X-单晶衍射法确定了它的化学结构，为一大环内酯类化合物，并命名为草苔虫内酯1(bryostatin 1)。此后，美国和日本学者又相继发现了18种此类成分(bryostatin 1～18)，(详见：1.G.R.Pettit,et al,Tetrahadron,47(22):3601,1991；2.G.R.Pettit,et al,J.Nat.Prod.,59:286,1996)。我们从中国南海产的总合草苔虫中分离鉴定了一种新的草苔虫内酯，命名为草苔虫内酯19(bryostatin 19)，(详见：林厚文等，中国海洋药物，17(1):1,1998)。其中bryostatin 1在美国已进入临床试验，是极有希望的新型抗癌药物。
本发明目的在于利用中国的海洋生物资源，应用新的提取分离方法提取分离出总草苔虫内酯成分，确定其抗癌活性，为研究开发新的抗癌药物提供科学依据。
本发明是以中国南部海域大量生长的总合草苔虫为原料，经溶剂提取，配合多种层析方法进行分离，得到总草苔虫内酯。具体方法如下：将风干地草苔虫用95％乙醇在室温下浸渍提取或加热回流提取，乙醇提取液减压浓缩至浸膏状，加入3～5倍量的90％甲醇混悬，混悬液先以石油醚萃取数次脱酯，经萃取后的混悬液加入计算量的蒸馏水，使成40～60％甲醇混悬液，以醋酸乙酯萃取，得醋酸乙酯萃取液，为活性有效部位。该有效部位先经硅胶柱层析，以甲醇∶二氯甲烷梯度洗脱(0～10％)，用薄层检测进行跟踪，收集含有草苔虫内酯的流份，再经一次硅胶柱层析，用石油醚∶丙酮(5∶1→1∶1)或用石油醚∶乙酸乙酯(3∶1→1∶1)洗脱。然后经Sephadex LH-20柱层析，以正己烷∶二氯甲烷∶甲醇(4∶5∶1)或用二氯甲烷∶甲醇(1∶1)为洗脱剂，进行洗脱，收集含草苔虫内酯流份，最后经ODS反相硅胶快速柱层析，以50-100％甲醇梯度洗脱，收集含草苔虫内酯流份，减压浓缩，得浅黄色粉末，即总草苔虫内酯。硅胶柱层析和ODS反相柱层析可视具体情况增减次数。
总草苔虫内酯用高效液相层析仪进行检测，显示有9种不同的大环内酯。检测条件如下：Waters 510高效液相色谱仪，PAD996紫外检测器，Partisil 100DS-2层析柱(9.5×500mm),85％甲醇为洗脱剂，流速2ml/min，检测波长228.7nm。检测结果如图1。图1为总草苔虫内酯高效液相色谱峰图图中各峰所代表的草苔虫内酯如下：1．bryostatin-11 2．bryostatin-63．bryostatin-5 4．bryostatin-185．bryostatin-19 6．bryostatin-87．bryostatin-10 8．bryostatin-49．bryostatin-16Bryostatin 18 (4) Bryostatin 16 (9)Bryostatin 19 (5)Bryostatin 11 (1): R1=OCCH3, R2=HBryostatin 6 (2): R1=OCCH2CH2CH3,R2=OCCH3Bryostatin 5 (3): R1=OCC(CH3)3,R2=OCCH3Bryostatin 8 (6): R1=OCCH2CH2CH3,R2=OCCH2CH2CH3Bryostatin 10 (7): R1=OCC(CH3)3,R2=HBryostatin 4 (8): R1=OCC(CH3)3,R2=OCCH2CH2CH3
总草苔虫内酯体外抗癌活性试验由上海药物所肿瘤药理室完成，实验结果表明对K562人红白血病细胞具有超强抑制作用，IC50＜1×10-15μg/ml，对U937人单核粒细胞白血病亦有一定的抑制活性，IC50平均为1.7μg/ml。实验数据如下。
表1 总草虫内酯体外对K562细胞抗癌试验结果用药组各药物浓度下的活细胞数(×104/ml) 抑制率(％) IC50空白对照10 1 103 10-6 10-9 10-12 10-1510 1 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 (μg/ml)总草苔虫 内酯羟基喜树碱(阳性对照) 75 0 3.7 5.3 9.3 17.0 19.7 29.3 75 0 0 57.7100 95 93 88 77 73 61 ＜1×10-15100 100 23 1.04×10-3
表2 总草虫内酯体外对U937细胞抗癌试验结果 组号各药物浓度下的活细胞数(×104/ml) 抑制率(％) IC50空白对照50 10 5 1 0.5 50 10 5 1 0.5(μg/ml) 1 2 3 43 0 8 23 32 35 53 0 5 14 32 40 47 0 13 21 27 39 100 81 47 25 19 1.9 100 90 74 40 15 1.4 100 72 55 42 17 1.8
实验方法：采用台盼兰排染法，于96孔板中每孔加入1.2×104/ml浓度的肿瘤细胞，分别加入不同浓度的药物作用72小时后用台盼兰计数活细胞数。抑制率=(对照组细胞数-用药组细胞数)÷对照组细胞数×100％。
本发明具有如下优点和积极效果：
本发明采用的乙醇提取和醋酸乙酯萃取法成本低，方法简便，所得的总草苔虫内酯纯度高，可达95％以上。总草苔虫内酯对K562肿瘤细胞显示的超强抑制作用，迄今尚未见过报道，其作用强度是单体内酯的约1012倍，可认为是天然产物中对K562肿瘤细胞作用最强的化学成分。因此，将可用于新的抗癌药物的研制，有助于海洋药物资源的开发利用。
实施例1：总合草苔虫70kg(经风干)，以5倍量95％乙醇冷浸3次，每次冷浸1周，合并醇提取液，减压回收乙醇，得醇浸膏，加入10升90％甲醇水液使混悬，用石油醚萃取5次，每次200ml，醇液加计算量的水，使成50％乙醇液，以醋酸乙酯萃取5次，每次200ml，得醋酸乙酯萃取液，减压回收，得浸膏240g。取60g浸膏进行硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇梯度洗脱(1∶0→1∶9)，收集含草苔虫内酯流份，得浸膏9.8g，浸膏再经Saphadex LH-20凝胶柱层析(3.8×100cm)，二氯甲烷∶甲醇(1∶1)洗脱，流速60～80ml/h，收集到总草苔虫内酯2.35g。再经ODS反相硅胶快速柱层析，以50％→80％甲醇梯度洗脱，收集到总草苔虫内酯1.2g，为浅黄色粉末，得率1.7/10万。
实施例2：总合草虫13kg(经风干)，以95％乙醇提取3次，每次1周，回收乙醇，得醇浸膏815g，混悬于90％甲醇水液，以石油醚萃取5次，每次300ml，甲醇液加水至34％甲醇水液，以醋酸乙酯萃取5次，每次800ml，萃取液经活性炭和氧化铝脱色，回收溶剂，得浸膏6g，硅胶柱层析，以二氯甲烷→二氯甲烷∶甲醇(9∶1)梯度洗脱，收集草苔虫内酯流份，重复一次硅胶柱层析，以石油醚∶醋酸乙酯(3∶1→1∶1)梯度洗脱，得总草苔虫内酯0.3g。再经Saphadex LH-20凝胶柱层析，二氯甲烷∶甲醇(1∶1)洗脱，收集到总草苔虫内酯180mg，得率1.4/10万。