一类磷脂酶甲2的抑制剂及其制备方法和用途 本发明涉及一类磷脂酶甲2的抑制剂及其制备方法和用途。
磷脂酶甲2(磷脂酶A2,PLA2 E.C.3.1.1.4)是一种专一性的水解磷脂sn-2脂键生成脂肪酸和溶血磷脂的一类酶。有关该类酶的文献[W.Pruzanski &P.Vadas Immunology Today.12(5):143,1991,J.S.Bomalaski et al.Arthritisand Rheumatism.36(2):190,1993]报道表明,从关节炎患者的关节滑液中提取、纯化得到的磷脂酶甲2在关节炎发作过程中起关键性作用,设想,如果有一种制剂,能消除或抑制磷脂酶甲2的作用,可能会阻断发炎过程,缓解关节的肿胀和疼痛,从而这种制剂很有可能成为一种治疗类风湿性关节炎的有效药物。目前,对风湿性关节炎尚无十分有效的药物,为此,对磷脂酶A2的抑制剂的设计和合成的研究成为药物界的热点之一[《新医学》施桂英,类风湿关节炎的药物治疗进展,24(5):234,1993]。
近年来,人们对磷脂酶A2抑制剂的研究,主要集中在设计与合成酶的底物类似物上,即合成能与底物竞争的一类化合物来抑制酶的活性[Beaton,P.P.,Bennion,C.,Connolly,S.,et al.J.Med.Chem.37,557-559(1994);Cha.S.S.,Lee,D.,J.Med.Chem.39,3878-3881(1996)]。在对磷脂酶A2抑制剂的研究中发现,由于疏水性和亲水性基团的共存,药物的代谢会受到影响,使该类底物类似物在临床上用作磷脂酶A2抑制剂有一定困难。自然人们会想到,发展和使用非底物类似物作为磷脂酶A2的抑制剂,但这方面的文献报道极少,只有美国Eli Lilly公司[Bach;Nicholas J.;Dillard;Robert D.;Draheim;Susan E.USP 5,654,326(1997);5,919,810(1999)],通过Echerichia coli膜测定法大规模筛选出先导化合物indolel,并以hnps-PLA2为靶酶,对indolel进行了结构改造得到了一系列吲哚类衍生物,活性最好的化合物比先导化合物抑制活性高6500倍,故可将之发展为吲哚衍生物类磷脂酶A2的抑制剂。国内在对磷脂酶A2抑制剂方面地研究尚属空白。
本发明的目的是设计并合成小分子非底物类似物,用作磷脂酶A2的抑制剂。根据磷脂酶A2的结构及其配体的相互作用进行了抑制剂的设计,并发展出了一种新的预测酶——配体复合物亲和性的方法,在此基础上发展了SCORE程序。应用SCORE程序考核所设计的稠杂环化合物,识别该类抑制剂与磷脂酶A2作用的三个重要位点。本发明按照上述三个与靶酶作用的位点,从生物等排原理出发,进行分子结构设计并合成了一类新的目标化合物,预期其成为有效的磷脂酶A2的抑制剂。
本发明的磷脂酶A2的抑制剂包括通式(I)所示的化合物:
式中的Y代表:-OH、-O(C1-C3烷基)、-NH2或-NHNH2;
式中的R代表:氢、C1-C8的烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C6环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C6环烷氧基、C1-C8的烯基、C1-C8的炔基、芳基、芳烷基、芳氧基、卤素、羟基、羧基、硫羟基、氰基、肼基、酰肼基、硝基、-NR2R3或-CONR2R3,或者代表下式的基团(II):
-Z-(-CR4R5-)p-Q (II)
上述的R2R3相同或不同,各自代表:氢、1-8个碳的烷基、1-8碳的羟烷基、或者R2和R3与氮形成5-8元杂环;
基团(II)中的R4R5相同或不同,各自代表:氢、1-8个碳的烷基、羟基、或者R4和R5一起代表=O;
基团(II)中的Z代表:一化学单键、1-8个碳的烷基取代的-N-、-NH-或-S-;
基团(II)中的Q代表:-CONR2R3、-SO3H、-COOR6;
基团(II)中的R6代表:氢、1-8个碳的烷基或金属;p代表:1-5的正整数。
这是一类喹啉基-4-或2-、6-位取代的喹啉基-4-乙酸及其衍生物酯、酰胺或酰肼类化合物。以该类化合物作为磷脂酶A2抑制剂,其体外测试结果达到或超过前述的吲哚类参照物,动物试验显示较好的活性。
本发明的磷脂酶A2的抑制剂的制备方法,所述的制备方法包括以下合成路线:
式中的R代表:氢、C1-C8的烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C6环烷基、C1-C8烷氧基、C3-C6环烷氧基、C1-C8的烯基、C1-C8的炔基、芳基、芳烷基、芳氧基、卤素、羟基、羧基、硫羟基、氰基、肼基、酰肼基、硝基、-NR2R3或-CONR2R3,或者代表下式的基团(II):
-Z-(-CR4R5-)p-Q (II)
上述的R2R3相同或不同,各自代表:氢、1-8个碳的烷基、1-8碳的羟烷基、或者R2和R3与氮形成5-8元杂环;
基团(II)中的R4R5相同或不同,各自代表:氢、1-8个碳的烷基、羟基、或者R4和R5一起代表=O;
基团(II)中的Z代表:一化学单键、1-8个碳的烷基取代的-N-、-NH-或-S-;
基团(II)中的Q代表:-CONR2R3、-SO3H、-COOR6;
基团(II)中的R6代表:氢、1-8个碳的烷基或金属;p代表:1-5的正整数。
此合成路线所用的化学物质皆为市售的产品,进行反应时,所采用的操作方法和操作步骤以及反应条件和中间体等,都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的有机合成方法设计实施的,并公开于各实施例中。同时,反应式中的化合物(10)中的氨基可以转化为烷氧基、肼基、羟基,这是本技术领域的普通技术人员很容易做到的。
本发明的磷脂酶A2的抑制剂的特点和优异效果:
1本发明的磷脂酶A2的抑制剂是一类新的化合物。
2其活性测试结果显示,该类化合物具有较好的体外活性和动物活性,优于前述的吲哚类化合物。
3其合成路线易于实施,产品容易处理。
本发明的磷脂酶A2的抑制剂的用途:
本发明的磷脂酶A2的抑制剂可作为医治炎症的抗炎药物使用,包括用于治疗关节炎,类风湿性关节炎,胰腺炎,过敏性鼻炎等,也可以用于防治败血性休克或成人呼吸窘迫综合症,支气管哮喘以及用于医治劳损、扭伤等。该抑制剂可以单独使用或者加入赋形剂制成片剂、栓剂、胶囊、喷雾剂或注射液等使用。
为了更清楚地说明本发明,列举以下实施例,但其对本发明的范围无任何限制。
实例1
2-苯氧基-6-甲氧基-4-甲基喹啉(4-1)的合成
将苯酚4.7克(0.05mol)与氢氧化钾420毫克(0.0075mol)混合在一起,加热至115~120℃制成酚钾,加入2-氯-6-甲氧基-4-甲基喹啉1.04克(0.005mol),升温至150~160℃反应,TLC跟踪至2-氯-6-甲氧基-4-甲基喹啉点消失。降温至100℃,加入含0.0425mol氢氧化钾的20ml水溶液,搅拌40分钟,形成粘稠物。加水30ml,粘稠物成为固体,抽滤,水洗涤至中性,然后将固体风干,用石油醚(30~60℃)重结晶,得1.07克无色针状晶体,产率80.8%,熔点:75~77℃,MS:m/z266(MH+),1HNMR(CDCl3):2.63(s,3H,-CH3),3.93(s,3H,-OCH3),6.88(s,1H,3-H),7.16(d,J=1.8Hz,1H,5-H),7.19~7.22(m,3H,Ph-H),7.29(dd,J=7.8Hz,1.8Hz,7-H),7.38~7.43(m,2H,8-H,Ph-H),7.81(m,1H,Ph-H)
用此法也可制得2-苯氧基-4-甲基喹啉(4-2),产率71.9%,熔点:46~48℃
实例2
2-苯氧基-6-甲氧基-4-苯乙烯基喹啉(5-1)的合成
将2-苯氧基-4-甲基喹啉2.65g(10mmol)与5ml苯甲醛一起加热,于115~120℃加入无水氯化锌300mg,升温至回流,TLC跟踪至2-苯氧基-6-甲氧-4-甲基喹啉反应完全,减压蒸除过量的苯甲醛,残留物用氯仿溶解,减压柱层析得无色固体产物710mg,产率20.1%,熔点:134~136℃,MS:m/z353(M+),1HNMR(CDCl3):3.95(s,3H,-OCH3),7.22~7.69(m,15H,3-H,5-H,7-H,olefin-H,Ph-H),7.88(d,J=8.7Hz,8-H)
用此法也可制得2-苯氧基-4-苯乙烯基喹啉(5-2),产率47.3%,熔点:119~121℃,MS:m/z323(M+)
实例3
2-苯氧基-6-甲氧基-4-甲酰基喹啉(6-1)的合成
将2-苯氧基-6-甲氧基-4-苯乙烯基喹啉353毫克(1mmol)、水1毫升与二氧六环3毫升加入反应器中,室温下加入四氧化锇(1%mol催化量),反应液逐渐变为黑色,70分钟内,在24-26℃加入高碘酸钠1.32克(6mmol),室温反应22~24小时,有黄色固体生成,将反应液倒入冰水中,析出固体,收集,干燥待用。粗产率74.6%,用甲醇重结晶,熔点:193~194℃,MS:m/z279(M+),1HNMR(CDCl3):3.89(s,3H,-OCH3),7.06(d,1H,J=2.1Hz,5-H),7.14(s,1H,3-H),7.20~7.32(m,3H,Ph-H),7.39(dd,J=8.1Hz,2.1Hz,7-H),7.43~7.56(m,3H,8-H,Ph-H),8.9(s,1H,CHO-H)
用此法也可制得2-苯氧基-4-甲酰基喹啉(6-2),产率80.4%,熔点:166~168℃,MS:m/z249(M+)
实例4
2-苯氧基-6-甲氧基-4-羧基喹啉(7-1)的合成
将2-苯氧基-6-甲氧基-4-甲酰基喹啉0.279g(1mmol)加入5毫升无水乙醇中,室温下加入含硝酸银0.414g(2.45mmol)的0.5毫升水溶液,再逐滴加入含氢氧化钠0.36g(9mmol)的5毫升水溶液,溶液呈深黑色。室温搅拌24小时后,滤去不溶物,乙醚萃取三次,水层用盐酸酸化,收集生成的固体,干燥待用。粗产率95.6%,熔点:>260℃,MS:m/z 295(M+)
用此法也可制得2-苯氧基-4-羧基喹啉(7-2),熔点:>260℃,MS:m/z265(M+)
实例5
2-苯氧基-6-甲氧基-4-氯甲酰基喹啉(8-1)的合成
将2-苯氧基-6-甲氧基-4-羧基喹啉0.295g(1mmol)与2毫升草酰氯在室温下加入反应瓶中,室温搅拌24小时后,加入无水苯,减压蒸馏带走过量的草酰氯,产物用无水石油醚(60~90℃)重结晶。
用此法也可制得2-苯氧基-4-氯甲酰基喹啉(8-2)
实例6
2-苯氧基-6-甲氧基-4-重氮甲基甲酰基喹啉(9-1)的合成
将2-苯氧基-6-甲氧基-4-氯甲酰基喹啉0.314g(1mmol)与无水乙醚混合,于0℃逐滴加入含0.126g(3mmol)重氮甲烷的无水乙醚溶液,生成白色固体。TLC跟踪至反应完成,过滤,用少量石油醚洗涤沉淀,得粗产品。粗产率92.0%,用二氧六环重结晶。熔点:154~156℃,MS:m/z320(MH+),1HNMR(CDCl3):3.92(s,3H,-OCH3),5.79(s,1H,CHN2-H),7.12(s,1H,3-H),7.21(m,3H,Ph-H),7.32(dd,J=7.8Hz,1.9Hz,7-H),7.40~7.45(m,2H,Ph-H),7.68(br,1H,5-H),7.75(dd,1H,J=7.8Hz,8-H)
用此法可制得2-苯氧基-4-重氮甲基甲酰基喹啉(9-2),产率86.4%,熔点:138~140℃,MS:m/z289(M+)
实例7
2-苯氧基-6-甲氧基-喹啉基-4-乙酰胺(10-1)的合成
2-苯氧基-6-甲氧基-4-重氮甲基甲酰基喹啉0.319g(1mmol)与5毫升二氧六环混合,于70~80℃加入含0.27毫升15%硝酸银的1.35毫升浓氨水溶液,加完后,升温回流,TLC跟踪至反应完成(约2小时)。滤去不溶物,于滤液中加入10毫升水,用乙酸乙酯萃取三次,饱和食盐水洗三次,有机层减压浓缩,用苯带出残留的水分,得粗产品。产率76.4%,用乙酸乙酯重结晶。熔点:186~188℃,MS:m/z308(M+),1HNMR(CDCl3):3.90(s,3H,-OCH3),3.95(s,2H,-CH2),5.43(br,2H,NH2,disappear after D2O exchanged),7.02~7.74(m,9H,Ph-H,OPh-H),
元素分析(计算值)%:C:70.11(70.13),H:5.23(5.19),N:9.09(9.11)。
用此法也可制得2-苯氧基-喹啉基-4-乙酰胺(10-2),产率69.1%,熔点:159~161℃,
MS:m/z278(M+)1HNMR(CDCl3):4.06(s,2H,-CH2),5.44(br,2H,NH2),7.06~7.94(m,1OH,Ph-H,OPh-H)。
实例8
体外活性测试
选用″SIBLINKS″法的比色测活体系,以SIBLINKS为底物(Washburn,W.N.,Dennis,E.A.J.Am.Chem.Soc.112,2040~2041(1990)),以市售naja naja PLA2及人酶作为水解酶,对喹啉抑制剂与吲哚阳性参照物进行酶抑制的活性评价。
条件:温度:空调控制在21.0℃;PLA2:加样量为20μl(浓度为5μg/ml),最后用八排枪同时加入;空白:DMSO(加样量为10μl);每孔中加样总量为250μl;测定所用波长405nm,曲线点间隔25秒,曲线点数30;高温灭菌:高压灭菌锅(120℃,1.1大气压,20分钟)将缓冲溶液,Tip头,酶标板,离心管灭菌;底物溶液和酶溶液需同时配制,每次配制后作标准曲线。
方法:在测活过程中,选Re=1.6,此时底物以混合胶束形式存在。首先研究酶浓度对反应速度的影响确定合适的酶浓度作为测活酶浓度,在此浓度下改变底物浓度作标准曲线,选定表观Km值附近的底物浓度为测活底物浓度,然后对抑制剂进行活性测试。先以10-n(n=9,8,7,6,5,4)为单位改变抑制剂浓度测定反应速度,然后在IC50值附近小幅度改变抑制剂浓度精确测定IC50值。当底物浓度为384μM时,吲哚阳性参照物的Ki值为10-5数量级,喹啉目标化合物(10-1)的Ki值为10-6数量级,IC50值为9.08×10-6mol/L,(10-2)的Ki值为10-5数量级,体外测试达到或超过吲哚阳性参照物。动物试验显示活性。