番杏的Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及植物基因工程领域中的一种转运蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及番杏的Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
盐害是农作物产量的严重限制因素。了解植物的抗盐机理，克隆抗盐基因并转移到盐敏感的农作物中，培育抗盐的转基因作物新品种，对于有5亿多亩盐荒地的我国来说，具有十分重要的意义。
植物为了抵御盐胁迫，形成了一系列的适应机制，主要是通过在细胞质中积累小分子的无毒有机溶质和离子在液泡内区隔化来实现渗透平衡。高等植物细胞液泡占完全膨胀细胞总体积的95％，对于植物来说Na+是细胞生长所需要的基本营养成分，Na+的区隔化是它在盐环境中生存的必要保障。Na+/H+逆向运输蛋白(antiporter)是一种Na+的逆向转运体，在细胞质膜和液泡膜上均有分布，液泡膜上地Na+/H+ antiporter将细胞质中的Na+逆着Na+浓度梯度运送到液泡中区隔化集中，细胞质膜上的Na+/H+antiporter将细胞质中的Na+逆向运送到胞外高Na+环境中，从而减少了钠离子对细胞质中细胞器的毒害，对于维持细胞的渗透平衡起重要作用。
植物中Na+/H+ antiporter最早发现是在大麦质膜上，此后在质膜和液泡膜上均有研究报道，到目前已经在大量的盐生植物及非盐生植物中发现Na+/H+ antiporter活力。已经从拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)、北滨藜(AgNHX1)、冰叶午时花(McNHX1)分离了Na+/H+ antiporter基因，证明该基因的表达产物具有Na+/H+交换的功能。虽然这些基因绝大多数是从具有低逆向运输活力的甜土植物中分离的，但前人的研究表明盐生植物普遍具有在液泡中高效区隔化Na+的机制。对盐生植物Na+/H+ antiporter基因只在北滨藜和碱蓬有过研究，而后者中的工作未见正式发表。
耐盐性属复杂性状，大量的盐胁迫反应相关基因的存在也支持这个观点。但单一基因一般不能显著提高作物的耐盐水平，需要多个耐盐基因的协同作用植物才能具有高耐盐性。然而转AtNhx1基因的拟南芥植株在200mM NaCl中能正常生长发育。将拟南芥的AtNhx1基因转入番茄中，过量表达液泡Na+/H+ antiporter的转基因番茄在200mM NaCl胁迫下能够正常生长、开花和结实。尽管叶片中Na+浓度高，但番茄果实中Na+浓度很低。说明转Na+/H+ antiporter单基因能够明显提高植物耐盐性，同时，具有器官表达的特异性，有力支持了Na+/H+ antiporter在植物耐盐性方面所具有的重要作用。
番杏是一年生的肉质草本植物，有较强的耐盐性，原产于澳大利亚、东南亚和智利等地，我国现亦有栽培，其嫩茎叶可作蔬菜食用。但对番杏的耐盐机制尚未从分子水平加以研究。
【发明内容】
本发明的目的是提供番杏Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因。
本发明所提供的番杏Na+/H+逆向转运蛋白来源于番杏(Tetragoniatetragonioides O.)，名称为TtNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由554个氨基酸残基组成的蛋白质。
根据GenBank中Na+/H+逆向转运蛋白保守的氨基酸序列设计合成了2个简并性引物，P1：5′-ATTGG(T/A)GCAAT(A/C)TT(C/T)GCTGC-3′；
P2：5’-TCTCAAT(A/g)TCCA(A/g)(T/g/A)gCATCC-3’，通过RT-PCR及RACE方法从盐生植物番杏中克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因。
番杏Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因TtNHX1，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由2199b个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第92位到第1756位碱基。
番杏Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆，有利于在分子水平上进一步研究逆向转运蛋白的结构和功能特征。对盐生植物与非盐生植物、质膜型与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白基因进行比较分析，可进一步在细胞和分子水平上明确植物的抗盐机制。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码番杏Na+/H+逆向转运蛋白TtNHX1的基因导入植物细胞，可获得对高盐胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株，以培育出抗盐的转基因作物新品种，使其正常生长在盐渍土地上，对于拥有5亿多亩盐荒地的我国来说，这种措施的经济效益是十分可观的。而且未来农业的发展面临着人口增多，可耕地减少的挑战，充分利用盐碱地将发挥巨大作用。
番杏TtNHX1与AtNHX1、AgNHX1等液泡型逆向转运蛋白具有高度同源性，系统发育分析也表明TtNHX1与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白同源性高于质膜型的。因此TtNHX1的功能可能是跨液泡膜运输Na+，将其在液泡中积累。哺乳动物中氨氯吡嗪嘧结合位点已经识别出来为：163DVFFLFLLPPI173，氨氯吡嗪嘧抑制Na+/H+逆向转运蛋白的活力。番杏中这个区域的序列为85LFFIYLLPPI94，与AtNHX1，OsNHX1和NHX高度同源，因此对于番杏TtNHX1的研究还便于更好地比较盐生植物与甜土植物逆向转运蛋白的不同。
【附图说明】
图1为Na+/H+逆向转运蛋白cDNA克隆
图2为Southern blot分析结果
图3为Northern blot分析结果
图4为番杏(TtNHX1)疏水性分析
图5为植物Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列
图6为Na+/H+逆向转运蛋白的系统发育树分析
图7为200mM NaCl诱导不同时间番杏中TtNHX1的表达
【具体实施方式】
实施例1、番杏的Na+/H+逆向转运蛋白编码基因的克隆
具体实验步骤如下：
(1)RNA和DNA的分离
用Trizol试剂盒(GIBCO-BRL)从番杏(Tetragonia tetragonioides O.)幼苗(播种在蛭石中，生长在温室条件下)中提取RNA，随后用无RNase的DNase(TaKara)除去RNA中残留的DNA。
DNA提取采用CTAB方法。
(2)番杏Na+/H+逆向转运蛋白cDNA片段的分离
根据北滨藜、碱蓬、柑桔中Na+/H+逆向转运蛋白保守的氨基酸序列合成简并性引物，
P1：5′-ATTGG(T/A)GCAAT(A/C)TT(C/T)GCTGC-3′；
P2：5′-TCTCAAT(A/g)TCCA(A/g)(T/g/A)gCATCC-3′。
为了分离cDNA片段，用逆转录试剂盒(Promega)合成第一链cDNA。RT-PCR反应混合物为25μl，含有2μl cDNA模板，0.8mmol/L dNTPs，0.6μmol/L的每条引物，1×PCR缓冲液，1U Taq DNA polymerase(Promega)。PCR反应程序：95℃，4min；95℃30sec，50℃30sec，72℃1min，共36个循环；72℃10min。得到一个约500bp的cDNA片段(图1(b))。将其与PGEM T-easy载体(Promega)连接，转化大肠杆菌DH5α，利用蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，提质粒，Not I酶切质粒鉴定插有预期大小片段(500bp)的阳性克隆，进行测序。测序结果表明，获得了535bp的cDNA片断，用blast比对番杏cDNA片段，发现这个cDNA片段与已克隆的Na+/H+逆向转运蛋白基因具有较高的同源性，说明获得的番杏cDNA片断是Na+/H+逆向转运蛋白基因的片段。
(3)番杏Na+/H+逆向转运蛋白cDNA末端的分离
根据已克隆的Na+/H+逆向转运蛋白cDNA片段的序列合成基因特异引物
3-GSP1：5′-CATGGCATAACGTGACTGAGAGC-3′；
3-GSP2：5′-TGAGAGCTCAAGAGTAACCACCAAG-3′；
5-GSP1：5′-GGCATTGAAAAGCACCACTG-3′；
5-GSP2：5′-CTACACCTTCCCCAAACACCAGACT-3′；
5-GSP3：5′-ACTGTATAGCAAAGGTGTCTCGTCC-3′。
通过cDNA末端快速扩增(GIBCO-BRL)分离Na+/H+逆向转运蛋白cDNA的3′末端和5′末端。用基因特异引物3-GSP1、3-GSP2和3′RACE，5-GSP1、5-GSP2、5-GSP3和5′RACE试剂盒分离cDNA3′末端和5′末端。用5′RACE和3′RACE方法克隆了cDNA5′末端序列(图1(a))和3′末端序列(图1(c))，测序结果显示5′和3′端片段的长度分别为628bp和1221bp，它们与中间535bp cDNA片段相应末端分别有81bp和104bp的重叠区，将这3个片段拼接，得到一个全长2199bp番杏Na+/H+逆向转运蛋白基因的全长cDNA(图1(d))，为序列表中的序列1。
实施例2、番杏Na+/H+逆向转运蛋白cDNA全序列分析
按拼接的序列设计特异引物，用常规RT-PCR方法克隆番杏Na+/H+逆向转运蛋白全长cDNA，对其测序验证拼接是准确的。该cDNA包括1665bp的开放读码框(Open ReadingFram，ORF)，91个碱基的5′非翻译区(Non Translated Region，NTR)，412个碱基的3′非翻译区和31个碱基的多聚腺苷酸尾。在5′非翻译区+59位置有一个终止密码子(TAG)，而且与编码区的读码框相吻合，这说明不存在其它更前的起始密码子，表明这个cDNA是全长的，将其命名为TtNHX1。此cDNA编码一个554个氨基酸的多肽，见序列表中的序列2，推测分子量为61.2KD。
实施例3、Southern blot
分别用Dra I，Xsp I，HaeIII酶切40μg番杏基因组DNA，这三种酶在克隆的535bpcDNA片段上没有酶切位点。完全酶切的DNA经1.2％的琼脂糖电泳分离后，转移到HybondN+尼龙膜上，按Random Primer DNA labeling Kit Ver.2(TaKaRa，Japan)的方法用[32P]dCTP标记的725bp cDNA片段做探针进行杂交分析。结果发现在上述3种酶切的DNA中Dra I，Xsp I有2个DNA片段杂交，如图2所示，HaeIII有3个DNA片段杂交，表明番杏基因组有两到三个拷贝的TtNHX1。图2中的泳道1、2、3分别表示用Dra I，XspI，HaeIII酶切番杏基因组DNA的Southern blot杂交斑点。
实施例4、Northern blot
按照常规方法进行Northern blot实验，结果如图3所示，表明TtNHX1的表达具有组织特异性，在番杏的根、茎和叶中均有表达，而花中没有表达。经NaCl诱导后根、茎和叶中的表达量增加，而花中仍没有表达。图3(a)为未经诱导的番杏mRNA Northernblot杂交斑点，图3(b)为经NaCl诱导后的番杏mRNA Northern blot杂交斑点，泳道1、2、3、4分别表示根、茎、叶和花中提取的mRNA Northern blot杂交斑点。
实施例5、TtNHX1序列分析
用常规方法进行的疏水性分析表明TtNHX1具有12个跨膜区(如图4所示)。TtNHX1的氨基酸序列与已克隆的其它Na+/H+逆向转运蛋白具有很高的同源性，TtNHX1的跨膜区与其它Na+/H+逆向转运蛋白的跨膜区相似性较高。TtNHX1中85LFFIYLLPPI94是高度保守的，这是Na+/H+逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯吡嗪嘧的结合位点(如图5所示)。图5中加黑部分是一致性的氨基酸，框起来的是氨氯吡嗪嘧结合位点。AgNHX1，AtNHX1，CNHX1，OsNHX1和TaNHX1 GenBank登陆号分别为：BAB11940，AAF21755，AAK27314，BBA83337，AAK76737。
为了分析不同Na+/H+逆向转运蛋白之间的遗传关系，发明人进行了系统发育分析，用DNAMAN对氨基酸序列进行分析。从GenBank中查找一些有代表性的Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列，分析TtNHX1与它们的关系。TtNHX1与液泡型的Na+/H-逆向转运蛋白的亲缘近，有AgNHX1，cNHX1，AtNHX1，OsNHX1，TaNHX1，和NHXI，AtNHX1的功能是在液泡膜上将Na+区隔化到液泡中。TtNHX1与AgNHX1属于同一簇，而TtNHX1和AgNHX1都是盐生植物的Na+/H+逆向转运蛋白。TtNHX1与质膜型的Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远(图6)。可以看出TtNHX1是液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白。上述逆向转运蛋白氨基酸在GenBank登陆号为：AgNHX1(BAB11940)，A.gmelini；OsNHX1(BBA83337)，O.sativa；TaNHX1(AAK76737)，T.aestivum；NHX1(NP-010744)，S.cerevisiae；Nhap(BAA316951)，P.aeruginosa；SOS1(AF256224)，A.thaliana；NhaA(J03879)，E.coli；Sod2(CAA77796)，S.pombe；NHA1(NP-013239)，S.cerevisiae.
实施例6、TtNHX1的RT-PCR表达分析
用常规的RT-PCR方法分析TtNHX1的表达。结果如图7所示，TtNHX1在番杏对照植株中有表达，经NaCl诱导后表达量增加，盐处理后TtNHX1在番杏中的转录物迅速增加，1小时就可达到稳定水平。说明TtNHX1可能执行将番杏细胞质中的Na+离子运输到液泡中的功能。
序列表
<160>2
<210>1
<211>2199
<2 12>DNA
<213>番杏属番杏(Tetragonia tetragonioides O.)
<400>1
caaacataaa aaaatagtcg tatttcgggc acgctgtgga ttaagttatt tgcatatata 60
gtggaagtac aaggagttca aaaacacaaa aatggcattt gatttgagct attttgtgag 120
caacaagttg ggaatgctgg ccacttctga tcatgcttct gtggtatcta tgaatctgtt 180
tgtggcgcta ctgtgtggtt gtatcgtgct cggtcacctt ctcgaggaga atcgttggat 240
gaatgagtca attacggctc taattatagg tttgggcact ggagttgtga ttttgctgat 300
tagcggcgga aagagttcgc atttgttggt cttcagtgaa gatcttttct tcata1tatct 360
tcttccgccg attatattca atgctgggtt tcaggtgaag aagaagcaat ttttccgcaa 420
cttcatcaca atcatactgt ttggagctgt gggtacattg atatcattta ccatcatatc 480
cctaggtgct atggagttct ttaagaagtt ggacattggt tctctggatt taggcgacta 540
ccttgcaatt ggtgcaatat tcgctgcaac cgattctgtt tgcacgttgc aggtgcttaa 600
tcaggacgag acacctttgc tatacagtct ggtgtttggg gaaggtgtag ttaatgatgc 660
aacatcagtg gtgcttttca atgccatcca gaactttgac ctcacacata ttgatcacag 720
aattgcttta cagttcgctg gcaatttcct atatttattt ttcacaagca cgctgctagg 780
agcaatgact ggattgctca gtgcgtacat tatcaaaaaa ttgtactttg gaaggcactc 840
cactgaccgt gaagttgctc taatgatgct catggcgtat ctatcgtaca tgctcgctga 900
actattctat ttgagtggaa ttctgacagt atttttctgt gggattgtaa tgtctcatta 960
tacatggcat aacgtgactg agagctcaag agtaaccacc aagcatgctt tcgcaaccct 1020
gtcttttgtt gccgagactt tcatctttct atatgtcggc atggatgcat tagacattga 1080
gaagtggaga tttgtgagcg atagtcctgg aatatctgtt gctgtgagtt ccatattgct 1140
gggtctgctc atgcttggac gagcagcttt tgtttctccc ttgtccttcc taatgaattt 1200
cttcaagaaa tctcaagctg aaaaagtcag cttaaggcag caggtgataa tatggtgggc 1260
gggtctcatg agaggtgctg tttcgatggc tcttgcttat aatcagttta cgaggtcagg 1320
gcacactcaa ctaagaggga atgcaataat gattacgagc actatatctg ttgtccttgt 1380
cagcacagtg gtatttggca tactgacaaa gcctcttata ttgttcttgc tgcctcaacc 1440
aaaacacttc aatagtacca gcactgtgtc atcggaaaat ttggggagcc caaaatcatt 1500
cactttgcca cttcttggta atcaccaaga ctctgaaacg gatatcggaa accatcaaga 1560
cagcactgac aggggtcttg gccggcccag cagcctgcgc atgcttctaa atgcgccaag 1620
ccacacagtt caccactact ggcgcaaatt cgataacgct tttatgcggc ctgtatttgg 1680
tggacgaggt ttcgtacctt atgtcccagg ctcacctaca gaacagagca ccaacaattt 1740
gacagagagg acataggaaa gaaagagaga cagttatggg ataaatagaa cctacaggca 1800
ggtttcaagg tatagactgg ccctcatcga agaacatcga ctggcttcat cagctttgct 1860
gctgagagcc tgagagcata ttgtatatta attttgttaa tacataggtt gtgcaactta 1920
cactgctcat tgagttatgt cattggactc gaacaggatg atcgtccaat gtattctttg 1980
atttagctgt agttcagctg ccctaggatg tttttggcgg gttttagttg ctttgtttta 2040
gacctagttt cagggtttcc ttctacaatc tcttccccag ctcggagttt agtggtgtaa 2100
ttagtgtgga ataatgtttg ttcttgaaac aagtccctgg gaaacaattt gggaaatagt 2160
tgcggtccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2199
<210>2
<211>554
<212>PRT
<213>番杏属番杏(Tetragonia tetragonioides O.)
<400>2
Met Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Phe Val Ser Asn Lys Leu Gly Met
1 5 10 15
Leu Ala Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Met Asn Leu Phe
20 25 30
Val Ala Leu Leu Cys Gly Cys Ile Val Leu Gly His Leu Leu Glu
35 40 45
Glu Asn Arg Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly
50 55 60
Leu Gly Thr Gly Val Val Ile Leu Leu Ile Ser Gly Gly Lys Ser
65 70 75
Ser His Leu Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu
80 85 90
Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys
95 100 105
Gln Phe Phe Arg Asn Phe Ile Thr Ile Ile Leu Phe Gly Ala Val
110 115 120
Gly Thr Leu Ile Ser Phe Thr Ile Ile Ser Leu Gly Ala Met Glu
125 130 135
Phe Phe Lys Lys Leu Asp Ile Gly Ser Leu Asp Leu G1y Asp Tyr
140 145 150
Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr
155 160 165
Leu Gln Val Leu Ash Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu
170 175 180
Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu
185 190 195
Phe Asn Ala Ile Gln Asn Phe Asp Leu Thr His Ile Asp His Arg
200 205 210
Ile Ala Leu Gln Phe Ala Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Phe Thr
215 220 225
Ser Thr Leu Leu Gly Ala Met Thr Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile
230 235 240
Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val
245 250 255
Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu
260 265 270
Leu Phe Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile
275 280 285
Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg
290 295 300
Val Thr Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu
305 310 315
Thr Phe Ile Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu
320 325 330
Lys Trp Arg Phe Val Ser Asp Ser Pro Gly Ile Ser Val Ala Val
335 340 345
Ser Ser Ile Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Gly Arg Ala Ala Phe
350 355 360
Val Ser Pro Leu Ser Phe Leu Met Asn Phe Phe Lys Lys Ser Gln
365 370 375
Ala Glu Lys Val Ser Leu Arg Gln Gln Val Ile Ile Trp Trp Ala
380 385 390
Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Asn Gln
395 400 405
Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Gln Leu Arg Gly Asn Ala Ile Met
410 415 420
Ile Thr Ser Thr Ile Ser Val Val Leu Val Ser Thr Val Val Phe
425 430 435
Gly Ile Leu Thr Lys Pro Leu Ile Leu Phe Leu Leu Pro Gln Pro
440 445 450
Lys His Phe Asn Ser Thr Ser Thr Val Ser Ser Glu Asn Leu Gly
455 460 465
Ser Pro Lys Ser Phe Thr Leu Pro Leu Leu Gly Asn His Gln Asp
470 475 480
Ser Glu Thr Asp Ile Gly Asn His Gln Asp Ser Thr Asp Arg Gly
485 490 495
Leu Gly Arg Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Asn Ala Pro Ser
500 505 510
His Thr Val His His Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asn Ala Phe Met
515 520 525
Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Tyr Val Pro Gly
530 535 540
Ser Pro Thr Glu Gln Ser Thr Asn Asn Leu Thr Glu Arg Thr
545 550 554