红曲霉突变株及其于制备具降血压活性发酵产物之用途 【技术领域】
本发明提供了红曲霉突变株，及其用于制备降血压活性物质之用途。
背景技术
近年来，高血压等心血管疾病已成为为导致死亡之主要原因之一，且罹患此种疾病之人口亦逐年成长。由于高血压为一种慢性疾病，患者必须长期服用降血压药物。根据日本1999年的统计资料显示，日本一年降血压药物市场稳定维持在500亿日圆，而与控制血压相关的保健食品，其市场亦由1997年之14亿日圆成长至1999年之72亿日圆。故全世界对于具有降血压活性之药物或健康食品之需求，亦日益增加。
自古以来，红曲霉属已为中国之传统食药菌种，其亦广泛使用于制造各种食品。日本公开特许专利第61197524号案发现曲霉属(Aspergillus)及红曲霉属(Monascus)之代谢产物中含有可改善高血压之物质。Kohama等人于1987年(Chemical and Parmaceutical Bulletin，35：2484-2489)发现红曲霉发酵液中之γ氨基丁酸(GABA)及乙酰胆碱(Ach)具有降血压之功效。日本公开特许专利第62298598号案则揭示由红曲霉发酵液中收集降血压物质之方法。日本公开特许专利第03090031号案系提供红曲霉之改良培养基，以提升降血压物质之产量。日本公开特许专利第2000279163号案系揭示利用红曲霉制备之降血压食品，其中含有γ氨基丁酸及葡萄糖胺。WO01/31048 A1号案系揭示将红米以红曲霉发酵后，由其中制备氧化氮供体组合物(nitricoxide donor composition)，该组合物具有血管舒张及降血压之功效。
Blanc等人于1995年(Intemational Journal of Food Microbiology；27，201-213)发现红曲霉会产生一种真菌毒素，桔霉素(citrinin)，而使红曲色素之安全性受到重视。日本专利第7274978号案利用突变方法降低桔霉素之产生(低于1ppm)，惟其产物系为红色素，并非用于制备降血压物质。
红霉菌属虽已广泛用于制造降血压物质，但其产物之桔霉素含量高，致所生产之发酵产物有安全性上之考虑。
【发明内容】
本发明提供了一种新的红曲霉(Monascus prupureus)突变株，其可于无须加工处理之条件下，以价格低廉之天然原料，以固体或液体方式培养，直接生产具有降血压活性之发酵产物，且该产物之桔霉素含量甚低。
本发明并提供利用本发明红曲霉株制备具有降血压活性之发酵产物的方法。
本发明另提供利用本发明新地红曲霉突变株所产生的发酵产物制得的药物组合物及食品添加剂。
具体实施方式本发明提供由红曲霉(Monascus purpureus)突变衍生筛选出之红曲霉突变株。当此突变株于每公升含有再来米粉约60克，大豆粉约30克及MgSO4.7H2O约5克之培养基中培养，而发酵产物中γ氨基丁酸之浓度达约0.03毫克/毫升时，其中桔霉素之含量约小于1.0ppm，较佳为约小于0.5ppm，更佳为约小于0.15ppm。
根据本发明，红曲霉突变株之母株系为任意可产生之γ氨基丁酸之红曲霉菌株。例如：可获自台湾新竹食品工业发展研究所之红曲霉CCRC 31497(其相当于ATCC 16375，CBS 280.34，IFO 4489)、CCRC 31498(其相当于ATCC 16358，CBS 281.34，IFO 4486)、CCRC31499(其相当于早期命名之紫红曲(Monascus anka)ATCC 16360，CBS283.34，IFO 4478，KFCC 11832)、CCRC 31501(其相当于ATCC 16362，CBS 285.34，IFO 4485)、CCRC 31504(其相当于ATCC 16367，CBS288.34，IFO 4484)、CCRC 31541(其相当于ATCC 16379，IFO 5965)或CCRC 31542(其相当于ATCC 16365，CBS 109.07，IFO 4513)。
根据本发明，其中之突变株指其对应于母株之基因序列，至少有一个核苷酸不同，而所改变之核苷酸序列可改变其细胞生理。本发明之突变株可藉由许多方法获得，其包含以随机诱变(例如：化学诱变剂、转座子或放射线)之方式处理母株，或以核酸重组技术将母株基因之核苷酸序列中，取代、插入或删除一或多个核苷酸(请参见如Sambrook，J.Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.；Ausubel，R.M.等人(1995)Current protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York N.Y.)。再以筛选之方式选择γ氨基丁酸产量较母株高，且桔霉素产量较母株低之突变株。
根据本发明红曲霉突变株之较佳实施方案，该红曲霉突变株具有与红曲霉M022及M1033相同之性质，其中红曲霉M022及红曲霉M1033株已于2002年6月21日根据布达佩斯条约之规定保藏于美国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为PTA-4486及PTA-4485。
根据本发明，利用红曲霉突变株制备发酵产物之方法，可于固体或液体培养基中发酵进行。
根据本发明，其中上述培养基中之碳源及氮源可为任意之公知原料。其较佳为天然原料，其中碳源包括但不限定为再来米粉、玉米淀粉、米淀粉、小麦淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖及甘油，或其组合；而氮源包括但不限定为大豆粉、黄豆蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、玉米浸渍液、麸胺酸、氯化铵及硝酸钾，或其组合。
根据本发明制备方法之较佳实施反案，其中该培养基之pH值约介于3至9，较佳为约介于5至7。
根据本发明，所制得之发酵产物中具有降血压活性物质，例如γ氨基丁酸、葡萄糖胺及乙酰胆碱。其中γ氨基丁酸是中枢神经系统中主要抑制神经传导之物质，与其有关之受体有GABAA及GABAB，于动物实验中发现GABAA之活动会伴随降血压、抗痉挛及抗忧虑等生理现象之出现，许多实验亦证明γ氨基丁酸具治疗高血压之活性，且许多降血压药物均系藉由控制γ氨基丁酸之量，以达降血压之效果。故γ氨基丁酸含量可作为测定降血压活性之重要指针。
本发明红曲霉突变株所制得之发酵产物中桔霉素之含量约低于1.0ppm，较佳为约小于0.5ppm，更佳为约小于0.15ppm。
根据本发明，所制得之降血压发酵产物可直接作为药物组合物之活性成分或食品添加剂。发酵产物中之降血压活性物质可进一步藉由各种公知技术予以纯化(例如：Kohama等人(Chemical andParmaceutical Bulletin，1987，35：2484-2489)及日本公开特许专利第62298598号案所揭示之纯化萃取方法)。
下述实施例仅系用于例示本发明，而非用以限定本发明。
实施例1：一般分析方法
γ氨基丁酸含量之分析
将0.6毫升菌株发酵液与0.6毫升氯化镧(140mM)混合均匀后，于60℃水浴下反应30分钟，将该混合物离心。取出0.1毫升之上清液，将其与50微升KOH(1M)及850微升之水进行反应，5分钟后进行离心并保留其上清液备用。
将550微升之该上清液样品加入150微升之NADP(4mM)、200微升之磷酸缓冲液(pH8.6)及50微升之GABASE(2单位/毫升)，经混合后立即利用分光光度计测量其OD340之吸光值，并记录其结果；再于其中加入50微升之α-氧代戊二酸，经反应60分钟后，再次测量其OD340之吸光值，并计算反应前后OD340吸光值之差值。将此差值与GABA标准品比较后，计算其浓度。
桔霉素含量分析
将菌株发酵液以HPLC予以测定。其步骤包括先将7毫升发酵液之pH值调整至3.5，待反应1小时后，再加入3毫升乙酸乙酯，30分钟后收集该乙酸乙酯层，并重复此添加乙酸乙酯及收集之步骤两次。将此收集液干燥。
以1毫升之甲醇溶解此干燥之收集样品后，将此甲醇溶液以0.2微米孔径之滤膜过滤后，取10微升进行HPLC分析。其分析之条件如下：
柱： μBondapak C18(10微米，Waters，来源地)
流速： 每分钟1.0毫升
检测仪： UV检测仪(Waters photodiary assay 996，分析波
长225-345毫微米)
移动相(梯度)：0.8％磷酸：乙腈：2-丙醇为60∶35∶5至25∶
70∶5
进行时间： 20分钟
滞留时间： 11分钟
经测得之数值与桔霉素标准品(Sigma)比较后，计算其浓度。
实施例2：本发明突变株之诱发及筛选
将红曲霉CCRC 31499(即ATCC 16360)接种于PDA(融合形马铃薯20％，葡萄糖(Bacto Dextrose)2％，琼脂2％)斜面上，于30℃下培养7天后，以无菌水将孢子洗下。将每毫升含有107以上孢子之收集液，以UV光照射2分钟，经连续稀释后涂抹于PDA平板上。于30℃下培养2至3天后，将其中之菌落接种于培养基(其每公升中含有再来米粉60克，大豆粉30克及MgSO4.7H2O 5克)，测试该所得突变株之稳定性，以及γ氨基丁酸及桔霉素之产量。
最后分离选出一稳定之突变株，命名为红曲霉M022。将该突变株接种于PDA斜面上，于30℃下培养7天后，以无菌水将孢子洗下。将此孢子接种(5×105个孢子)于含有50毫升培养基(每公升中含有再来米粉60克，大豆粉30克及MgSO4.7H2O 5克)之三角摇瓶中，于30℃、150rpm下震荡培养5至7天后收集其发酵液，并测量此发酵液中γ氨基丁酸及桔霉素之含量，结果为每毫升发酵液之γ氨基丁酸含量为0.039毫克，而桔霉素之含量为小于0.15ppm。于相同条件下，母株红曲霉CCRC 31499发酵液中γ氨基丁酸含量为每毫升0.031毫克，而桔霉素之含量为2.1ppm。
再将红曲霉M022依上述方法进行突变筛选，结果获得另一株突变株，命名为红曲霉M1033，其于培养基(每公升中含有面粉80克，酵母萃取物10克及麸胺酸10克)培养后，发酵液中γ氨基丁酸含量为每毫升2.07毫克，而桔霉素之含量小于0.15ppm。于相同条件下，红曲霉M022发酵液中γ氨基丁酸含量为每毫升0.834毫克，而桔霉素之含量为小于0.15ppm。
红曲霉M022于培养基中之特征如下：
CYA培养基(每公升中含有蔗糖30克，NaNO33克，K2HPO4 1.0克，MgSO4 0.5克，KCl 0.5克，FeSO4 0.01克，酵母萃取物1克，琼脂15克)
培养7天后，菌落呈橘黄色，大小为11至14毫米，气生菌丝呈白色；
培养10天后，菌落呈橘黄色，大小为12至16毫米，气生菌丝呈白色；
分生孢子柄呈无色，分支不规则；
分生孢子呈梨形，大小为3-4×9.5-12.5微米，平滑，壁厚约2微米；
于CYA培养基中培养21天，仍未发现有性世代。MEA培养基(每公升含有麦芽萃取物20克，胨1克，葡萄糖20克，琼脂15克)
培养7天后，菌落呈橘红色，大小为28至30毫米，气生菌丝呈白色；
培养10天后，菌落呈橘红色，大小为34至37毫米，气生菌丝呈白色；
分生孢子柄呈红色，分支不规则；
于MEA培养基中培养21天，子囊果仍未完全成熟，子囊孢子呈卵形(4.5-5×5-6微米)。
红曲霉M1033于培养基中之特征如下：
CYA培养基(每公升中含有蔗糖30克，NaNO3 3克，K2HPO4 1.0克，MgSO4 0.5克，KCl 0.5克，FeSO4 0.01克，酵母萃取物1克)
培养7天后，菌落呈橘黄色，大小为13至14毫米，气生菌丝短小且十分稀少；
培养10天后，菌落呈橘黄色，大小为17至18毫米，气生菌丝短小且十分稀少；
分生孢子柄呈无色，不规则分支部分呈「之」字形分支，外壁平滑；
分生孢子呈梨形或椭圆形，大小为6-12×8.5-13微米；
子囊果大小为30-35微米，子囊孢子呈卵形，大小为4.5-5×5.5-6。
MEA培养基(每公升含有麦芽萃取物20克，胨1克，葡萄糖20克，琼脂15克)
培养7天后，菌落呈橘红色，大小为29至30毫米，气生菌丝短小且十分稀少；
培养10天后，菌落呈橘红色，大小为41至42毫米，气生菌丝短小且十分稀少；
分生孢子柄呈无色，分支不规则；
于MEA培养基中培养21天，子囊果仍未完全成熟。
有关本发明红曲霉M022及M1033突变株与其母株CCRC 31499之比较显示于下表1。
表1母株CCRC 31499突变株M022突变株M1033分生孢子大小a8-12×10-13毫米3-4×9.5-12.46毫米6-12×8.5-13毫米子囊果大小a37-45毫米无30-35毫米子囊孢子大小a4-5×5-6毫米无4-5×5.5-6毫米GABA(毫克/毫升)0.031b0.039b；0.834c2.07c桔霉素(ppm)2.1b＜0.15b；＜0.15c＜0.15c
a于CYA培养基中培养。
b培养基：每公升中含有再来米粉60克，大豆粉30克及MgSO4.7H2O5克。
c培养基：每公升中含有面粉80克，酵母萃取物10克及麸胺酸10克。
实施例3：生产γ氨基丁酸之pH值
根据实施例2所述之方法，以每公升中含有面粉80克，酵母萃取物10克及麸胺酸10克之培养基培养，分别测定于不同pH值之条件下，发酵液中γ氨基丁酸及桔霉素之含量。表2所示结果显示红曲霉M022及M1033突变株于不同之pH值条件下，皆能产生高量之γ氨基丁酸，且桔霉素之含量皆非常低(＜0.15ppm)。
表2
起始pH(灭菌前) 灭菌后pH值 突变株M022a 突变株M1033a
pH3.0 3.3 0.068 -
pH4.0 4.5 0.377 0.568
pH4.5 - 1.512
pH5.0 5.4 0.465 2.141
pH5.5 - 2.572
pH6.0 5.8 0.867 2.728
pH6.5 - 2.736
pH7.0 6.3 0.821 2.688
pH8.0 6.9 0.585 -
pH9.0 7.3 0.3 14 -
″-″表未测试
aγ氨基丁酸之含量单位为毫克/毫升
*桔霉素含量均低于检测值0.15ppm