一种基于芯片的反义寡核苷酸筛选方法及其用途 技术领域 本发明涉及一种生物工程类检测技术及其用途。具体说是一种通过芯片杂交优化出具有RNase H激活活性的结合靶点序列、最佳寡核苷酸长度及其修饰方法。从上述优化的序列中选出最佳寡核苷酸序列，可通过一系列体内、外活性评价进一步确定其生物活性，获得寡核苷酸候选药物，也可作为疾病诊断的探针及基因功能研究的工具。
背景技术 反义核酸药物即反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA互补，抑制或封闭该基因的转录和表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA，使其丧失功能。反义核酸药物是药理学的新领域或革命(Crooke ST.Oligonucleotide analogs might bedesigned to bind to mRNA.Anticancer drug Des，1997，12：311-313)，即：新的药物——反义寡核苷酸；新的药物受体——mRNA；新的受体结合方式——Watson-Crick杂交；新的药物受体结合后反应：(1)ASODN与RNA多聚酶结合使之作用受阻。(2)ASODN抑制mRNA前体进入胞浆和转录前的修饰。(3)通过某种直接的立体效应，核糖体或重要的启动因子与ASODN结合使翻译受阻。(4)ASODN在与mRNA互补杂交时激活RNase H，水解杂交链。然后ASODN从复合物上解离，再与另一个mRNA分子杂交，这个过程可反复进行。(5)通过Hoogsteen碱基配对形式在细胞核的靶基因部位形成三链结构，阻止靶基因的复制或转录。
由于反义核酸可在基因水平上特异性阻断特定基因地表达，因此被认为是一种很有希望的高选择性和高效率的潜在疾病治疗药物。目前，已有一种反义核酸(Vitravene)通过FDA咨询委员会(ScienceScop.Greenlightfor antisensedrug.Science，1998，281：625)，另有20多种正在进行临床实验。国内在该领域也做了大量的基础和应用研究工作，但尚没有一个药物进入临床实验阶段。
随着人类基因组计划的深入，特别是后基因组计划的实施，将会有越来越多的疾病相关基因及药物作用靶标被发现。反义核酸作为基因为靶的新一代药物将会发挥其更大的优势。用反义核酸进行新基因功能的研究也日益受到关注，目前利用反义核酸作为治疗药物和基因功能研究的文献报道呈爆发式增长的趋势，据不完全统计，2000年在美国有3项反义核酸专利申请获得批准，而2001年有5项获得批准，比如，靶向JNK的反义核酸(公开号：6221850)、靶向TNF-alpha的反义核酸(公开号：6228642)、靶向AP-1的反义核酸(公开号：6312900)。
高特异性和高活性序列的筛选是反义寡核苷酸药物研究和开发成功的关键。对于一个mRNA来说不是所有的靶点都是容易达到的(Branch AD，A good antisense molecule is hard to find.Trends Biochem Sci，1998，23：45-50)。一般认为，设计反义药物选择的靶点为mRNA5’端起始密码AUG周围和核糖体的装配部位，反义药物容易达到，活性较高。但研究表明mRNA的其它位置亦可成为设计的靶点，尤其是3’端的非翻译区。目前，RNA高亲和力靶点的判定以经验式随机筛选为主，这种方法往往要针对一个基因合成大量的寡核苷酸序列才能发现一个有效序列，比较盲目，既不经济，也不知是否真的拿到了高亲和力的ASODN。
实验发现在mRNA上距离很近的位点，甚至只差2个碱基，其ASODN的活性差异巨大。虽然碱基的组成可能会影响杂交双链的形成，但是杂交双链的理论自由能的不同并不能解释反义活性的巨大差异。后来发现RNA分子内碱基配对形成的二、三级结构会造成大部分的分子不能与互补核酸相互作用；其他一些结构，如茎环结构、末端序列，虽然没有分子内相互作用，但易与其它核酸结合。这证明互补的寡核苷酸与靶基因结合的主要影响因素不是碱基的组成，而是RNAs的二、三级结构。许多研究表明反义寡核苷酸存在非特异作用，虽然某些非特异反义作用也肯定有治疗价值，但非特异作用通常是不可预知的，难以以此来合理设计药物。ASODN的这种非特异作用主要并不是原先人们怀疑的化学修饰的原因，而是由于选择了靶基因上的非最佳靶点。
近年来，发展了许多用以更好地选择mRNA中的最佳靶点的方法，以寻找到更有效的反义药物。但是这些方法在应用中仍有很多问题，甚至根本无助于反义药物的筛选。如预测RNA折叠的方法已研究了20多年，但由于对RNA结构了解的限制，用它来设计反义核酸仍不理想，近年之内难有大的进展，成功的例子也很有限。最近的研究证明最常用的折叠软件——MFOLD并不能用于寻找mRNA上的可接近位点。RNase H酶切位点图谱(Lima WF et al.，Combinatorial screening and rational optimization forhybridization to folded hepatitis C virus RNA of oligonucleotides with biological antisense activity.J Biol Chem，1997，272：626-638)和寡核苷酸芯片扫描(Milner N et al.，Selecting effective antisense reagents oncombinatorial oligonucleotide arrays.Nat Biotech，1997，15：537-541)两个经验方法虽然可以用来寻找RNA分子上最佳靶点并取得一定程度的成功，但仍有许多不足之处，如会漏掉一些活性位点，操作难度大等。因此需要发展新的、可操作性强、基于实验的最佳靶点的确定方法，这也是反义核酸药物研究和开发的关键环节和瓶颈问题。
基于上述研究现状，我们建立了一种反义寡核苷酸筛选的新方法——基于芯片杂交和原位RNase H切割的筛选方法。该方法的主要设计思想是：通过将合成并修饰的靶向特定基因的寡核苷酸固定于化学修饰的固相载体上制备成基因芯片，与放射性同位素或非放射性分子标记的信使核糖核酸(mRNA)模板进行杂交，杂交结束后洗去杂交液并晾干，加入RNase H进行切割，对照区只加缓冲液不加酶，一定时间后洗涤、晾干并进行信号检测扫描，分析各序列结合靶mRNA强度及RNase H切割活性，以RNase H切割前/切割后的比值进行排序，理论上比值越大的序列其结合活性和RNase H切割活性越好，从而优化出具有RNase H激活活性的结合靶点序列、最佳寡核苷酸长度及其修饰方法。通过建立基于芯片杂交和原位RNase H切割的反义寡核苷酸筛选技术，我们希望能更快地、更少遗漏地找到基因的最佳靶点，为基因功能的研究、疾病诊断探针的筛选及反义核酸药物的开发提供一种有效的手段。
【发明内容】
1.反义寡核苷酸芯片的制备：寡核苷酸探针，可以是不同长度的寡核苷酸及其类似物，长度10-30个碱基，最佳长度16-25个碱基；也可以是不同修饰形式的反义寡核苷酸类似物，包括硫代修饰、肽核酸(PNA)、5`端修饰、3`端修饰、不同的碳原子连接臂修饰，最佳修饰之一是聚乙二醇连接臂修饰。固相载体为高分子膜材料、化学修饰的玻璃片、塑料。
2.靶mRNA的制备和同位素标记：靶mRNA可以直接从组织或细胞提取分离，也可以通过体外转录获得。靶mRNA标记可以是放射性同位素(如32P-rNTP)或非放射性物质(如生物素-rNTP、荧光素等)通过体外转录时掺入，也可以转录或提取mRNA后通过酶催化反应在其5`端或3`端加上放射性或非放射性标记。
3.芯片杂交和原位RNase H切割：将2中标记的靶mRNA与1中的芯片进行杂交10min-24hr，最佳时间为30min-2hr，杂交温度37℃-65℃，最佳温度为40℃-45℃。反应完毕后，洗去杂交液并晾干，在一个区加入含RNase H的缓冲液，对照区只加缓冲液不加酶，37℃孵育后洗去酶液，晾干，在扫描仪上进行信号扫描分析，优化出具有RNase切割活性的最佳寡核苷酸长度、结合靶点序列及其修饰方法。
4.反义寡核苷酸活性评价：将3中筛选获得的最佳寡核苷酸序列通过一系列体内外活性评价进一步确定其生物活性。采用体外细胞增殖抑制活性及Western印迹在细胞水平上验证筛选的反义寡核苷酸的基因表达抑制活性。进一步在整体水平评价反义候选药物的生物学活性，获得寡核苷酸候选药物。
本发明的目的是通过芯片杂交和RNase H切割优化出最佳的靶基因结合序列、最佳寡核苷酸长度及其修饰方法。本发明的实施对更快地、更少遗漏地找到基因的最佳靶点，基因功能的研究、疾病诊断探针的筛选及反义核酸药物的开发具有重要的社会效益和经济效益。
附图说明 图1 为反义寡核苷酸的芯片筛选过程
图2 5’NCR-Luciferase mRNA电泳图谱
图3 5’NCR-Luciferase mRNA与芯片杂交后扫描图
图4 为RNaseH切割浓度的优化
图5 为RNase H切割时间的优化
表1 为靶向模式基因5’NCR-Luciferase的反义寡核苷酸序列
表2 芯片筛选反义序列的活性验证
具体实施方式 本发明的筛选方法的一些举例性但非限制性的例子见下。
实施例1 芯片杂交筛选寡核苷酸
1.探针合成与芯片制备：根据靶基因5’NCR-Luciferase的二级结构设计17条寡核苷酸探针，长度21-23个碱基(序列见表1)。在8909型自动DNA合成仪(PE公司)上合成，3`端氨基修饰、4个聚乙二醇连接臂修饰。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Solid PhaseSciences公司)纯化，紫外(Beckman公司)定量后真空(Oligo Prep OP120，SAVANT公司)干燥，以点样液稀释至浓度为15μmol/L-30μmol/L。用点样仪(Cartisian)点布于化学修饰的玻璃片上。
2.靶基因mRNA的获得与标记：以模式基因5’NCR-Luciferase为例，用RT-PCR方法获得全长靶基因cDNA克隆，将其克隆至含有T7/SP6启动子的A/T载体，经测序验证为正确序列。通过PCR扩增在靶基因的5`和3`端分别引入Hind III和BamH I酶切位点，定向插入pSP64 poly(A)载体，以EcoR I酶切线性化质粒为模板进行体外转录制备出靶mRNA(见图2)。也可以用单基因特异性探针调出单基因mRNA。
靶mRNA同位素标记可以通过体外转录时32P-rUTP掺入，也可以转录或提取mRNA后通过Poly(A)聚合酶在其3`端加上32P-rATP。
3.芯片杂交与扫描：将同位素标记靶mRNA与制备的芯片进行杂交3小时，杂交温度42℃。反应完毕后洗去杂交液，晾干，以保鲜膜包裹后磷屏压片3天后在Typhoon 9410扫描仪上扫描分析。以芯片上探针结合的信号强弱筛选后，提示较好的候选位点是1、2、6、9、10、17，见图3A及表2。
实施例2 芯片杂交及RNase H切割筛选寡核苷酸
1.RNase H原位切割条件的优化：采用不同浓度的RNase H，分别为7.81×10-3U、1.56×10-2U、3.12×10- 3U、6.25×10-2U、1.25×10-1U、2.5×10-1U、5.0×10-1U，37℃作用20min，结果表明1.25×10-1U为最适切割浓度。采用1.25×10-1U RNase H，37℃分别作用2min、5min、10min、15min、20min、30min、60min，结果表明20min为最适切割时间。综上所述，RNase H的最适切割条件为1.25×10-1U于37℃切割20min，见图4、图5。
2.芯片杂交、RNase H切割与扫描：将同位素标记靶mRNA与制备的芯片进行杂交3小时，杂交温度42℃。反应完毕后洗去杂交液，晾干，在一个区加入含RNase H的缓冲液，对照区只加缓冲液不加酶，37℃孵育后洗去酶液，晾干，以保鲜膜包裹后磷屏压片3天后在Typhoon 9410扫描仪上扫描分析。计算每个点酶消化前后的比值，理论上比值越大的序列其结合活性和RNase H切割活性越好。以原位RNase H切割前后的信号比再次筛选后，提示较好的候选位点是1、2、6、7、9、17，见图3B及表2。
实施例3 寡核苷酸活性评价
合成硫代修饰的候选序列，HepG2肝癌细胞接种于96孔板，1×104细胞/孔，37℃、5％CO2孵育18-20h。80-90％细胞融合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(Gibco公司)进行细胞转染。将上述序列分别与pHCV-neo4质粒0.1μg共转染HepG2肝癌细胞，作用5h，换含10％小牛血清的DMEM培养基继续培养24h，。以不加S-ASODN的质粒转染为阳性对照。每次实验中每1条硫代序列均重复3孔，结果取其平均值。荧光素酶活性检测采用Luciferase Assay System(Promega公司)，按说明书操作稍加改进。在多标记检测仪(VICTORTMWallac 1420 Multilabel Counter)上测1s发光强度，输出值为CPS。
结果表明：以芯片上探针结合的信号强弱筛选后，提示较好的候选位点是1、2、6、9、10、17，其中4条序列经细胞学验证活性好，1条序列活性较好，1条序列无效，芯片筛选的结果与细胞学验证的符合率为66.7％；以原位RNase H切割前后的信号比再次筛选后，提示较好的候选位点是1、2、6、7、9、17，其中5条序列经细胞学验证活性好，1条序列活性较好，芯片筛选的结果与细胞学验证的符合率为83.3％。见表2。
表1 靶向模式基因5’NCR-Luciferase的反义寡核苷酸序列
序列编号 碱基排列(5`→3`)
1 GAA GAC AGT AGT TCC TCA CAG
2 CCA TGG CTA GAC GCT TTC TGC
3 GGG GTC CTG GAG GCT GCA CGA
4 TTC CGG TGT ACT CAC CGG TTC
5 CGC GGG GGC ACG CCC AAA TCT
6 GCC TTT CGC GAC CCA ACA CTA CT
7 GCA CTC GCA AGC ACC CTA TCA G
8 GTG CTC ATG GTG CAC GGT CTA CG
9 GAG GTT TAG GAT TCG TGC TCA TG
10 GTT TTT CTT TGA GGT TTA GGA TT
11 CCA，ACA，CTA，CTC，GGC，TAG，CAG，TC
12 GCC，CAA，CAC，CGG，CAT，AAA，GAA，TT
13 AGA，CCA，GTA，GAT，CCA，GAG，GAG，TT
14 AGA，GAG，GGG，AGC，GCC，ACC，AGA，AG
15 GGG，AGC，CAC，CTG，ATA，GCC，TTT，GT
16 CGT，CCA，CAA，ACA，CAA，CTC，CTC，CG
17 AGA，ATT，ACA，CGG，CGA，TCT，TTC，CG
阴性对照1 CAT GAG CAC GAA TCC TAT CCT AA
阴性对照2 CAA AGT GCG CTG CTG GCA GAT GC
表2 芯片筛选反义序列的活性验证
芯片信号 最大抑制率 IC50(nmol/L)
位点编号
杂交能力 切割前/切割后比值 (％)
1 37767 0.88 88.8 44.7
2 28804 0.91 50.2 ＞100
3 - - -48.3 ＞100
4 - - 28.1 ＞100
5 - - 30.7 ＞100
6 29406 2.70 81.9 50.2
7 20552 0.96 63.2 74.7
8 11223 0.44 87.2 41.6
9 44928 1.60 82.8 36.3
10 31185 0.54 -8.0 ＞100
11 14441 0.38 56.0 52.2
12 22415 0.51 73.2 47.3
13 - - - -
14 - - - -
15 - - - -
16 21492 0.53 72.5 66.5
17 26857 0.87 76.1 32.9