用组合酶制备水解明胶的方法 【技术领域】
本发明涉及一种用组合蛋白酶降解明胶制备水解明胶的方法。本发明能降低水解明胶的分子量，同时提高水解明胶溶液的稳定性，消除了异腥嗅味。
背景技术
水解明胶由于与明胶有相同的化学组成，保持着明胶所固有的营养功能，并且由于它的分子量低，使其在水中的溶解度增大，更易被人体吸收，从而使其营养功能得到进一步发挥，不仅在食品、医药、日化领域中，而且在纺织、印染、涂料、造纸和化工等领域也得到了广泛的应用。明胶酶降解制备水解明胶有三种方法，即酸法、碱法和酶法，其中酸法和碱法工艺简单、成本低，但是在水解过程中，化学键被切断的随机性大，因此反应不易控制，含盐量高。酶法明胶降解反应容易控制，得到的降解产物质量较好。目前，采用单酶降解明胶的产物分子量一般在4000左右。北京化工大学黄明智等人在“AS1.398中性蛋白酶制备水解明胶”(化学工业与工程2001年第2期第71页74页)中报道了AS1.398中性蛋白酶降解制备明胶。具体操作过程是将明胶配制成10％(质量分数)的水溶液，调节体系pH值为7.0(用柠檬酸和磷酸盐缓冲体系)，在45℃的条件下，加入2％(质量分数)的AS1.398中性蛋白酶，反应25分钟，杀酶，经过滤和滤液浓缩干燥，即得到明胶降解产物，分子量为约4800。目前水解明胶产品都不同程度的存在异腥嗅味。水解明胶是一种多肽，易被细菌等分解，储存稳定性较差。
随着水解明胶的开发应用，要求有不同分子量的系列水解明胶产品，同时要求制品稳定性好、无异味。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种用组合酶制备低分子量地水解明胶的方法。其产品是一种分子量小、无异味、水溶液稳定性高的水解明胶。
本发明用组合酶制备水解明胶的方法，与单酶制备水解明胶的方法相同的是将原料明胶配制成水溶液，用柠檬酸和磷酸盐缓冲体系调节体系pH值；加热到反应温度，将酶投入到明胶溶液中搅拌，经加热杀酶，过滤、浓缩、干燥，即得到水解明胶。本发明的技术特征在于：所采用的酶为组合酶，组合酶含AS1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或菠萝蛋白酶中的任意两种，反应温度取组成组合酶的单酶合适温度范围内，体系pH值为5～8.5，反应时间为0.5～5小时。单酶的加入量是明胶重量的0.01％～2％。组合酶为AS1.398中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，反应温度为45～65℃，pH为5～8。组合酶为胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，反应温度为45～65℃，pH为5～8.5。组合酶为胰蛋白酶和AS1.398中性蛋白酶，反应温度为45～65℃，pH为7～8.5。组合酶为菠萝蛋白酶和AS1.398中性蛋白酶，反应温度为45～50℃，pH为7。组合酶为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，反应温度为50～65℃，pH为5～8。组合酶为胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，反应温度为45～50℃，pH为7～8.5。用组合酶中的全部单酶混合后进行明胶降解或将其中一种单酶先降解后再加入另一种单酶进行降解。
酶是生物催化剂，具有高度专一性。即不同的蛋白酶作用于不同的肽键。因此用专一性不同的蛋白酶组合对明胶进行降解，可以进一步的调控水解明胶的分子量和分子量分布。正是由于各种蛋白酶专一性程度的不同，在用它们作催化剂降解明胶时所得到的肽段长度不一样，即分子量及其分布不同，并且其产物的末端氨基酸也各异。本发明用这一原理来达到获得降解产物分子量小的目的。
从现有技术可知，用单酶制备水解明胶，AS1.398中性蛋白酶的合适温度为45℃左右，最适pH值为7；木瓜蛋白酶合适温度65℃，最适pH值为5～8；胰蛋白酶合适温度45℃，最适pH值为7.5～8.5；菠萝蛋白酶合适温度50℃，最适pH值为7。
本发明的原料明胶包括皮明胶和骨明胶。
组合酶反应温度和体系合适pH的选择原则：在组合酶反应温度应在的各单酶的合适温度及pH的范围内，即：不超过合适温度较高的单酶合适温度，也不低于合适温度较低的单酶合适温度。
本发明用柠檬酸盐和磷酸盐缓冲溶液调节体系pH，柠檬酸盐和磷酸盐缓冲溶液的配制与公知的单酶制备水解明胶的方法完全相同。
本发明制备的水解明胶的测试结果列入表1中，有关测试的方法如下：
分子量的测定方法：采用凝胶过滤色谱测定水解明胶的分子量。
水解明胶溶液稳定性测定方法： 取1.5g水解明胶加水配制成15％的溶液，在室温下放置，每隔7天测定分子量和透明度。在7天内分子量和透明度有明显变化为稳定性差；在15天以内分子量和透明度有明显变化为稳定性较差；6个月以上分子量和透明度没有明显变化为稳定性好。
嗅味测定：在室温下，将水解明胶加水配制成15％的溶液，嗅其气味。
从表1可以看出，本发明水解明胶皆无异腥嗅味，而对比例得到的产物都有异腥嗅味，说明组合酶具有消除异味的作用。本发明的水解明胶水溶液稳定性可高达1年，而单酶降解明胶得到的样品有异腥味，存放一周左右浑浊变质。证明了组合酶在消除异味的同时使水解明胶的稳定性得到了提高，解决了水解明胶溶液稳定性差这一难题，为产品的推广应用奠定了良好的基础。
【具体实施方式】
实施例1
将明胶10克加水90mL配制成水溶液，用柠檬酸盐和磷酸盐缓冲溶液调节体系的pH值为7；升温到50℃溶解，然后，加入胰蛋白酶0.01克和木瓜蛋白酶0.1克，反应1小时，加热90～100℃杀酶，过滤，浓缩，干燥，即得明胶降解产物，测定产物的分子量，测定水溶液的稳定性和嗅味，结果如表1所示。
实施例2
将明胶10克加水90mL配制成水溶液，用柠檬酸盐和磷酸盐缓冲溶液调节体系的pH值为7；升温到45℃溶解，然后，加入胰蛋白酶0.05克，反应2小时，加热90～100℃杀酶，过滤，降温到65℃，再加入木瓜蛋白酶0.1克，反应1小时，加热90～100℃杀酶，过滤，浓缩，干燥，得到产物，测定产物的分子量，测定水溶液的稳定性和嗅味，结果如表1所示。
实施例3
将明胶10克加水90mL配制成水溶液，用柠檬酸盐和磷酸盐缓冲溶液调节体系的pH值为8；升温到45℃溶解，然后，加入胰蛋白酶0.05克、AS1.398中性蛋白酶0.2克，反应3小时，加热90～100℃杀酶，过滤，浓缩，干燥，即得明胶降解产物，测定产物的分子量，测定水溶液的稳定性和嗅味，结果如表1所示。
实施例4
将明胶10克加水90mL配制成水溶液，用柠檬酸盐和磷酸盐缓冲溶液调节体系的pH值为7.0；升温到50℃溶解，然后，加入菠萝蛋白酶0.01克、AS1.398中性蛋白酶0.2克，反应0.5小时，加热90～100℃杀酶，过滤，浓缩，干燥，即得明胶降解产物，测定产物的分子量，测定水溶液的稳定性和嗅味，结果如表1所示。
实施例5
将明胶10克加水90mL配制成水溶液，用柠磷酸和檬酸盐缓冲液调节体系的pH值为5.0；升温到65℃溶解，然后，加入木瓜蛋白酶0.1克、AS1.398中性蛋白酶0.2克，反应2小时，加热90～100℃杀酶，过滤，浓缩，干燥，即得明胶降解产物，测定产物的分子量，测定水溶液的稳定性和嗅味，结果如表1所示。
对比例1
将明胶10克加水90mL配制成水溶液，用柠磷酸和檬酸盐缓冲液调节体系的pH值为7.0；升温到45℃溶解，然后，加入AS1.398中性蛋白酶0.2克，反应2小时，加热90～100℃杀酶，过滤，浓缩，干燥，即得明胶降解产物，测定产物的分子量，测定水溶液的稳定性和嗅味，结果如表1所示。
对比例2
将明胶10克加水90mL配制成水溶液，用柠磷酸和檬酸盐缓冲液调节体系的pH值为7.5；升温到65℃溶解，然后，加入木瓜蛋白酶0.1克，反应5小时，加热90～100℃杀酶，过滤，浓缩，干燥，即得明胶降解产物，测定产物的分子量，测定水溶液的稳定性和嗅味，结果如表1所示。
对比例3
将明胶10克加水90mL配制成水溶液，用磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液调节体系的pH值为7；升温到50℃溶解，然后，加入菠萝蛋白酶0.05克，反应2小时，加热90～100℃杀酶，过滤，浓缩，干燥，即得明胶降解产物，测定产物的分子量，测定水溶液的稳定性和嗅味，结果如表1所示。
表1
序号 分子量Mn 嗅味 稳定性
实施例1 2600 无 好
实施例2 3000 无 好
实施例3 2500 无 好
实施例4 2100 无 好
实施例5 2800 无 好
对比例1 4800 异腥味 差
对比例2 4000 异腥味 差
对比例3 3800 异腥味 差