一种免疫球蛋白及其制备方法和应用 技术领域
本发明涉及一种免疫球蛋白及其制备方法。同时，本发明还涉及该免疫球蛋白在制药领域中的用途。
背景技术
急性出血性结膜炎(acute hemorrhagic conjunctivits，AHC)又称流行性出血性结膜炎(epidemic hemorrhagic conjunctivitis)。主要由肠道病毒70型(enterovirus type 70)，柯萨奇A24变异株(coxsackie A24)引起，是一种新型结膜角膜炎，1969年开始流行于东南亚，1971年传到我国，儿童比成人为轻，婴幼儿很少患该病。常发生于夏秋季节，具有高度的流行性，是中华人民共和国传染病防治法规定管理的丙类传染病之一。这种病的特点是潜伏期短，最短的仅2～3小时，多数病人在接触后24小时内发病；传染性强，常暴发流行，传播迅速。该病的症状比急性卡他性结膜炎严重。病人常有异物感，怕光、流泪、并有少量浆液性分泌物，约有半数病人球结膜下呈点状或片状出血，严重的可有角膜上皮受到连累，使视力受到明显的损害。可遍及整个球结膜，故称“红眼”。本病主要通过接触传染，病毒污染了水源(游泳池、澡塘等)，可造成大面积的流行。值得注意的是，虽然感染后能产生一定的免疫力，但不持久，所以不乏反复感染的病例，目前除采取一般的卫生措施外，尚无有效的预防和治疗措施。
研究表明，采用特异性免疫球蛋白针对致病病毒对症下药，具有预防和治疗效果，并有助于提高人群免疫力。但目前使用未经强化免疫的免疫蛋白，用量大且治疗效果欠佳，半衰期短。这些缺点使免疫球蛋白的生产和治疗成本增加，限制了它们在临床上的应用。
近年来，随着人们对鸡卵的大量研究，明确了鸡卵抗体(IgY)的许多重要特性：来源天然的鸡蛋中地特异性抗体，不含任何有毒物质，具有高效价、低交叉反应及较稳定的理化性质，并且耐酸、耐消化酶，故通过可直接到达病灶并发挥其生物学活性的特性活性，中和致病微生物引起的感染，阻断病毒的攻击，达到防病、治病的作用。
特异性鸡卵抗体抗体(IgY)对病原体感染的防治没有动物种属的差异，从而为在人类疾病防治方面的应用提供了前提条件。利用鸡卵抗体(IgY)产量高、分离纯化较简便，并具有很好的热稳定性和耐酸性的特性，通过生物工程技术提取纯化鸡卵中特异性抗体，制备出可方便使用的抗肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24变异株的IgY抗体制剂，以用于急性出血性结膜炎的预防和治疗。
实验已经证实，特异性的鸡卵抗体可保护动物免受肠道病毒70型和柯萨奇A24变异株的感染，其不仅可以完全保护免受病毒的感染而不出现症状，并且对已感染病毒者具有一定疗效。以上研究结果及IgY的特点提示制备抗肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24变异株的IgY抗体及其混合物可望成为一种效果明显、无毒副作用的药品或消毒剂添加剂，因此，对其研究、开发可以产生十分明显的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种制备成本低、疗效高、生物活性稳定的免疫球蛋白。
本发明的第二个目的是提供所述的免疫球蛋白的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种用所述的免疫球蛋白制成的组合物。
本发明的第四个目的是提供所述的免疫球蛋白在制药领域中的用途。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
本发明提供了一种免疫球蛋白，该免疫球蛋白可由下述方法制备获得：采用无特定病原体(SPF)产蛋母鸡分别进行肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型强化免疫；采用无菌磷酸缓冲液匀化免疫鸡卵卵黄，加入聚乙二醇6000，经离心15～20分钟，收集上清，加入聚乙二醇6000，离心20分钟，收集沉淀，用无菌磷酸缓冲液溶解沉淀，加入聚乙二醇6000，离心20分钟，完成脱脂；收集沉淀，进行PEGDEAE-Sephacel柱层析凝胶过滤脱盐、层析，采用磷酸缓冲液洗脱目的蛋白；50％饱和度硫酸铵浓缩目的蛋白；用无菌磷酸缓冲液在4℃～8℃下透析，获得提纯的特异性鸡卵抗体，即本发明的免疫球蛋白。
本发明提供了一种免疫球蛋白的制备方法，该方法包括下述顺序的步骤：
(1)采用无特定病原体(SPF)产蛋母鸡分别进行肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型强化免疫；
(2)采用pH为7.5～8.0 10mM的无菌磷酸缓冲液匀化免疫鸡卵卵黄；
(3)加入体积质量百分比为3.5％的聚乙二醇6000，经8000～10000转/分钟离心15～20分钟，收集上清，加入体积质量百分比为8.5％的聚乙二醇6000，10000转/分钟，离心20分钟，收集沉淀，用pH为7.5～8.0 10mM无菌磷酸缓冲液溶解沉淀，加入体积质量百分比为12％的聚乙二醇6000，10000转/分钟离心20分钟，完成脱脂；
(4)收集沉淀，进行PEGDEAE-Sephacel柱层析凝胶过滤脱盐、层析，采用250nM磷酸缓冲液pH8.0洗脱目的蛋白；50％饱和度硫酸铵浓缩目的蛋白；用pH为7.5～8.0，10nM无菌磷酸缓冲液在4℃～8℃下透析，获得提纯的特异性鸡卵抗体，即本发明的免疫球蛋白。
本发明用所述的免疫球蛋白配制组合物，例如制备成滴眼剂或眼药膏。
所述的滴眼剂由下述方法制备获得：用适量乙醇溶解1克天然冰片，过滤，待用；适量注射用水溶解0.5克硼酸，过滤，待用；适量透明质酸钠，4毫克免疫球蛋白；将以上组份混匀，注射用水定容100毫升，即得所需的滴眼剂。
所述的眼药膏是由下述方法制备获得：取0.5毫升无菌液体石蜡，4毫克免疫球蛋白，注射用水2毫升，眼膏基质加至100克，即得所需的眼药膏。
本发明提供了所述的免疫球蛋白在制备预防、治疗急性出血性结膜炎的药中的应用。该免疫球蛋白具有较高的抗病毒活性，由它们作为有效成份的滴眼剂可应用于预防、治疗病毒性结膜炎。
本发明的有益效果：
1.本发明的分离、提取、纯化技术，可以使免疫球蛋白纯度达到95％，本发明的有效成分是配制滴眼剂和眼药膏药物的理想用品，它们被应用于防治因肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型感染引起的急性出血性结膜炎，特异性强，治愈率高，效果优于常规药。
2.本发明提供的抗肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型的特异性免疫球蛋白组合物经大量动物实验和临床实验表明对肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型感染具有被动免疫保护作用，治疗效果明显优于其他常规用药。经安全性试验表明安全无毒。
3.本发明系统的试验结果为从实验室研究阶段走向消毒剂、保健品、药物的产业化提供了确切依据。
附图说明
图1是肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型IgY抗体10％SDS凝胶电泳结果。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例和典型应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1
肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型的培养和收集：病毒培养48-72小时，至细胞病变达75％时收获病毒。病毒培养液反复冻融三次，间断超声破碎细胞，3500转/分钟离心20分钟，收集上清；35000转/分钟离心3小时，收集沉淀，磷酸缓冲液(PBS)悬浮沉淀，等体积蔗糖垫底，40000转/分钟离心3小时，收集沉淀。浓缩液进行免疫学、蛋白浓度和CPE测定。
实施例2
产蛋鸡的筛选和免疫：给三月龄无特定病原体(SPF)产蛋母鸡注射抗禽流感、抗鸡瘟等五价疫苗，观察二周无异常后，每只鸡于大腿内侧多点肌肉注射不完全福氏佐剂乳化包被的灭活病毒液(100TCID50)；间隔2周加强免疫注射一次；定期检测血清及卵黄免疫球蛋白效价。
实施例3
特异性蛋白的分离和纯化：免疫鸡卵表面75％酒精无菌处理，去蛋清后匀化处理，按1∶4加入pH7.6 10mM的无菌磷酸缓冲液匀化，3.5％(V/W)的PEG6000搅拌加入，10000转/分钟离心20分钟，收集上清，8.5％(V/W)的PEG6000搅拌加入，10000转/分钟离心20分钟，收集沉淀，以卵黄等体积的pH7.6 10mM磷酸盐缓冲液，溶解沉淀，12％(V/W)PEG6000搅拌加入，10000转/分钟离心20分钟，收集沉淀，以少量pH8.0 25mM磷酸缓冲液溶解沉淀。经DEAE-Sephacel柱层析凝胶过滤纯化，收集免疫球蛋白峰，硫酸铵浓缩4℃透析。
实施例4
IgY抗体滴度检测：使用提纯后的IgY，用微量病毒中和实验检测其抗体滴度，明确抗体产生的动态情况，并根据此结果确定最佳免疫策略；IgY抗体滴度检测结果表明，所制备的特异性免疫球蛋白对：肠道病毒70型的中和效价为1∶1280；对柯萨奇病毒A24型的中和效价为1∶1280；纯化的免疫球蛋白进行免疫学、电泳和蛋白浓度的测定结果：获得的7S免疫蛋白，蛋白质分子量约为180KD，两个亚单位，67-70KD的重链和22-30KD的轻链；蛋白平均浓度为：2.0-2.5mg/ml。
实施例5
理化及稳定性实验：确定其理化特性和不同保存条件下的稳定性。理化及稳定性实验结果：肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型IgY抗体在37℃储存6个月后抗体滴度基本无变化，肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型IgY抗体在不同pH条件下抗体滴度基本无变化。试验结果见表1.及表2.
表1.37℃储存后抗体滴度变化情况
时间(月)
抗体
1 2 3 4 5 6肠道病毒70型IgY抗体 1280 1280 1280 1280 640 640柯萨奇病毒A24型IgY抗体 1280 1280 1280 1280 640 640
表2.不同pH条件下抗体滴度变化情况
pH
抗体
2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0肠道病毒70型IgY抗体 640 640 1280 1280 1280 1280柯萨奇病毒A24型IgY抗体 640 640 1280 1280 1280 1280
应用实施例1
急性毒性试验：取18-20克 Balb/C小鼠，随机分不同剂量组，经眼部给予不同剂量免疫球蛋白，观察2周。急性毒性试验结果表明，每只小鼠给予0.5mg免疫球蛋白/g体重(相当于有效剂量的50倍)，受试小鼠全部存活，未见明显毒性反应。
应用实施例2
病毒攻击实验：将抗病毒免疫球蛋白倍比稀释，分别与待感染病毒混合，37℃作用1小时，对正常成年兔攻毒，24小时内以是否出现出血性结膜炎分析结果。
应用实施例3
建立病毒感染动物模型：以成年兔作为实验对象，分组分别经眼部感染不同剂量的肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型，观察出现急性出血性结膜炎表现与病毒剂量的关系，确定病毒TCID50的剂量，以建立稳定的实验动物模型；
应用实施例4
药效学实验：在实验动物模型上观察IgY抗体在防治肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型感染中的疗效，根据对照确定其最佳使用剂量、剂型和时间；药效学实验结果：给予IgY 10μg/g体重，可使给药组提早恢复，对于保护组可免于结膜炎，并与对照组之间存在显著差别。实验结果见表3.
表3.药效学实验结果
组 别
未给药组 给药组 保护组(提前给药组)动物数量(只) 10 10 10痊愈时间(天) 7-10 4-6 未发现感染有效率(％) 痊愈后个别有反复感染 100％ 100％