色素 本发明涉及鲑亚目鱼饲料中的新色素，含该色素的新饲料和该色素的应用。该色素还适用作加速养殖鱼生长的作用剂。
在养殖的鲑亚目鱼饲料中必须添加色素以得到所要求的鲜鱼肉颜色。最常用的色素是虾青素，不过，也可应用其它色素(例如，鸡油菌素)。这些色素都是类胡萝卜素。这样的色素暴露于空气中和在较高温度下很不稳定。所以，这些色素在饲料加工和贮存期间有一定程度的降解。
此外，可商购的虾青素产品很贵，而且它们的生物保留率很低。如上所述，虾青素是一种很不稳定的化合物，这当然是又一个缺点。虾青素的低稳定性是由于氧化作用地缘故。商品色素产品都经过配制以避免或减小氧化。虾青素的典型配方是与明胶和淀粉复配。然而，应用的配方就色素的生物利用率来说通常不是最适宜的。
在挪威专利No.309386(NO-309386)中，公开了在一定程度上解决上述问题的一种新色素。该色素包括用羧酸制备的虾青素二酯，其中所述羧酸是ω-3脂肪酸和/或具有1～12个碳原子的羧酸。NO-309386中还公开了一种包含所述虾青素二酯的鲑亚目鱼饲料，以及所述虾青素二酯作为鲑亚目鱼饲料的色素的应用。
在挪威专利申请No.20013354(NO-20013354)中，公开了NO-309386的虾青素二酯在加速养殖的鱼生长中的应用。
当分别用作色素和生长提高剂时，用如NO-309386和NO-20013354中所定义的相同羧酸制备的鸡油菌素和其它类胡萝卜素的二酯将有望给出与这两份专利说明书中所述类似的效果。
通过NO-309386，发现了比游离虾青素和其它商品化色素产品更稳定的、生物利用率更高的色素。尽管NO-309386的色素与游离虾青素和其它商品化色素产品相比得到了改善，但它不是最适宜的，所以，在水产养殖业中仍然强烈希望和需要寻找适用于鲑亚目鱼饲料生产的、稳定的而且甚至在生物上更有效的色素。
虾青素在3和3′位置具有两个不对称碳原子，并且存在三种旋光异构体，即对映体(3R，3′R)和(3S，3′S)，以及内消旋形式(3R，3′S)(图1)。
图1：虾青素的旋光异构体
化学合成给出这些旋光异构体的等量混合物。因此工业生产的合成虾青素(它目前是加到水产养殖的鲑鱼饲料中的主要色素形式)是大致比率为1∶2∶1的(3R，3′R)-、内消旋-和(3S，3′S)-虾青素的混合物。另一方面，来自天然源的虾青素的旋光异构体组成因来源的不同而在宽范围内变化。藻Haematococcus pluvialis中的主要异构体是(3S，3′S)，而酵母Phaffia rhodozyma主要具有(3R，3R′)-虾青素[Johnson，E.A.和An，G.H.，CRC Critical Reviews in Biotechnology 11(1991)297]。
通常认为，当喂食含有呈游离形式的(即未酯化的)虾青素的食物时，虾青素的旋光异构体被同样好地吸收并沉积在鲑亚目鱼的鱼肉中[Foss，P.等，水产养殖(Aquaculture)，41(1984)213-226；Kamata等，Nippon Suisan Gakkaishi 56(1990)789]。另一方面，当喂食含有呈酯形式的色素时，鲑亚目鱼可能对于吸收和沉积虾青素的旋光异构体表现一定的选择性。已知鲑亚目鱼利用(3R，3′R)-虾青素的二棕榈酸酯比利用(3S，3′S)-虾青素的二棕榈酸酯更好[Torrissen，O.J.等，CRCCritical Reviews in Aquatic Sciences 1(1989)209；Foss，P.等，水产养殖，65(1987)293；Katsuyama等，比较生物化学与比较生理学86B(Comp.Biochem.Physiol.86B，(1987)1；Schiedt，K.等，纯化学和应用化学(Pure & Appl.Chem.)，57(1985)685)。然而，野生鲑鱼在肉中具有与它们的食物中存在的大致相同的虾青素立体异构体分布，即使所述食物主要含二酯[Lura，H.等，Can.J.Fish Aquat.Sci.，48(1991)429；Turujman，S.A.等，JAOAC 80(1997)622]。这暗示可能的异构效果是适中的。
如下文实施例1中所述，按和以前描述的相同方法(NO-309386)，用合成虾青素与ω-3脂肪酸的二酯和来自鲑鱼肠的粗酶制剂进行水解试验。分析反应产物的立体异构体组成。将结果给出于表1中。
实施例1
通过常规化学合成从商购的合成虾青素与ω-3脂肪酸浓缩物制备虾青素的二酯，所述浓缩物包含90％以上ω-3脂肪酸，主要是EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)。应用的虾青素是通过化学合成制备的，按关于二醇级分所述的方法测定的旋光异构体(3R，3′R)、内消旋体和(3S，3′S)的分布分别是25.9∶50.2∶23.9。
用从不久前喂食的鲑鱼(Salmo salar)肠新鲜制备的酶混合物处理起始虾青素二酯达48小时。然后，通过制备性薄层色谱法将色素分成三个级分；即，两个羟基都水解了的二醇级分，一个羟基水解了的单酯级分，和余下的二酯级分。通过与(-)-樟脑酰氯反应，将二醇级分中的虾青素转化为相应的(-)-樟脑酸的二酯，并且通过二樟脑酸酯的高效液相色谱(HPLC)测定虾青素旋光异构体的分布。先通过胆固醇酯酶催化的水解反应将单酯级分中的虾青素转化为二醇，随后用(-)-樟脑酸处理和如上述那样分析。利用胆固醇酯酶将剩余二酯级分中的虾青素转化为二醇的尝试没有成功，因为没有达到完全的转化。所以，没有测定剩余二酯级分中的虾青素旋光异构体分布。
鲑鱼肠酶混合物对虾青素的R构型表现出意外地高的对映选择性(表1)。虾青素二醇级分(即，游离的虾青素)几乎仅具有(3R，3′R)构型，只含痕量的内消旋形式。单酯级分主要包含内消旋形式的虾青素。没有获得剩余未水解二酯级分中的虾青素旋光异构体分布，不过，考虑到起始二酯、二醇和单酯级分的组成，很可能剩余二酯级分中主要具有(3S，3′S)形式的虾青素。不同级分中色素的相对摩尔量与基于旋光异构体分布预期的相符。
表1.得自鲑鱼肠的酶水解虾青素ω-3脂肪酸二酯的对映选择性研究结果 色素级分 (3R，3′R) 内消旋体 (3S，3′S) 起始二酯 25.9 50.2 23.9 单酯(酶处理后) 3.5 93.1 3.4 二醇(酶处理后) 94.6 5.4 NDa
aND：未检测到
基于前文引用的文献，可以期望对R构型的一定程度的对映选择性。但是，由于野生鲑鱼中的虾青素异构体组成与食物中的大致相同，用本发明的酯证实的极度专一性很意外。
这一意外的发现很重要。从NO-309386已知，增加的酶促水解和鲑鱼肉中虾青素的增加的淀积量相关。本发明证明了(3R，3′R)-和(3S，3′S)-异构体之间水解速度差异很大，表明基于(3R，3′R)-异构体的虾青素二酯比基于(3S，3′S)-异构体的二酯将具有显著更高的生物摄取量。本领域技术人员应懂得，虾青素的高生物摄取量表明好的色素形成效果。
基于纯化的立体异构成分的虾青素二酯产品将显然比外消旋的或不太纯的产品更昂贵。文献中关于对(3R，3′R)-异构体摄取的一定的优先性方面的论述一直没有这样启示本领域技术人员：生产(3R，3′R)-二酯的高成本会通过增大的生物利用率得到补偿。从酵母Phaffiarhodozyma生产虾青素的生产商的声明中强调了这一点。已知得自P.rhodozyma的虾青素主要包含(3R，3′R)-异构体。该生产商称，利用Phaffia产品的好处是它主要包含没有酯化的虾青素，人们认为它比酯化的虾青素被利用得更好(Igene Biotechnology Inc.的宣传小册子：‘ AstaXinNaturally！’，它是在2001年8月特隆赫姆的Aquanor展览会上分发的)。相反，本发明人证实，含ω-3脂肪酸的(3R，3′R)-虾青素二酯的生产，将给出比(3S，3′S)酯化产品所发现的明显更高的摄取量。利用合成的或天然的(3R，3′R)-虾青素的二酯当然观察到相同的效果。基于NO-309386的启示，本发明人认为，利用(3R，3′R)-虾青素和短链脂肪酸的二酯将具有相似的益处。
虾青素是很昂贵的，而且虾青素或其它类胡萝卜素的添加被认为是鲑鱼饲料的生产中最高的成本因素。本发明显示，生产由(3R，3′R)-虾青素和羧酸(其中该羧酸是ω-3脂肪酸和/或短链酸)的二酯组成的色素将具有商业价值。
为简便起见，下文的术语“ω-3脂肪酸”还用来表示ω-3脂肪酸的浓缩物。本领域技术人员将明白这一点。
本发明一个主要目的是提供一种鲑亚目鱼饲料的色素，它是稳定的并且比以前已知的鲑亚目鱼色素生物效果更好。
本发明另一个目的是提供一种色素，它可以以比以前已知的色素更少的量加到饲料中并且仍给出令人满意的肉色素形成。通过附后的权利要求实现了该目的和其它目的。
本发明一个优选的实施方案是(3R，3′R)-虾青素的二酯，其中该二酯是用ω-3脂肪酸制备的，所述脂肪酸包含总量为18～100％的二十碳五烯酸(EPA)(全部顺式C20：5 n-3)和/或二十二碳六烯酸(DHA)(全部顺式C22：6 n-3)。
本发明一个更优选的实施方案是(3R，3′R)-虾青素的二酯，其中该二酯是用ω-3脂肪酸制备的，所述脂肪酸包含总量为40～100％的二十碳五烯酸(EPA)(全部顺式C20：5 n-3)和/或二十二碳六烯酸(DHA)(全部顺式C22：6 n-3)。
本发明另一个优选的实施方案是(3R，3′R)-虾青素的二酯，其中该二酯是用ω-3脂肪酸制备的，所述脂肪酸包含8～98％的二十碳五烯酸(EPA)(全部顺式C20：5 n-3)和/或8～98％的二十二碳六烯酸(DHA)(全部顺式C22：6 n-3)。
本发明一个更优选的实施方案是(3R，3′R)-虾青素的二酯，其中该二酯是用ω-3脂肪酸制备的，所述脂肪酸包含25～98％的二十碳五烯酸(EPA)(全部顺式C20：5 n-3)和/或15～98％的二十二碳六烯酸(DHA)(全部顺式C22：6 n-3)。
本发明又一个优选的实施方案是(3R，3′R)-虾青素的二酯，其中该二酯是用ω-3脂肪酸制备的，所述脂肪酸包含大约50％的二十碳五烯酸(EPA)(全部顺式C20：5 n-3)和大约35％的二十二碳六烯酸(DHA)(全部顺式C22：6 n-3)。
本发明又一个优选的实施方案是(3R，3′R)-虾青素的二酯，其中该二酯是用短链羧酸甲酸制备的。
本发明的虾青素产品可从游离虾青素生产，它是通过化学、生物化学或酶促合成获得的。优选的是，用来生产本发明的虾青素产品的虾青素是从天然源获得的。
已知真菌Phaffia rhodozyma生产高百分含量的未酯化形式的(3R，3′R)-虾青素。所以，本发明一个优选的实施方案是从通过P.rhodozyma生产的虾青素制备的如前述定义的(3R，3′R)-虾青素二酯。
本发明的虾青素产品包含用羧酸制备的主要是(3R，3′R)-虾青素的二酯，其中所述羧酸是ω-3脂肪酸和/或具有1～12个碳原子的羧酸。
优选地，所述虾青素产品包含50～100％(3R，3R′)-虾青素的二酯，更优选的是，所述虾青素产品包含80～100％(3R，3R′)-虾青素的二酯，最优选的是，所述虾青素产品包含90～100％(3R，3R′)-虾青素的二酯。