多拷贝串联肽抗生素hPAB的制备 技术领域：
本发明涉及基因工程技术。
背景技术：
肽抗生素(peptide antibiotic)，也称抗微生物肽(antimicrobial peptide)，是一类由生物体基因编码且具有抗病原体感染功能的肽类活性物质，为机体免疫系统的重要组成部分(Fellermann K，et al.NEngl J Med..2003；348(4)：361-363)。它们多由12-50个氨基酸组成，分子量小，通常带有正电荷。研究表明，肽抗生素主要通过在细菌胞膜上打孔或形成离子通道而杀菌，这种独特的抗菌机制与传统抗生素截然不同，高效而迅速，且细菌对之不易产生耐药性。此外，肽抗生素还具有广谱而高效的抗菌活性，对G+菌、G-菌、真菌、带包膜病毒、原虫及肿瘤细胞都有着不同程度的杀灭作用(Hancock RE and Scott MG.Proc-Natl-Acad-Sci-U-S-A，2000；97(16)：8856-8861)，某些种类对临床上多种多药耐受菌的MIC仅在mg/L水平(饶贤才等，生命的化学，2001；21(5)：357-359)，可与传统抗生素中活性最强者相媲美。在病原菌对传统抗生素的耐药性问题日益严重的今天，肽抗生素有着广阔的应用前景。
高产率制备是肽抗生素开发应用的前提。然而，肽抗生素作为有杀菌活性的小肽分子，不宜直接利用原核表达系统进行表达生产。人们在实践中主要通过筛选一个承载分子，构建其与肽抗生素的融合蛋白表达载体，从而解决肽抗生素的高效表达及对工程菌的毒性问题(Lee JH，et al.Biochem-biophy-Res，2000；227(4)：575-580)，但在获得融合蛋白后，又要将承载分子切去，最后制备目的肽抗生素的效率仍然很低。本发明采用多拷贝方式制备我们在前期工作中克隆的人源β型肽抗生素hPAB(human peptide antibiotics)。
hPAB是由42个氨基酸组成的碱性多肽，等电点8.79，分子量4236，氨基酸序列为：N-Gly-Ile-Gly-Asp-His-Val-Thr-Cys-Leu-Arg-Ser-Gly-Ala-Ile-Cys-His-His-Val-Ile-Cys-Pro-His-Arg-Ser-Arg-Gln-Ile-Gly-Thr-Cys-Gly-Val-Pro-Gly-Thr-Lys-Cys-Cys-Lys-Lys-Pro-Asn-C。本发明地目的就是要构建hPAB的多拷贝体，进而实现hPAB的高效率制备。
发明内容：
本发明根据hPAB氨基酸序列对应的核苷酸序列设计一对PCR引物，以含hPAB基因的PP-T重组质粒为模板扩增出目的基因，并克隆入pQE-32原核表达载体，进一步利用同裂酶构建多拷贝重组质粒，获得含多拷贝hPAB的重组工程菌，最后以发酵方式获得高纯度、高活性的肽抗生素hPAB。
技术方案的具体步骤为：
1.hPAB的核苷酸序列为：5’-GGCATCGGCGATCATGTTACCTGCCTTAGAAGTGGAGCCATTTGCCATCATGTCATATGTCCGCACAGGAGTAGGCAAATTGGCACCTGCGGTGTTCCTGGCACCAAATGTTGTAAAAAGCCAAAC-3’。克隆的技术路线如下：
BamHI AvaIII Asn hPAB Gly PstI Stop codon HindIII
2.根据上述克隆路线设计一对PCR引物：
上游引物P1：
下游引物P2：
3.PCR扩增：
以含hPAB基因的PP-T重组质粒为模板，用新合成的引物进行PCR扩增，反应总体积为50μl。经94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸40s扩增2个循环后，再进入94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，扩增25个循环，最后在72℃下延伸10min，1.2％琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。
4.目的片段的酶切消化：
取PCR反应获得的hPAB基因片段1μg，用BamHI、HindIII双酶切，然后电泳酶切产物，回收所需条带，溶于20μl重蒸水中；同样取pQE-32表达质粒1μg用BamHI/HindIII酶切，电泳并回收质粒片段，溶于20μl位点重蒸水中。
5.连接反应
取步骤④中回收的PCR产物和质粒各5μl，加T4DNA连接酶1.0μl，连接缓冲液1.5μl，重蒸水2.5μl，混匀后置16℃连接16小时。
6.转化实验
取步骤⑤所产生的连接产物6μl转化大肠杆菌JM109感受态。取100μl转化菌涂AMP平板，37℃培养过夜。
7.阳性克隆的筛选
在AMP平板上随机挑取5个AMP抗性菌落，接种于5ml含100μg/ml AMP的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，用BamHI，HindIII双酶切及AvaIII(载体上无此酶位点)单酶切初步筛选阳性克隆，最后通过测序鉴定。所确定的阳性重组子即为含单拷贝肽抗生素hPAB的重组质粒，命名为pQE-hPAB-1。
8.多拷贝体的构建
利用同裂酶AvaIII(识别序列为ATGCA↓T)和PstI(识别序列为CTGCA↓G)切割靶序列后可形成相同粘性末端的特性，在将两者分别酶切的产物用T4 Ligase连接后，连接处的碱基序列变为ATGCAG，不再为二者所识别。大量制备含单拷贝hPAB的pQE-hPAB-1质粒，把质粒分为两份，一份用XhoI+AvaIII双酶切后回收大片段(含单拷贝hPAB)，另一份用XhoI+PstI双酶切后回收小片段(含单拷贝hPAB)，将大、小片段用T4连接酶连接后即可得含双拷贝hPAB的重组质粒pQE-hPAB-2；若再将pQE-hPAB-2质粒分两份，一份用XhoI+AvaIII双酶切后回收大片段(含双拷贝hPAB)，另一份用XhoI+PstI双酶切后回收小片段(含双拷贝hPAB)，将大、小片段用T4连接酶连接后即可得含四拷贝hPAB的重组质粒pQE-hPAB-4；若将上述双酶切后含双拷贝hPAB的大片段与含单拷贝hPAB的小片段连接即可获得含三拷贝hPAB的重组质粒pQE-hPAB-3；如此重复，从理论上讲，可构建含任意拷贝hPAB的重组体。具体构建策略见附图-1所示。我们在实践中成功构建并获得了含1～8拷贝hPAB的重组质粒，分别命名为pQE-hPAB-1～8，用HindIII，BamHI双酶切可见含不同拷贝hPAB的目标片段(如附图-2所示)。
9.多拷贝融合蛋白的表达
将过夜培养的含多拷贝hPAB重组质粒的重组菌株按1∶20的比例加入含氨苄青霉素100mg/L的LB培养基中，37℃下以160rpm转速振摇培养3.5h，加入IPTG(终浓度为0.5×10-3mol/L)，37℃继续振摇培养诱导4.5小时。将诱导后的菌液取100μl，6000rpm离心5min，取沉淀用Tricine-SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况。考马氏亮蓝R250染色后可见各多拷贝重组体均可表达预期大小的目的融合蛋白，表达量占细菌总蛋白的15～25％(如附图-3所示)。
10.最佳多拷贝重组菌的筛选
分别诱导表达2～8拷贝重组工程菌，提取包涵体，用8mol/L尿素溶解。然后根据工程菌稳定性、融合蛋白表达量、融合蛋白的溶解性等指标来筛选最佳多拷贝重组菌。实验确定3拷贝重组菌为最佳重组菌，经实验室规模发酵、分离纯化后表明，三拷贝菌株具有良好的稳定性，表达量占菌体蛋白的20％，所表达的融合蛋白能被8mol/L尿素溶解完全溶解，说明三拷贝体工程菌符合后续的开发生产。
11.融合蛋白的亲和层析
大量培养三拷贝工程菌，诱导融合蛋白表达，提取包涵体，选用Ni-NTA纯化系统进行纯化。包涵体溶解液于4℃以13000g离心20分钟，吸取上清进行亲和层析，以buffer B(100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris-HCl，8mol/L Urea，pH6.3)冲洗层析柱，然后以buffer C(100mmol/L NaH2PO4，10mmol/L Tris-HCl，8mol/L Urea，pH4.5)洗柱，收集洗脱峰，即为目的融合蛋白。SDS-PAGE分析表明，三拷贝融合蛋白经亲和层析后纯度达86％。
12.融合蛋白的化学裂解
根据多拷贝体中各单体间有羟胺裂解位点(N-G)，三拷贝体经羟胺裂解后可获得3个单体。将洗脱的融合蛋白溶液调整为1.5mg/ml浓度，用10mol/LNaOH调pH到8.5，再加入8mol/L羟胺使终浓度为2mol/L，再用NaOH调pH到9.0。45℃搅拌裂解2小时，取10μl行SDS-PAGE电泳分析，确保裂解完全。
13.反向层析纯化hPAB单体
将羟胺裂解混合物用0.2μm的滤膜过滤，上样至Soucre 30 RPC反相层析柱(16×250mm)，上样缓冲液为含5％(v/v)乙腈的10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH4.4；用3倍柱床体积的复性缓冲液(0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0，0.3mol/L NaCl，3mmol/L还原型谷胱甘肽，0.3mmol/L氧化型谷胱甘肽)洗柱，使目的单体充分复性；再用60％的乙腈梯度洗脱，可收集两个洗脱峰，第一个峰出现在30％乙腈梯度处，为复性了的hPAB单体(占60％)，第二个峰出现在50％乙腈梯度处，为未复性的hPAB单体。
14.复性hPAB单体的离子交换层析纯化
将反向层析收集的第一峰冷冻抽干，用蒸馏水稀释为2mg/ml浓度，上样于Macro prepHigh S(Bio-Rad)阳离子交换柱(16mm×200mm)，平衡缓冲液为50mmol/L Tris-Cl，pH7.5，100mmol/L NaCl，再用NaCl梯度洗脱，收集洗脱峰。
15.目的肽的葡聚糖凝胶层析纯化
将离子交换的洗脱峰再用Bio-gel P6(分离Mr范围1×103～6×103)凝胶柱分离纯化，流动相为10mmol/L磷酸缓冲液，PH7.0，流速0.3ml/min。层析峰经Tris-Tricine电泳分析，纯度达98％。
16.重组hPAB的杀菌活性分析
将经上述工艺路线制备的hPAB用蒸馏水调整为1mg/ml浓度，点20μl于接种了各实验菌的平板上，37℃培养24小时，可见重组的hPAB对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌以及对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌等都有很好的杀菌活性。适合作为抗生素类药物进行开发研究。
以上这些技术步骤展示了本发明的实际应用。正如上所述，本发明通过基因工程技术实现了肽抗生素hPAB的多拷贝体构建，成功获得了可表达1～8个拷贝hPAB的工程菌株。可见，本发明构建肽抗生素的多拷贝体，从而将肽抗生素单体对原核微生物宿主细胞的毒性降到最低限度，实现了肽抗生素hPAB的高效表达。以优选的三拷贝菌株为例，虽然工程菌所表达的融合蛋白占细菌总蛋白的20％，但相对常规的制备单拷贝体的工艺技术而言，生产效率提高了200％。本发明探索出了重组hPAB特定的制备工艺，提供了工艺流程的详细步骤，制备的重组肽抗生素hPAB纯度达98％以上，满足新药制备的需要。
附图说明：
附图1肽抗生素hPAB多拷贝体构建示意图。
附图2多拷贝体的酶切鉴定。如图中所示，1～8拷贝体重组质粒分别经HindIII和BamHI双酶切后，左起第二至第八泳道显示了能从相应的阳性重组子中酶切出分别含一至八个拷贝hPAB基因的目的片段，第一泳道为分子量标准，自上而下分别为10000，8000，6000，5000，4000，3500，3000，2500，2000，1500，1000，750，500，250bp。
附图3多拷贝体的蛋白表达。将1～8拷贝的工程菌用IPTG诱导表达，Tricine电泳结果如图所示，左起第二至第八泳道显示了含相应阳性重组子的工程菌能表达预期大小的目标融合蛋白，表达量为宿主菌总蛋白的15～25％，其中，七拷贝重组菌表达的融合蛋白正好和宿主菌的一条蛋白带重叠。第一泳道为蛋白低分子量标准，自上而下分别为66，45，36，29，24，20.1，14.4kDa。
【具体实施方式】
本发明的发明人致力于解决肽抗生素生产过程中的低产率和高成本问题，成功地通过基因工程技术实现了肽抗生素hPAB多拷贝体的构建及在原核微生物宿主细胞中的高效表达，从而达到高效制备肽抗生素。采用三拷贝工程菌发酵，以30L发酵罐为例，每升发酵液收菌10克，30L共发酵30×10＝300克，2天为一个发酵周期，每周发酵3次，每个月发酵12次，共收菌300×12＝3600克；以表达量15％计，纯化效率50％，每个月可生产hPAB单体3600×15％×50％＝270克。每支药0.5毫克，共装270000÷0.5＝540000支，每支售价按20元计，月产值为540000×20＝10800000元，年产值为10800000×12＝129800000元，即1.298亿元。