对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸 【技术领域】
本发明涉及大肠杆菌O154型(Escherichia coli O154)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O154型中控制O-抗原合成地基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O154型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(19154)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Joumal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。19154年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的
志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]
【发明内容】
本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基合成酶基因，包括rmlA、rmlB、rmlC、rmlD基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf10基因；糖基异构酶基因，包括gne基因；转座酶基因，包括orf11基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O154型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O154型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O154型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O154型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O154型。
本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长13635个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸，其由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基合成酶基因，包括rmlA、rmlB、rmlC、rmlD基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf10基因；糖基异构酶基因，包括gne基因；转位酶基因，包括orf11基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的4654至5949碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的9127至9987碱基的核苷酸；rmlA是SEQ ID NO：1中的3177至4055碱基的核苷酸；rmlB是SEQ ID NO：1中的1135至2220碱基的核苷酸；rmlC是SEQID NO：1中的4060至4620碱基的核苷酸；rmlD是SEQ ID NO：1中的2220至3119碱基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO：1中的5942至7048碱基的核苷酸；orf8是SEQ ID NO：1中的8206至9099碱基的核苷酸；orf10是SEQ ID NO：1中的10159至11058碱基的核苷酸；gne是SEQ ID NO：1中的7071至8201碱基的核苷酸；orf11是SEQ ID NO：1中的11353至12012碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5537至5554碱基的核苷酸和5845至5862碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5109至5126碱基的核苷酸和5586至5603碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的9338至9355碱基的核苷酸和9695至9712碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9275至9294碱基的核苷酸和9707至9724碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O154型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O154型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O154型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O154型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管longPCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O154型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O154型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构；
(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O154型的O-抗原都是高度特异的。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长13635个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶的基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基合成酶基因(rmlA、rmlB、rmlC、rmlD基因)；糖基转移酶基因(orf6、orf8、orf10基因)；转座酶基因(orf11基因)；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括gne基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O154型的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O154型的O-抗原都是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O154型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4654至5949碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的9127至9987碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O154型是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O154型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O154型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O154型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O154型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O154型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。
实施例1：基因组的提取：
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O154型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O154型中的O-抗原基因簇：
以大肠杆菌O154型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCTGGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long TemplatePCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3：构建O-抗原基因簇文库：
首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇文库。
实施例4：对文库中的克隆测序：
从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O154型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O154型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1、orf2、orf3、orf4编码的蛋白与rmlB、rmlD、rmlA、rmlC基因编码蛋白有73-98％的序列一致性，84-98％的相似性，所以命名orf1、orf2、orf3、orf4为rmlB、rmlD、rmlA、rmlC。我们认为大肠杆菌O154的O抗原中有鼠李糖的存在。
Orf5和orf9是大肠杆菌O154种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf5编码的蛋白与Clostridium acetobutylicum的O-抗原转移酶有29％的序列一致性，55％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf5为wzx。Orf9编码的蛋白与Xanthomonas campestris pv.的O-抗原聚合酶有28％的一致性，47％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf9为wzy。
orf 6、8、10三个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有31-48％的序列一致性和55-68％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这四个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为4.4×e-8至3.1×e-21，因此我们推测这三个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O154的O-抗原的寡糖单位可能由四个单糖组成。由于这三个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf6，orf8和orf10。
实施例6：特异基因的筛选：
针对大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
表1列出了大肠杆菌O154型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O154型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共13组，它们的来源都列于表中。
在第13组中含有大肠杆菌O154型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O154型及其O-抗原是高度特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O154型中筛选到对大肠杆菌O154型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O154型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O154型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O154型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构，共由11个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。
SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120>对大肠杆菌O154型的O抗原特异的核苷酸
<130>对大肠杆菌O154型的O抗原特异的核苷酸
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>13635
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60
gaaaaccact tcgacacctc atatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt 120
caactgcttg cggaagtgca gtccatctgt ccaccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180
cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttgtgtg cacgacccgc cattggtgac 240
aacccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gtgatcgacg atgccagcgc cgacccgcta 300
cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaagtgctg 360
gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca tccagaccaa agaaccgctg 420
gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaagccgga tcagccgcag 480
acgctggact cagacgtcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540
gaacttgaac gtactcagcc tggtgcgtgg ggacgtattc agctgacaga tgcaattgct 600
gagctggcga aaaaacagtc cgttgatgca atgctgatga ccggcgacag ttacgactgc 660
ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg gactacgcaa cctcaaagaa 720
ggggcgaagt tccgtaaagg tattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccga 780
atgtaacggt tgataggaaa attataacgg cggtgaagat tcgctccgaa agtaatttgg 840
agcgaatctt cgggacgtta tttgtaaatt ttcataataa caaaagagtt atcaatagta 900
ttttagtcaa agttttcagg attttccttg tttccagagc ggattggtaa gacaattagc 960
ttttgaatct ttcgggtttg gcgcgggtgg acaacgctcg tcacatcgta gacatgcatg 1020
cagtgctctg gtagctgtaa agccaggggc ggtagcatgc attaatacct ctatcaatca 1080
aactgagagc cgcttatttc acagcatgct ctgaagtaat atggaataaa ttaagtgaaa 1140
atacttgtta ctggtggcgc aggatttatt ggttctgctg tagttcgtca cattataaat 1200
aatacgcagg atagtgttgt taatgtcgat aaattaacgt acgccggaaa cctggaatca 1260
cttgctgatg tgtctgattc tgaacgctat atttttgaac atgcggatat ttgcgatgct 1320
gctgcaatgg cacggatttt tgctcagcat cagccggatg cagtgatgca cttggctgct 1380
gaaagccatg ttgaccgttc aattacaggt cctgcggcat ttattgaaac caatattgtt 1440
ggtacttatg tccttttgga agccgctcgc aattactggt ctgctcttga tagcgacaag 1500
aaaaatagct tccgttttca tcatatttct actgacgaag tctatggtga tttgcctcat 1560
ccagatgaag taaataataa cgaagaatta cccttattta ctgagacgac agcttacgca 1620
ccaagcagcc cttattccgc atcaaaagca tccagcgatc atttagtccg cgcgtggaaa 1680
cgtacctatg gtttaccgac cattgtgact aactgttcga ataactacgg tccttatcac 1740
tttccggaaa aattgattcc actagtaatt cttaatgctc tggaaagtaa ggcattacct 1800
atttatggca aaggggatca aattcgtgac tggctgtatg ttgaagatca tgcgcgtgcg 1860
ttatataccg tcgtaaccga aggtaaagcg ggtgaaactt ataacattgg tggacacaac 1920
gaaaagaaaa acatcgatgt agtgctcact atttgtgatt tgttggatga gattgtaccg 1980
aaagagaaat cttatcgtga gcaaattact tatgttgccg atcgcccggg acacgatcgc 2040
cgttatgcga ttgatgcaga gaagattagc cgcgaattgg gctggaaacc gcaggaaacg 2100
tttgagagcg ggattcggaa gacagtggaa tggtacctgt ccaatacaaa atgggttgat 2160
aatgtgaaaa gtggtgccta tcaatcgtgg attgaacaga actatgaggg ccgccagtaa 2220
tgaatatcct ccttttcggc aaaacagggc aggtaggttg ggaactacag cgtgctctgg 2280
cacctctggg taatttgatt gctcttgatg ttcattccac tgattactgt ggtgatttta 2340
gtaatcctga aggtgtagct gaaaccgtca aaaaaattcg ccctgatgtt attgttaatg 2400
ctgctgctca taccgcagta gataaggctg agtcagaacc cgaatttgca caattactca 2460
atgcgaccag cgttgaatca attgcaaaag cggctaatga agttggggcc tgggtaattc 2520
atttctcaac tgattacgta ttccctggaa atggcgacac gccatggctg gagactgatg 2580
caactgcacc gcttaatgtt tacggtgaaa ccaagttagc tggagaaaaa gcattacaag 2640
agcagtgtgc gaagcacctt attttccgta ccagctgggt atatgcaggt aaaggaaaca 2700
attttgccaa gacaatgtta cgtctggcaa aagagcgtga agaattagcc gttattaatg 2760
atcagtttgg tgcgccaact ggcgcagagt tgctggctga ttgtacggca catgccatgc 2820
gtgtggcact gaataaaccg gaagtcgcag gtttgtacca tctggtagcc agtggtacca 2880
caacctggca cgattatgct gcgctggttt ttgaagaggc gcgcaaagca ggcatacccc 2940
ttgcactcaa caagctcaac gcagtagcaa caacagccta tcctacacca gctcgtcgtc 3000
cacataactc tcgccttaat acagaaaaat ttcagcagaa ttttgcgctt gttttgcctg 3060
actggcaggt tggcgtgaaa cgaatgctca acgaattatt tacgactaca gtaatttaat 3120
agtttttgca tcttgttcgt gatgatggag caagatgaat tgaaaggaat gatgaaatga 3180
aaacgcgtaa aggtattatt ttagcgggtg gttctggtac tcgtctttat cctgtgacta 3240
tggctgtcag taaacagcta ttacctatat atgataagcc gatgatctat tacccgcttt 3300
ctacactgat gttagcgggt attcgcgata ttttgattat cagtacgcca caggatactc 3360
ctcgttttca acaactgctt ggtgacggta gccagtgggg gctaaatctt cagtacaaag 3420
tgcaaccgag tccagatggt cttgcgcagg catttatcat cggtgaagag tttatcggtg 3480
gtgatgattg tgctttggtt ctcggtgata atatctttta cggtcacgat ctgccgaagt 3540
taatggatgt cgctgttaac aaagaaagtg gcgcaacggt atttgcctat cacgttaatg 3600
atcctgaacg ctacggtgtc gttgagtttg ataaaaacgg tacggcaata agcctggaag 3660
aaaaaccgtt acaaccaaaa agtaattatg cggtaactgg gctttatttc tatgataatg 3720
acgttgtcga aatggcgaaa aaccttaagc cttctgcccg tggcgaactg gaaattaccg 3780
atattaaccg tatatatatg gagcaggggc gtttatctgt tgccatgatg ggacgtggtt 3840
atgcatggct ggacacgggg acacatcaaa gtcttattga agcaagtaac ttcattgcaa 3900
caattgaaga gcgtcagggg ctgaaagttt cctgtccgga agaaattgct taccgtaaag 3960
gctttattaa tgctgaacaa gtgcaagtgt tagctgaatc gctaaagaaa aatgcttatg 4020
ggcagtattt attaaaggtg gttgaaggtt attaataaaa tgaaagtcat aaaaactagt 4080
attccggatg ttttaatttt tgaaccaaaa gtatatggag atgaacgtgg cttttttatg 4140
gaaagcttta atcaaaaagt tttcgatgag gctgtagggc gtaaaattga atttgtgcag 4200
gataaccact ctcaatctag taaaggcgtg ttgcgagggt tacattatca attagaacct 4260
tatgctcaag gaaagcttgt tcgctgtgtt gaaggtgaag tatttgacgt cgcagttgac 4320
atacgtaaat catcacccac ttttggacag tgggtaggtg tatatttaaa tgctaaaaac 4380
aagcgacaat tatggatacc ggaaggattt gctcatggat ttattgtaac tagcgaaaaa 4440
gccacattcc tttataaagc aactaattac tatatgccct ctcatgaagg tgggataata 4500
tggaacgata aatcattgaa tatacaatgg cctttaatga gagaaatgat tatatcagca 4560
aaagatcaac agcaaatatc gctgactgaa tatttagaaa ttgaatcatc aaaaaaatga 4620
tgagttggta taaacccaaa ccaaaactaa ctaatgatta gagatttcat gttaagattc 4680
ttttctaaca aagtaaaaga tcatgatttt ttgaaggtgt ttaccaatgc gtcatattta 4740
accatatcac aaggggtatc ttatttgata cccttaatta ctttaagtta tgttatatct 4800
ctattaggat tagaaaaatt tggtcgttac tctgtaatac taataactgc gacattactt 4860
caagtcgtga cagattatgg ttttatgttt atctcaccaa aagaaatatc tatgcaggtg 4920
ataataagca aaagagtatc aggaagtata tatatcaacc actatattaa agtcgttatt 4980
tctactgttg attttttgtt tttttataca atagtatgtt atttaataat agatgaatat 5040
gatttattaa ttaattttct acttggttat ttgattgtaa tatcacaatc tttatatcct 5100
acttggtttt tccaagggat acagaaaatg aaaataatag caggactttc tataattgca 5160
aaaattataa actgcttatt agttatattt tttttgaaaa ttagtgcaga gataaatatt 5220
ctaatattat cacaagcttt tccaatgttt gttgtgtcat tttatgcaaa tttaattata 5280
ataaaaaaat atatatatct cgtgaaacct tcttggactt cgattcgaac gttatttctt 5340
gaaggtagtg gtttattttt ggccaatata tcatcagcaa ttcttacaaa ctcaacaatt 5400
cctatactat ctatatatgc aactccgaca cagttaggtg cgtatgcagc aattgaaagg 5460
ataataaaat caatttatac aatttttttt cctatatcac aagcgatata tccttataat 5520
tgtaaacgtt tctcatatag cctgagtgat ggaattactg ctgtaaaaaa aaccggcata 5580
ccgatggtgg tatttgcttt gatcactagt gtttctattg tgattacttt ttatgtcatg 5640
agaaattata ttgatatata catttatcaa tatgtattag ttgtaatttt cctaagtcta 5700
tggcttattg tcggggtgat taataatgtc ttagggatac aatttctatg cgcatacaat 5760
tgtaaggatt tttatagtaa agcttttttt gtatcatctt cattaacgat accttttatg 5820
ttttggttta gttcttggat acctgcaatc ggtacttcgt ttgccgtttt gatgggtgaa 5880
tcattactag gggtaatact ttttataaag atctacaata ttaataaaag ggtgaaatta 5940
agtgattaat gtagttttct gtataaggaa agactggaag gagcgtcctg gaggagatgt 6000
gattcaattg gttgagacta agaacgcaat tgagtcagcg tataaatgct ctattaacat 6060
tatcagtgat ccggatgaaa ttttgaatat tcaccctgat attgtccaca tattcaatat 6120
gcaaactttt gaggaaagta agttatttct tacaaaagca aagcaaatcg gcgcattttg 6180
tgttctttct accgtttatt gggatatgca tgatgcattc tttgttaatg caatgcaaaa 6240
aatgcatatt tatcctagtg gaaaatattt tgaactttta aaaagagtat ttcatttaac 6300
gtgtaaagta agtgtttcta ttattaataa gccatattcg cttacaaata agtatagaaa 6360
agatatggct aactttctag gggagtttga tgcatggtta ccgaattcag aagaggagta 6420
tgaaataatt cagagagagt tcagattaaa aaaggaaaaa tatatagcct taaatgccgt 6480
aagtaataat gttttttgtt ttaattataa tgagaataga aatggcatat tatgtgttgg 6540
aagatttgaa ccaataaaaa atcagttatc tgtatgcaaa gcattattaa atacagaact 6600
caatttgata ttaattggag ctgctcacgc acataataaa gattacttaa aaaaaataca 6660
aaaagtcaat gctgttaata ataatattca cataatcact aaaaatatcg agcaatatga 6720
attaaatagt tattacaata aatgccgtgt ccatgtatta gcttcttttc gtgaatctcc 6780
tggtttaagt tcattagaag ctttagccac cggtgcaaat attgttgtat cttcaagcca 6840
gttttgtcca attgatactt actttaaaga gataattggg aaacatgtct ttttatgtaa 6900
tccatactcc ataagttcta taagaaaagc cattgaggat gcttataatg caccgctaat 6960
gcgtaaatcc attaatagat tttcatggga tctaacagca aagcagacct atttggctta 7020
tcaagagata ataaataaca gagattgata ttaaaatgac tacaaaaata atgttagtat 7080
ttggtacaag acctgaagcc attaaaatgg ctcctttagt aaatttatta aaaagagatt 7140
ctcgatatga atgtaaggtt tgtgtaactg gtcagcatag agaaatgtta catagtgtat 7200
tggatttatt tgatattaca ccagattaca atttaaatat aatgcggccg gaacaaagtt 7260
tatcgacaat tacagtcgat ataattaatg gtatgtcaga aatatttaaa aatttcaagc 7320
cagagctaat agcaattcat ggtgacacgt caacttcatt cgctgcctcg ttatcagcat 7380
actatcatca aattaaaatt gcacatattg aagctgggct cagaactggc aatttatatt 7440
ctccttggcc tgaagagggt aatagaaaat taacaggagt gcttgcggac ttccattttt 7500
gccctaccga attaactaaa cagaatttaa ttagagaagg cgttgagtta aacaaactgt 7560
ttataacagg aaatacggta attgattctt taatttatat aattaataaa attaaaaaag 7620
atggtgaatt gctaaattac ttacatgaga aattttcatt tattgatcaa tatcgcaaaa 7680
tgatactcat taccggtcat cggcgtgaaa attttggtac tggatttaaa aatatttgtc 7740
aggctataaa aaatctcgca attagtaatc cagatataat atttgtttat ccggttcatt 7800
taaatcctaa tgttcaagaa ccagtcaatt attacttaaa agatgttgat aatgtaaaat 7860
taattccacc tcaagaatat cttccatttg tttatttaat ggaacgttca tatattatct 7920
taactgattc acaggtattc aagaagaaga tccttccttg ggcaaacctg ttctcggtta 7980
tgcgtgaaac tactgaaagg ctagaagctt taaatgcggg taccgtgaag ttagttggta 8040
caaattatga tactatcatt aaggaatttg agtatctaat gaacgataag tcacattatg 8100
aaagtatgtc aaaatctact aatccatacg gaaatggtaa ttcatcaatt aaaattaaag 8160
aaataattga taattatttt tttaattcct tacaaggatg agaatatgaa taaacctaaa 8220
gttgctgttt tactggctac atacaatgga gagtgttgga tcagtgcaca aatcgatagc 8280
attcttgcac aaagagatgt cgacgttaca atttatataa gtgatgattg ctcaactgat 8340
aaaacaaaag agatttgcag taactattca gaaagattta ataatattaa gctactttca 8400
aattcagaac ggatgggggg cgcaagtgct aattttttcc gattattgct ttcaaatgag 8460
tatgatcaac atgattttgt tgctttatct gatcaagatg atatttggaa agaaaacaaa 8520
cttattcatg caattaaaca aattggaact gacggctttt attccagtaa tgtaactgca 8580
ttttatagcg atggaagaca agttttaata aataaatccc agaagatgac ctcctatgat 8640
tatttttttg aaggtggggg gcccggttgt acttacgtct tttcagttga aaatgcattc 8700
aaacttaggg aatttctagt taaacatgtt aatattctta aagatataac ctatcatgat 8760
tggtttatat atgcttttgc aagatcaaat aattataaat ggatcattga tccttggccc 8820
tcaatgtatt accgacagca cagcaataat caaataggtg ctaactcttc ttttggtgga 8880
atcattaaaa gattaaaaat gattagatca aaatggtata gaaaacaagt aactttgatc 8940
gctaatactt tagaagcagc ggattcttct aaaatacaaa aaaatctcaa tagaaattac 9000
tatggaaatc tattgttttc agttaacttt tataagttgc gacgctcata taaagataag 9060
atttttattt taatctttat gttgttgtat ctattttgat tatgataatt atataagatg 9120
gaacatatga acagagttta ctgtttgaat acaactttct taaacccatt aattcctata 9180
ttattaatgg tagctgtttt catattatca tcttttttgt ataaggttga tagtagttca 9240
cttgttatta ttatctcaac cttcttggtt atttccttta tcccattatc attctgtttt 9300
tcaagtaaat attatgtcaa tacatcaaac ctaagtctga agtcatttcc gttaccgtat 9360
acgacaacaa tcattataat tctatcaagc agtgttgaat attttaagtt aggaattcct 9420
ctttttggac atgttatata tgcagagttt gggtatcctt ttttgcacca tgtttcagtt 9480
atgtcatggt tattattatt tacatgtaat tcctttaaga atagaataat ttttatactt 9540
gtaatggttt ttgcatttgt taatccattg ttgatgatta atcgtgattt aatgctatta 9600
acttgttttg tctttatttt tatcctttta ggaaaacgaa aggttagtct aaaaccgata 9660
cttattttag ggagtatatt tctttttgtt tttggtttga tcggtgaata cagaagtcca 9720
ggtgtaatac attcagttga tttacctttt tctttcaact atgaaaaaat gccagcaacg 9780
atagcatggc tttttctata ttttacttct tcctgtttta atatgtatta taatattaaa 9840
acattaggct tgaatttata tgcaagtaat ataaatgttt tcccagaacc ctattactgg 9900
tcatcttttt ttgatagctt tatttttttc ctattgtcat tattttgtat tttattttac 9960
tgttatcaat tagacattat cttttaacaa aaaagacttc agaattaaca ttggcattat 10020
acctttattg tatcttccaa gtgtatacgg gattacttgc tgtaaaagtt tttaatacac 10080
gtacattatt tgttatgctt tttctaggag taatccaatt ctgtaatatt cttttaccta 10140
aaaagagacg ttcataacat gcataaacaa agagtagcta ttctcctatc tcattataat 10200
ggaagtgatt atttaagaga acagttaaat tctattctca accagaatgc agataatttt 10260
tctattgata tatatgtcag ggatgatggt tctaataatg ttaatttggt aaaccttcgg 10320
caaatgacat cctgtttacc tattaatgtt tttgagggaa gcaatatagg tgtgactaaa 10380
agttttttta ctctcttgga gcaggttgat tcatatgatt attatgcctt ttgcgatcag 10440
gatgatgttt ggcttgatga taaaatttca agcgcagtga ccatgatgaa ggattccgaa 10500
ggtccagtat tatactgttc agcttatacc ttggttgatg caaaattaaa tttgataaat 10560
tttgaaaatc acgtcaatga ttcttttgaa aatgcattat ttaaaaactt ttgcacaggt 10620
tgtacatgtt tgataaataa taagttacgc tcgattattt tgaaaactga ttatactaaa 10680
aatgtaccaa tgcacgattg gtggatgttg atggttgcat atttaacagg aacggttatt 10740
tttgatcaac aatcccatat cctttatcgg caacatggag gtaatgttgt cggtggtcga 10800
actagtttta taaaaaaaac aagaagattt atgtttaata ttttatctaa tgatgaaacc 10860
agatcaaaaa tgtatcagca actattgata agtaaagaat tgtataattc tgagaaagta 10920
gcgttattgg agcttatact gaacagtaaa agaaatattt ttcttagaat taagttggtt 10980
atgggcttag gggttaaata tgctaagaaa tacgaaagta ttctagttaa gtttcttatt 11040
ttaattggta ggttctaata taccttaaat agctgcgcgg aatagtagat cactttaagg 11100
gaacttagcc cggattgttt gatctgatca atcaccaaat caaaacaaat caccaaccgg 11160
actgagcgat gccgatcata gcaccaattc cccgtgacga acgacgcctg atgcagaaag 11220
caatccagaa aacgcacgat aaaaattatg cccgcagact gatggccata ctgatgctgc 11280
atcgggcgac ctcgttagcg atgttggcag aatgctctgc cgtggcagtt ccttcgtcgg 11340
acgctgaatt aattggttca cgctgtcggg tgttgcaaga ctgaaatcat tatctgccgg 11400
acgaccccac gctggccttt tgagcatatc tgcactttat tacgtgagct ggtaaacatg 11460
ctcacggcga ttttgggcta ccagcgctca ggcttgagta cagaacttct ggcaataaaa 11520
atcaatgaga taaccggctg ccagttatat gccgggaccg tttgccgctg gttgccgtct 11580
gcagggcttg tgtggcgaag ggccgcacca accctgcgta tccgtgaccc gcataaagat 11640
gaaaagatgg cggcaatcca caaagcactg gacgaatgct gcgcagagca tccggtcttt 11700
tatgaagatg aagtgtatat ccatcttaat cccaaaatcg gtgcagactg gcagctacgt 11760
ggacaacaga aacgcgtggt aacaccgggg cagaaggaaa aatattatct ggccggcaac 11820
agcaaaagtt caacgctgtt catcagcctg ctgaagcggc ttaaagcgac ataccgtcgg 11880
gcgaaaacca tcacgctgat cgtggacaac tacattatcc ataaaagccg ggaaacacag 11940
cgctggctga aggagaaccg aagttcagag ttatttatca gccggtttac tcgccattgg 12000
tgcatcatgt agaacggcta tggcaggcac ttcgcgacac aataacgcgc aatcatcagt 12060
gccggtcaat atggcaactg ctgaaaaaag ttcgccatgt tatggaaacc gtcagccatg 12120
ccctaaggca aacatgggct ggcaaaagtg tagcggtatt aggcgcagct atttataaga 12180
ttataaaact aatctattta acttaaaatt tactacctat aaactcatag ttgaatcgaa 12240
atttaattct taaactacac ctcttcatga tccccctgac tggagtaaac aatgtcaaag 12300
caacagatcg gcgtagtcgg tatggcagtg atggggcgca accttgcgct caacatcgaa 12360
agccgtggtt ataccgtctc tattttcaac cgttcccgtg agaagacgga agaagtgatt 12420
gccgaaaatc caggcaaaaa actggttcct tactatacgg tgaaagagtt tgttgaatct 12480
ctggaaacgc ctcgtcgcat cctgttaatg gtgaaagcag gtgcaggcac ggatgctgct 12540
attgattccc tcaagcctta cctcgataaa ggtgacatca tcattgatgg tggcaatacc 12600
ttcttccagg acaccattcg tcgtaaccgt gaactttctg ccgaaggctt taacttcatt 12660
ggtaccggtg tctccggtgg tgaagaaggc gcgctgaaag gtccttctat tatgcctggt 12720
gggcagaaag aagcctatga actggttgta ccaatcctga ccaaaatcgc cgcagtagct 12780
gaagacgggg agccatgcgt tacctatatt ggtgccgatg gtgcaggtca ctatgtgaag 12840
atggttcaca acggtattga atacggcgat atgcagctga ttgctgaagc ctattctctg 12900
cttaaaggtg gcctgaatct ttccaacgaa gaactggcgc agacctttac cgagtggaat 12960
aacggtgaac tgagcagcta cctgatcgac atcaccaaag atatcttcac caaaaaagat 13020
gaagacggta actacctggt tgatgtgatc ctggatgaag cagcaaacaa aggtacgggc 13080
aaatggacca gccagagtgc gctggatctt ggcgaaccgc tgtcgctgat taccgagtct 13140
gtttttgcac gttatatctc ttctctgaaa gatcagcgtg ttgccgcgtc taaagttctc 13200
tctggtccgc aagcgcagcc agcaggcgac aaagctgagt tcatcgaaaa agttcgtcgt 13260
gcgctgtatc tgggcaaaat cgtttcttac gcgcagggtt tctctcagct gcgtgctgcg 13320
tctgaagagt acaactggga tctgaactac ggcgaaatcg cgaagatttt ccgtgctggc 13380
tgcatcatcc gtgcgcagtt cctgcagaaa atcaccgatg cttatgccga aaatccgcag 13440
atcgctaacc tgctgctggc tccgtacttc aagcaaattg ccgatgacta ccagcaggcg 13500
ctgcgtgatg tcgttgctta tgcagtacag aacggtatcc cggttccgac cttcgcggca 13560
gcggttgcct attatgacag ctaccgcgcc gtagttctgc ctgcgaacct gattcaggct 13620
cagcgcgact actga 13635
表1大肠杆菌O154型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据 基因 功能 基因的碱基 位置 正向引物 反向引物 PCR产物 的长度产生正确大小电泳带的组数 PCR的退 火温度 (℃) Wzx O-抗原转运酶4654-5949 5537-5554 5845-5862 325bp 0* 56 5109-5126 5586-5603 494bp 0* 58 Wzy O-抗原聚合酶9127-9987 9338-9355 9695-9712 374bp 0* 56 9275-9294 9707-9724 449bp 0* 58
*只在大肠杆菌O154型中得到正确的一条带
表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号 该组中含有的菌株 来源
1、野生型大肠杆菌 O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20， IMVSa
O21，O22，O23，O24，O59
2、野生型大肠杆菌 O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O35，O36，O37， IMVSa
O38，O40，O41，O42，O43
3、野生型大肠杆菌 O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVSa
O57，O58，O60，O61，O62
4、野生型大肠杆菌 O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSa
O79，O80，O81，O82，O83
5、野生型大肠杆菌 O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101， IMVSa
O102，O103，O104，O106
6、野生型大肠杆菌 O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSa
O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128
7、野生型大肠杆菌 O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137， IMVSa
O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145
8、野生型大肠杆菌 O146，O147，O148，O150，O152，O153，O156，O157，O158， IMVSa
O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166 b
9、野生型大肠杆菌 O168，O169，O170，O171，O172，O173， c
D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12 d
10、野生型志贺氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d
B16，B17，B18
11、野生型志贺氏菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，FX变，FY变，DS，DR， d
12、野生型大肠杆菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151， IMVSa
O155，O124
13、第8组菌株加上大肠杆菌标准菌株O154 IMVS
*为了检测的方便，我们将每13-17个菌分为一组，总共13组
a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia
b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark
c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS
d.中国预防医学科学院流行病学研究所
表3 大肠杆菌O154型O抗原基因结构图
GalF RmlB RmlD RmlA RmlC wzx orf6 gne orf8 wzy orf10 orf11 gnd
表4大肠杆菌O154型O抗原基因簇基因位置
ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC 60
GAAAACCACT TCGACACCTC ATATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT 120
CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATCTGT CCACCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT 180
CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC 240
AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ATGCCAGCGC CGACCCGCTA 300
CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAAGTGCTG 360
GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TCCAGACCAA AGAACCGCTG 420
GACCGTGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTCATCG AAAAGCCGGA TCAGCCGCAG 480
ACGCTGGACT CAGACGTCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG 540
GAACTTGAAC GTACTCAGCC TGGTGCGTGG GGACGTATTC AGCTGACAGA TGCAATTGCT 600
GAGCTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCA ATGCTGATGA CCGGCGACAG TTACGACTGC 660
GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTCAAAGAA 720
GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG TATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGA 780
ATGTAACGGT TGATAGGAAA ATTATAACGG CGGTGAAGAT TCGCTCCGAA AGTAATTTGG 840
AGCGAATCTT CGGGACGTTA TTTGTAAATT TTCATAATAA CAAAAGAGTT ATCAATAGTA 900
TTTTAGTCAA AGTTTTCAGG ATTTTCCTTG TTTCCAGAGC GGATTGGTAA GACAATTAGC 960
TTTTGAATCT TTCGGGTTTG GCGCGGGTGG ACAACGCTCG TCACATCGTA GACATGCATG 1020
CAGTGCTCTG GTAGCTGTAA AGCCAGGGGC GGTAGCATGC ATTAATACCT CTATCAATCA 1080
rmlB的起始
AACTGAGAGC CGCTTATTTC ACAGCATGCT CTGAAGTAAT ATGGAATAAA TTAAGTGAAA 1140
ATACTTGTTA CTGGTGGCGC AGGATTTATT GGTTCTGCTG TAGTTCGTCA CATTATAAAT 1200
AATACGCAGG ATAGTGTTGT TAATGTCGAT AAATTAACGT ACGCCGGAAA CCTGGAATCA 1260
CTTGCTGATG TGTCTGATTC TGAACGCTAT ATTTTTGAAC ATGCGGATAT TTGCGATGCT 1320
GCTGCAATGG CACGGATTTT TGCTCAGCAT CAGCCGGATG CAGTGATGCA CTTGGCTGCT 1380
GAAAGCCATG TTGACCGTTC AATTACAGGT CCTGCGGCAT TTATTGAAAC CAATATTGTT 1440
GGTACTTATG TCCTTTTGGA AGCCGCTCGC AATTACTGGT CTGCTCTTGA TAGCGACAAG 1500
AAAAATAGCT TCCGTTTTCA TCATATTTCT ACTGACGAAG TCTATGGTGA TTTGCCTCAT 1560
CCAGATGAAG TAAATAATAA CGAAGAATTA CCCTTATTTA CTGAGACGAC AGCTTACGCA 1620
CCAAGCAGCC CTTATTCCGC ATCAAAAGCA TCCAGCGATC ATTTAGTCCG CGCGTGGAAA 1680
CGTACCTATG GTTTACCGAC CATTGTGACT AACTGTTCGA ATAACTACGG TCCTTATCAC 1740
TTTCCGGAAA AATTGATTCC ACTAGTAATT CTTAATGCTC TGGAAAGTAA GGCATTACCT 1800
ATTTATGGCA AAGGGGATCA AATTCGTGAC TGGCTGTATG TTGAAGATCA TGCGCGTGCG 1860
TTATATACCG TCGTAACCGA AGGTAAAGCG GGTGAAACTT ATAACATTGG TGGACACAAC 1920
GAAAAGAAAA ACATCGATGT AGTGCTCACT ATTTGTGATT TGTTGGATGA GATTGTACCG 1980
AAAGAGAAAT CTTATCGTGA GCAAATTACT TATGTTGCCG ATCGCCCGGG ACACGATCGC 2040
CGTTATGCGA TTGATGCAGA GAAGATTAGC CGCGAATTGG GCTGGAAACC GCAGGAAACG 2100
TTTGAGAGCG GGATTCGGAA GACAGTGGAA TGGTACCTGT CCAATACAAA ATGGGTTGAT 2160
rmlB的终止 rmlD的起始
AATGTGAAAA GTGGTGCCTA TCAATCGTGG ATTGAACAGA ACTATGAGGG CCGCCAGTAA 2220
TGAATATCCT CCTTTTCGGC AAAACAGGGC AGGTAGGTTG GGAACTACAG CGTGCTCTGG 2280
CACCTCTGGG TAATTTGATT GCTCTTGATG TTCATTCCAC TGATTACTGT GGTGATTTTA 2340
GTAATCCTGA AGGTGTAGCT GAAACCGTCA AAAAAATTCG CCCTGATGTT ATTGTTAATG 2400
CTGCTGCTCA TACCGCAGTA GATAAGGCTG AGTCAGAACC CGAATTTGCA CAATTACTCA 2460
ATGCGACCAG CGTTGAATCA ATTGCAAAAG CGGCTAATGA AGTTGGGGCC TGGGTAATTC 2520
ATTTCTCAAC TGATTACGTA TTCCCTGGAA ATGGCGACAC GCCATGGCTG GAGACTGATG 2580
CAACTGCACC GCTTAATGTT TACGGTGAAA CCAAGTTAGC TGGAGAAAAA GCATTACAAG 2640
AGCAGTGTGC GAAGCACCTT ATTTTCCGTA CCAGCTGGGT ATATGCAGGT AAAGGAAACA 2700
ATTTTGCCAA GACAATGTTA CGTCTGGCAA AAGAGCGTGA AGAATTAGCC GTTATTAATG 2760
ATCAGTTTGG TGCGCCAACT GGCGCAGAGT TGCTGGCTGA TTGTACGGCA CATGCCATGC 2820
GTGTGGCACT GAATAAACCG GAAGTCGCAG GTTTGTACCA TCTGGTAGCC AGTGGTACCA 2880
CAACCTGGCA CGATTATGCT GCGCTGGTTT TTGAAGAGGC GCGCAAAGCA GGCATACCCC 2940
TTGCACTCAA CAAGCTCAAC GCAGTAGCAA CAACAGCCTA TCCTACACCA GCTCGTCGTC 3000
CACATAACTC TCGCCTTAAT ACAGAAAAAT TTCAGCAGAA TTTTGCGCTT GTTTTGCCTG 3060
rmlD的终止
ACTGGCAGGT TGGCGTGAAA CGAATGCTCA ACGAATTATT TACGACTACA GTAATTTAAT 3120
rmlA的起始
AGTTTTTGCA TCTTGTTCGT GATGATGGAG CAAGATGAAT TGAAAGGAAT GATGAAATGA 3180
AAACGCGTAA AGGTATTATT TTAGCGGGTG GTTCTGGTAC TCGTCTTTAT CCTGTGACTA 3240
TGGCTGTCAG TAAACAGCTA TTACCTATAT ATGATAAGCC GATGATCTAT TACCCGCTTT 3300
CTACACTGAT GTTAGCGGGT ATTCGCGATA TTTTGATTAT CAGTACGCCA CAGGATACTC 3360
CTCGTTTTCA ACAACTGCTT GGTGACGGTA GCCAGTGGGG GCTAAATCTT CAGTACAAAG 3420
TGCAACCGAG TCCAGATGGT CTTGCGCAGG CATTTATCAT CGGTGAAGAG TTTATCGGTG 3480
GTGATGATTG TGCTTTGGTT CTCGGTGATA ATATCTTTTA CGGTCACGAT CTGCCGAAGT 3540
TAATGGATGT CGCTGTTAAC AAAGAAAGTG GCGCAACGGT ATTTGCCTAT CACGTTAATG 3600
ATCCTGAACG CTACGGTGTC GTTGAGTTTG ATAAAAACGG TACGGCAATA AGCCTGGAAG 3660
AAAAACCGTT ACAACCAAAA AGTAATTATG CGGTAACTGG GCTTTATTTC TATGATAATG 3720
ACGTTGTCGA AATGGCGAAA AACCTTAAGC CTTCTGCCCG TGGCGAACTG GAAATTACCG 3780
ATATTAACCG TATATATATG GAGCAGGGGC GTTTATCTGT TGCCATGATG GGACGTGGTT 3840
ATGCATGGCT GGACACGGGG ACACATCAAA GTCTTATTGA AGCAAGTAAC TTCATTGCAA 3900
CAATTGAAGA GCGTCAGGGG CTGAAAGTTT CCTGTCCGGA AGAAATTGCT TACCGTAAAG 3960
GCTTTATTAA TGCTGAACAA GTGCAAGTGT TAGCTGAATC GCTAAAGAAA AATGCTTATG 4020
rmlA的终止 rmlC的起始
GGCAGTATTT ATTAAAGGTG GTTGAAGGTT ATTAATAAAA TGAAAGTCAT AAAAACTAGT 4080
ATTCCGGATG TTTTAATTTT TGAACCAAAA GTATATGGAG ATGAACGTGG CTTTTTTATG 4140
GAAAGCTTTA ATCAAAAAGT TTTCGATGAG GCTGTAGGGC GTAAAATTGA ATTTGTGCAG 4200
GATAACCACT CTCAATCTAG TAAAGGCGTG TTGCGAGGGT TACATTATCA ATTAGAACCT 4260
TATGCTCAAG GAAAGCTTGT TCGCTGTGTT GAAGGTGAAG TATTTGACGT CGCAGTTGAC 4320
ATACGTAAAT CATCACCCAC TTTTGGACAG TGGGTAGGTG TATATTTAAA TGCTAAAAAC 4380
AAGCGACAAT TATGGATACC GGAAGGATTT GCTCATGGAT TTATTGTAAC TAGCGAAAAA 4440
GCCACATTCC TTTATAAAGC AACTAATTAC TATATGCCCT CTCATGAAGG TGGGATAATA 4500
TGGAACGATA AATCATTGAA TATACAATGG CCTTTAATGA GAGAAATGAT TATATCAGCA 4560
rmlC的终止
AAAGATCAAC AGCAAATATC GCTGACTGAA TATTTAGAAA TTGAATCATC AAAAAAATGA 4620
wzx的起始
TGAGTTGGTA TAAACCCAAA CCAAAACTAA CTAATGATTA GAGATTTCAT GTTAAGATTC 4680
TTTTCTAACA AAGTAAAAGA TCATGATTTT TTGAAGGTGT TTACCAATGC GTCATATTTA 4740
ACCATATCAC AAGGGGTATC TTATTTGATA CCCTTAATTA CTTTAAGTTA TGTTATATCT 4800
CTATTAGGAT TAGAAAAATT TGGTCGTTAC TCTGTAATAC TAATAACTGC GACATTACTT 4860
CAAGTCGTGA CAGATTATGG TTTTATGTTT ATCTCACCAA AAGAAATATC TATGCAGGTG 4920
ATAATAAGCA AAAGAGTATC AGGAAGTATA TATATCAACC ACTATATTAA AGTCGTTATT 4980
TCTACTGTTG ATTTTTTGTT TTTTTATACA ATAGTATGTT ATTTAATAAT AGATGAATAT 5040
GATTTATTAA TTAATTTTCT ACTTGGTTAT TTGATTGTAA TATCACAATC TTTATATCCT 5100
ACTTGGTTTT TCCAAGGGAT ACAGAAAATG AAAATAATAG CAGGACTTTC TATAATTGCA 5160
AAAATTATAA ACTGCTTATT AGTTATATTT TTTTTGAAAA TTAGTGCAGA GATAAATATT 5220
CTAATATTAT CACAAGCTTT TCCAATGTTT GTTGTGTCAT TTTATGCAAA TTTAATTATA 5280
ATAAAAAAAT ATATATATCT CGTGAAACCT TCTTGGACTT CGATTCGAAC GTTATTTCTT 5340
GAAGGTAGTG GTTTATTTTT GGCCAATATA TCATCAGCAA TTCTTACAAA CTCAACAATT 5400
CCTATACTAT CTATATATGC AACTCCGACA CAGTTAGGTG CGTATGCAGC AATTGAAAGG 5460
ATAATAAAAT CAATTTATAC AATTTTTTTT CCTATATCAC AAGCGATATA TCCTTATAAT 5520
TGTAAACGTT TCTCATATAG CCTGAGTGAT GGAATTACTG CTGTAAAAAA AACCGGCATA 5580
CCGATGGTGG TATTTGCTTT GATCACTAGT GTTTCTATTG TGATTACTTT TTATGTCATG 5640
AGAAATTATA TTGATATATA CATTTATCAA TATGTATTAG TTGTAATTTT CCTAAGTCTA 5700
TGGCTTATTG TCGGGGTGAT TAATAATGTC TTAGGGATAC AATTTCTATG CGCATACAAT 5760
TGTAAGGATT TTTATAGTAA AGCTTTTTTT GTATCATCTT CATTAACGAT ACCTTTTATG 5820
TTTTGGTTTA GTTCTTGGAT ACCTGCAATC GGTACTTCGT TTGCCGTTTT GATGGGTGAA 5880
TCATTACTAG GGGTAATACT TTTTATAAAG ATCTACAATA TTAATAAAAG GGTGAAATTA 5940
orf6的起始 wzx的终止
AGTGATTAAT GTAGTTTTCT GTATAAGGAA AGACTGGAAG GAGCGTCCTG GAGGAGATGT 6000
GATTCAATTG GTTGAGACTA AGAACGCAAT TGAGTCAGCG TATAAATGCT CTATTAACAT 6060
TATCAGTGAT CCGGATGAAA TTTTGAATAT TCACCCTGAT ATTGTCCACA TATTCAATAT 6120
GCAAACTTTT GAGGAAAGTA AGTTATTTCT TACAAAAGCA AAGCAAATCG GCGCATTTTG 6180
TGTTCTTTCT ACCGTTTATT GGGATATGCA TGATGCATTC TTTGTTAATG CAATGCAAAA 6240
AATGCATATT TATCCTAGTG GAAAATATTT TGAACTTTTA AAAAGAGTAT TTCATTTAAC 6300
GTGTAAAGTA AGTGTTTCTA TTATTAATAA GCCATATTCG CTTACAAATA AGTATAGAAA 6360
AGATATGGCT AACTTTCTAG GGGAGTTTGA TGCATGGTTA CCGAATTCAG AAGAGGAGTA 6420
TGAAATAATT CAGAGAGAGT TCAGATTAAA AAAGGAAAAA TATATAGCCT TAAATGCCGT 6480
AAGTAATAAT GTTTTTTGTT TTAATTATAA TGAGAATAGA AATGGCATAT TATGTGTTGG 6540
AAGATTTGAA CCAATAAAAA ATCAGTTATC TGTATGCAAA GCATTATTAA ATACAGAACT 6600
CAATTTGATA TTAATTGGAG CTGCTCACGC ACATAATAAA GATTACTTAA AAAAAATACA 6660
AAAAGTCAAT GCTGTTAATA ATAATATTCA CATAATCACT AAAAATATCG AGCAATATGA 6720
ATTAAATAGT TATTACAATA AATGCCGTGT CCATGTATTA GCTTCTTTTC GTGAATCTCC 6780
TGGTTTAAGT TCATTAGAAG CTTTAGCCAC CGGTGCAAAT ATTGTTGTAT CTTCAAGCCA 6840
GTTTTGTCCA ATTGATACTT ACTTTAAAGA GATAATTGGG AAACATGTCT TTTTATGTAA 6900
TCCATACTCC ATAAGTTCTA TAAGAAAAGC CATTGAGGAT GCTTATAATG CACCGCTAAT 6960
GCGTAAATCC ATTAATAGAT TTTCATGGGA TCTAACAGCA AAGCAGACCT ATTTGGCTTA 7020
orf6的终止 gne的起始
TCAAGAGATA ATAAATAACA GAGATTGATA TTAAAATGAC TACAAAAATA ATGTTAGTAT 7080
TTGGTACAAG ACCTGAAGCC ATTAAAATGG CTCCTTTAGT AAATTTATTA AAAAGAGATT 7140
CTCGATATGA ATGTAAGGTT TGTGTAACTG GTCAGCATAG AGAAATGTTA CATAGTGTAT 7200
TGGATTTATT TGATATTACA CCAGATTACA ATTTAAATAT AATGCGGCCG GAACAAAGTT 7260
TATCGACAAT TACAGTCGAT ATAATTAATG GTATGTCAGA AATATTTAAA AATTTCAAGC 7320
CAGAGCTAAT AGCAATTCAT GGTGACACGT CAACTTCATT CGCTGCCTCG TTATCAGCAT 7380
ACTATCATCA AATTAAAATT GCACATATTG AAGCTGGGCT CAGAACTGGC AATTTATATT 7440
CTCCTTGGCC TGAAGAGGGT AATAGAAAAT TAACAGGAGT GCTTGCGGAC TTCCATTTTT 7500
GCCCTACCGA ATTAACTAAA CAGAATTTAA TTAGAGAAGG CGTTGAGTTA AACAAACTGT 7560
TTATAACAGG AAATACGGTA ATTGATTCTT TAATTTATAT AATTAATAAA ATTAAAAAAG 7620
ATGGTGAATT GCTAAATTAC TTACATGAGA AATTTTCATT TATTGATCAA TATCGCAAAA 7680
TGATACTCAT TACCGGTCAT CGGCGTGAAA ATTTTGGTAC TGGATTTAAA AATATTTGTC 7740
AGGCTATAAA AAATCTCGCA ATTAGTAATC CAGATATAAT ATTTGTTTAT CCGGTTCATT 7800
TAAATCCTAA TGTTCAAGAA CCAGTCAATT ATTACTTAAA AGATGTTGAT AATGTAAAAT 7860
TAATTCCACC TCAAGAATAT CTTCCATTTG TTTATTTAAT GGAACGTTCA TATATTATCT 7920
TAACTGATTC ACAGGTATTC AAGAAGAAGA TCCTTCCTTG GGCAAACCTG TTCTCGGTTA 7980
TGCGTGAAAC TACTGAAAGG CTAGAAGCTT TAAATGCGGG TACCGTGAAG TTAGTTGGTA 8040
CAAATTATGA TACTATCATT AAGGAATTTG AGTATCTAAT GAACGATAAG TCACATTATG 8100
AAAGTATGTC AAAATCTACT AATCCATACG GAAATGGTAA TTCATCAATT AAAATTAAAG 8160
gne的终止 orf8的起始
AAATAATTGA TAATTATTTT TTTAATTCCT TACAAGGATG AGAATATGAA TAAACCTAAA 8220
GTTGCTGTTT TACTGGCTAC ATACAATGGA GAGTGTTGGA TCAGTGCACA AATCGATAGC 8280
ATTCTTGCAC AAAGAGATGT CGACGTTACA ATTTATATAA GTGATGATTG CTCAACTGAT 8340
AAAACAAAAG AGATTTGCAG TAACTATTCA GAAAGATTTA ATAATATTAA GCTACTTTCA 8400
AATTCAGAAC GGATGGGGGG CGCAAGTGCT AATTTTTTCC GATTATTGCT TTCAAATGAG 8460
TATGATCAAC ATGATTTTGT TGCTTTATCT GATCAAGATG ATATTTGGAA AGAAAACAAA 8520
CTTATTCATG CAATTAAACA AATTGGAACT GACGGCTTTT ATTCCAGTAA TGTAACTGCA 8580
TTTTATAGCG ATGGAAGACA AGTTTTAATA AATAAATCCC AGAAGATGAC CTCCTATGAT 8640
TATTTTTTTG AAGGTGGGGG GCCCGGTTGT ACTTACGTCT TTTCAGTTGA AAATGCATTC 8700
AAACTTAGGG AATTTCTAGT TAAACATGTT AATATTCTTA AAGATATAAC CTATCATGAT 8760
TGGTTTATAT ATGCTTTTGC AAGATCAAAT AATTATAAAT GGATCATTGA TCCTTGGCCC 8820
TCAATGTATT ACCGACAGCA CAGCAATAAT CAAATAGGTG CTAACTCTTC TTTTGGTGGA 8880
ATCATTAAAA GATTAAAAAT GATTAGATCA AAATGGTATA GAAAACAAGT AACTTTGATC 8940
GCTAATACTT TAGAAGCAGC GGATTCTTCT AAAATACAAA AAAATCTCAA TAGAAATTAC 9000
TATGGAAATC TATTGTTTTC AGTTAACTTT TATAAGTTGC GACGCTCATA TAAAGATAAG 9060
orf8的终止
ATTTTTATTT TAATCTTTAT GTTGTTGTAT CTATTTTGAT TATGATAATT ATATAAGATG 9120
wzy的起始
GAACATATGA ACAGAGTTTA CTGTTTGAAT ACAACTTTCT TAAACCCATT AATTCCTATA 9180
TTATTAATGG TAGCTGTTTT CATATTATCA TCTTTTTTGT ATAAGGTTGA TAGTAGTTCA 9240
CTTGTTATTA TTATCTCAAC CTTCTTGGTT ATTTCCTTTA TCCCATTATC ATTCTGTTTT 9300
TCAAGTAAAT ATTATGTCAA TACATCAAAC CTAAGTCTGA AGTCATTTCC GTTACCGTAT 9360
ACGACAACAA TCATTATAAT TCTATCAAGC AGTGTTGAAT ATTTTAAGTT AGGAATTCCT 9420
CTTTTTGGAC ATGTTATATA TGCAGAGTTT GGGTATCCTT TTTTGCACCA TGTTTCAGTT 9480
ATGTCATGGT TATTATTATT TACATGTAAT TCCTTTAAGA ATAGAATAAT TTTTATACTT 9540
GTAATGGTTT TTGCATTTGT TAATCCATTG TTGATGATTA ATCGTGATTT AATGCTATTA 9600
ACTTGTTTTG TCTTTATTTT TATCCTTTTA GGAAAACGAA AGGTTAGTCT AAAACCGATA 9660
CTTATTTTAG GGAGTATATT TCTTTTTGTT TTTGGTTTGA TCGGTGAATA CAGAAGTCCA 9720
GGTGTAATAC ATTCAGTTGA TTTACCTTTT TCTTTCAACT ATGAAAAAAT GCCAGCAACG 9780
ATAGCATGGC TTTTTCTATA TTTTACTTCT TCCTGTTTTA ATATGTATTA TAATATTAAA 9840
ACATTAGGCT TGAATTTATA TGCAAGTAAT ATAAATGTTT TCCCAGAACC CTATTACTGG 9900
TCATCTTTTT TTGATAGCTT TATTTTTTTC CTATTGTCAT TATTTTGTAT TTTATTTTAC 9960
wzy的终止
TGTTATCAAT TAGACATTAT CTTTTAACAA AAAAGACTTC AGAATTAACA TTGGCATTAT 10020
ACCTTTATTG TATCTTCCAA GTGTATACGG GATTACTTGC TGTAAAAGTT TTTAATACAC 10080
GTACATTATT TGTTATGCTT TTTCTAGGAG TAATCCAATT CTGTAATATT CTTTTACCTA 10140
orf10的起始
AAAAGAGACG TTCATAACAT GCATAAACAA AGAGTAGCTA TTCTCCTATC TCATTATAAT 10200
GGAAGTGATT ATTTAAGAGA ACAGTTAAAT TCTATTCTCA ACCAGAATGC AGATAATTTT 10260
TCTATTGATA TATATGTCAG GGATGATGGT TCTAATAATG TTAATTTGGT AAACCTTCGG 10320
CAAATGACAT CCTGTTTACC TATTAATGTT TTTGAGGGAA GCAATATAGG TGTGACTAAA 10380
AGTTTTTTTA CTCTCTTGGA GCAGGTTGAT TCATATGATT ATTATGCCTT TTGCGATCAG 10440
GATGATGTTT GGCTTGATGA TAAAATTTCA AGCGCAGTGA CCATGATGAA GGATTCCGAA 10500
GGTCCAGTAT TATACTGTTC AGCTTATACC TTGGTTGATG CAAAATTAAA TTTGATAAAT 10560
TTTGAAAATC ACGTCAATGA TTCTTTTGAA AATGCATTAT TTAAAAACTT TTGCACAGGT 10620
TGTACATGTT TGATAAATAA TAAGTTACGC TCGATTATTT TGAAAACTGA TTATACTAAA 10680
AATGTACCAA TGCACGATTG GTGGATGTTG ATGGTTGCAT ATTTAACAGG AACGGTTATT 10740
TTTGATCAAC AATCCCATAT CCTTTATCGG CAACATGGAG GTAATGTTGT CGGTGGTCGA 10800
ACTAGTTTTA TAAAAAAAAC AAGAAGATTT ATGTTTAATA TTTTATCTAA TGATGAAACC 10860
AGATCAAAAA TGTATCAGCA ACTATTGATA AGTAAAGAAT TGTATAATTC TGAGAAAGTA 10920
GCGTTATTGG AGCTTATACT GAACAGTAAA AGAAATATTT TTCTTAGAAT TAAGTTGGTT 10980
ATGGGCTTAG GGGTTAAATA TGCTAAGAAA TACGAAAGTA TTCTAGTTAA GTTTCTTATT 11040
orf10的终止
TTAATTGGTA GGTTCTAATA TACCTTAAAT AGCTGCGCGG AATAGTAGAT CACTTTAAGG 11100
GAACTTAGCC CGGATTGTTT GATCTGATCA ATCACCAAAT CAAAACAAAT CACCAACCGG 11160
ACTGAGCGAT GCCGATCATA GCACCAATTC CCCGTGACGA ACGACGCCTG ATGCAGAAAG 11220
CAATCCAGAA AACGCACGAT AAAAATTATG CCCGCAGACT GATGGCCATA CTGATGCTGC 11280
ATCGGGCGAC CTCGTTAGCG ATGTTGGCAG AATGCTCTGC CGTGGCAGTT CCTTCGTCGG 11340
orf11的起始
ACGCTGAATT AATTGGTTCA CGCTGTCGGG TGTTGCAAGA CTGAAATCAT TATCTGCCGG 11400
ACGACCCCAC GCTGGCCTTT TGAGCATATC TGCACTTTAT TACGTGAGCT GGTAAACATG 11460
CTCACGGCGA TTTTGGGCTA CCAGCGCTCA GGCTTGAGTA CAGAACTTCT GGCAATAAAA 11520
ATCAATGAGA TAACCGGCTG CCAGTTATAT GCCGGGACCG TTTGCCGCTG GTTGCCGTCT 11580
GCAGGGCTTG TGTGGCGAAG GGCCGCACCA ACCCTGCGTA TCCGTGACCC GCATAAAGAT 11640
GAAAAGATGG CGGCAATCCA CAAAGCACTG GACGAATGCT GCGCAGAGCA TCCGGTCTTT 11700
TATGAAGATG AAGTGTATAT CCATCTTAAT CCCAAAATCG GTGCAGACTG GCAGCTACGT 11760
GGACAACAGA AACGCGTGGT AACACCGGGG CAGAAGGAAA AATATTATCT GGCCGGCAAC 11820
AGCAAAAGTT CAACGCTGTT CATCAGCCTG CTGAAGCGGC TTAAAGCGAC ATACCGTCGG 11880
GCGAAAACCA TCACGCTGAT CGTGGACAAC TACATTATCC ATAAAAGCCG GGAAACACAG 11940
CGCTGGCTGA AGGAGAACCG AAGTTCAGAG TTATTTATCA GCCGGTTTAC TCGCCATTGG 12000
orf11的终止
TGCATCATGT AGAACGGCTA TGGCAGGCAC TTCGCGACAC AATAACGCGC AATCATCAGT 12060
GCCGGTCAAT ATGGCAACTG CTGAAAAAAG TTCGCCATGT TATGGAAACC GTCAGCCATG 12120
CCCTAAGGCA AACATGGGCT GGCAAAAGTG TAGCGGTATT AGGCGCAGCT ATTTATAAGA 12180
TTATAAAACT AATCTATTTA ACTTAAAATT TACTACCTAT AAACTCATAG TTGAATCGAA 12240
ATTTAATTCT TAAACTACAC CTCTTCATGA TCCCCCTGAC TGGAGTAAAC AATGTCAAAG 12300
CAACAGATCG GCGTAGTCGG TATGGCAGTG ATGGGGCGCA ACCTTGCGCT CAACATCGAA 12360
AGCCGTGGTT ATACCGTCTC TATTTTCAAC CGTTCCCGTG AGAAGACGGA AGAAGTGATT 12420
GCCGAAAATC CAGGCAAAAA ACTGGTTCCT TACTATACGG TGAAAGAGTT TGTTGAATCT 12480
CTGGAAACGC CTCGTCGCAT CCTGTTAATG GTGAAAGCAG GTGCAGGCAC GGATGCTGCT 12540
ATTGATTCCC TCAAGCCTTA CCTCGATAAA GGTGACATCA TCATTGATGG TGGCAATACC 12600
TTCTTCCAGG ACACCATTCG TCGTAACCGT GAACTTTCTG CCGAAGGCTT TAACTTCATT 12660
GGTACCGGTG TCTCCGGTGG TGAAGAAGGC GCGCTGAAAG GTCCTTCTAT TATGCCTGGT 12720
GGGCAGAAAG AAGCCTATGA ACTGGTTGTA CCAATCCTGA CCAAAATCGC CGCAGTAGCT 12780
GAAGACGGGG AGCCATGCGT TACCTATATT GGTGCCGATG GTGCAGGTCA CTATGTGAAG 12840
ATGGTTCACA ACGGTATTGA ATACGGCGAT ATGCAGCTGA TTGCTGAAGC CTATTCTCTG 12900
CTTAAAGGTG GCCTGAATCT TTCCAACGAA GAACTGGCGC AGACCTTTAC CGAGTGGAAT 12960
AACGGTGAAC TGAGCAGCTA CCTGATCGAC ATCACCAAAG ATATCTTCAC CAAAAAAGAT 13020
GAAGACGGTA ACTACCTGGT TGATGTGATC CTGGATGAAG CAGCAAACAA AGGTACGGGC 13080
AAATGGACCA GCCAGAGTGC GCTGGATCTT GGCGAACCGC TGTCGCTGAT TACCGAGTCT 13140
GTTTTTGCAC GTTATATCTC TTCTCTGAAA GATCAGCGTG TTGCCGCGTC TAAAGTTCTC 13200
TCTGGTCCGC AAGCGCAGCC AGCAGGCGAC AAAGCTGAGT TCATCGAAAA AGTTCGTCGT 13260
GCGCTGTATC TGGGCAAAAT CGTTTCTTAC GCGCAGGGTT TCTCTCAGCT GCGTGCTGCG 13320
TCTGAAGAGT ACAACTGGGA TCTGAACTAC GGCGAAATCG CGAAGATTTT CCGTGCTGGC 13380
TGCATCATCC GTGCGCAGTT CCTGCAGAAA ATCACCGATG CTTATGCCGA AAATCCGCAG 13440
ATCGCTAACC TGCTGCTGGC TCCGTACTTC AAGCAAATTG CCGATGACTA CCAGCAGGCG 13500
CTGCGTGATG TCGTTGCTTA TGCAGTACAG AACGGTATCC CGGTTCCGAC CTTCGCGGCA 13560
GCGGTTGCCT ATTATGACAG CTACCGCGCC GTAGTTCTGC CTGCGAACCT GATTCAGGCT 13620
CAGCGCGACT ACTGA 13635
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。