甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶3蛋白编码序列 【技术领域】
本发明涉及的是一种用于生物基因工程技术领域的蛋白编码序列，特别是一种甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶3(BnMPK3)蛋白编码序列。
背景技术
农作物在生长过程中会遇到各种各样的自然灾害而造成减产，如干旱、滞涝和病虫害等。当前一个重要的育种手段是将各种抗逆基因对农作物进行基因工程改造，以获得抗逆农作物新品种。植物为抵抗不良的外界环境的胁迫，在长期的自然进化中发展起复杂的信号传递系统帮助自己度过当前的困境，其中MAP激酶(Mitogen-actived protein kinase)信号传递系统在抗逆过程中扮演了极其重要的作用。MAPKs是由MAP激(MAPK)与MAP激酶激酶(mitogen-activated proteinkinase kinase，MAPKK)和MAP激酶激酶激酶(mitogen-activated pro2teinkinase kinase kinase，MAPKKK)3种类型组成。植物细胞感受环境胁迫(如损伤、干旱、低温等)和生长发育信号(生长素、乙烯、脱落酸等)后，可以通过受体蛋白激酶等上游激活子顺次激活MAPKKK、MAPKK、MAPK。其中，MAPK是该传递链中最后一个激酶直接作用于下游的转录因子和功能基因，使植物表现出各种抗逆性能，是植物信号传递过程中重要的一环。
经对现有技术文献检索发现，杂志《Proceeding Natural Academic Science，United States of America美国自然科学院院刊》在2002，99(24)：15812-1581717发表了文章“Mitogen-activated protein kinase signaling inpostgermination arrest of development by abscisic acid(植物激素脱落酸在抑制植物萌发后期，细胞分裂原激活地蛋白激酶的信号传递)”，对基因MAPK3在植物激素脱落酸处理下的表达已经做了充分描述，是脱落酸ABA诱导表达的正相关的基因，与植物的水势有关，但尚不清楚该基因的耐盐、抗旱和抗虫等其它环境因素的效果，此外至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶3蛋白编码序列。本发明公开了与甘蓝型油菜BnMPK3密切相关的蛋白基因和甘蓝型油菜BnMPK3蛋白序列及其核酸序列，及其在利用转基因技术改良植物抗旱耐盐中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的，在本发明所分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有甘蓝型油菜BnMPK3蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第154-1263位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第154-1263位的核苷酸序列杂交，所述的核苷酸编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，所述的核苷酸编码序列具有SEQ IDNO.3中从核苷酸第154-1263位的核苷酸序列。
在本发明还分离出的包含细胞分裂原激活的蛋白激酶甘蓝型油菜MAPK类相关蛋白质多肽BnMPK3，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、旱、冷、活性氧以及水杨酸处理下均能发挥作用，提供植物的抵抗各种不良环境的能力。
所述的DNA分子，是本发明提供的载体所包含的DNA分子，是一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
在本发明用所述的DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。
在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗逆信号传递激酶”指编码具有甘蓝型油菜BnMPK3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第154-1263位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第154-1263位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第154-1263位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件(70-85％一致性)下，更佳的在高度严紧条件(85％以上一致性)下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第154-1263位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第154-1263位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的甘蓝型油菜BnMPK3相同功能的蛋白的SEQID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗逆信号传递的蛋白激酶编码序列”指具有甘蓝型油菜BnMPK3蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然甘蓝型油菜BnMPK3相关相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括甘蓝型油菜BnMPK3蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的甘蓝型油菜BnMPK3多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与甘蓝型油菜BnMPK3相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用甘蓝型油菜BnMPK3多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“甘蓝型油菜BnMPK3保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1最初的残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu
表2
90％identity in 1113nt overlap
Query： 150 gagagacatgaacaacgccggcggccaatatccagattttccggcggtgcagacgcacgg 209
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Sbjct： 18 gagagaaatgaacaccggcggtggccaatacacggattttccggcggtggacactcacgg 77
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Query：390 cgccaagcgtacacttcgcgagatcaagcttcttcgtcatctcgatcatgaaaacatcat 449
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Sbjct：258 tgctaagcgtacgcttcgtgagatcaagcttcttcgtcatcttgatcatgaaaacattat 317
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Sbjct：858 tcccaacttcccacgtcagcccttagctaaacttttctctcatgttaacccaatggccat 917
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Sbjct：1098 ctaccaagaagccatagcactcaatccaacata 1130
Query：甘蓝型油菜BnMPK3的核酸序列
Sbjct：拟南芥AtMPK3的核酸序列(AY090981)
表2为本发明的甘蓝型油菜BnMPK3蛋白与拟南芥AtMPK3蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。
表3
94％identity in 370aa overlap
Query：1 MNNAGGQYPDFPAVQTHGGQFISYDIFGSLFEVTSKYRPPIVPIGRGAYGIVCSVLDSET 60
MN GGQY DFPAV+THGGQFISYDIFGSLFE+TSKYRPPI+PIGRGAYGIVCSVLD+ET
Sbjct：1 MNTGGGQYTDFPAVETHGGQFISYDIFGSLFEITSKYRPPIIPIGRGAYGIVCSVLDTET 60
Query：61 NELVAMKKIANAFDNHMDAKRTLREIKLLRHLDHENIIAIRDVVPPPLRRQFSDVYIATE 120
NELVAMKKIANAFDNHMDAKRTLREIKLLRHLDHENIIAIRDVVPPPLRRQFSDVYI+TE
Sbjct：61 NELVAMKKIANAFDNHMDAKRTLREIKLLRHLDHENIIAIRDVVPPPLRRQFSDVYISTE 120
Query：121 LMDTDLHQIIRSNQGLSEEHCQYFLYQLLRGLKYIHSAKVIHRDLKPSNLLLNANCDLKI 180
LMDTDLHQIIRSNQ LSEEHCQYFLYQLLRGLKYIHSA +IHRDLKPSNLLLNANCDLKI
Sbjct：121 LMDTDLHQIIRSNQSLSEEHCQYFLYQLLRGLKYIHSANIIHRDLKPSNLLLNANCDLKI 180
Query：181 CDFGLARPTSENEFMTEYVVTRWYRAPELLLNSSDYTAAIDVWSVGCIFMELMNRKPLFP 240
CDFGLARPTSEN+FMTEYVVTRWYRAPELLLNSSDYTAAIDVWSVGCIFMELMNRKPLFP
Sbjct：181 CDFGLARPTSENDFMTEYVVTRWYRAPELLLNSSDYTAAIDVWSVGCIFMELMNRKPLFP 240
Query：241 GKDHVHQMRLLTELLGTPTESDLGFTHNEDAKRYIRQLPNFPRQPLAKLFSHVNSLAIDL 300
GKDHVHQMRLLTELLGTPTESDLGFTHNEDAKRYIRQLPNFPRQPLAKLFSHVN +AIDL
Sbjct：241 GKDHVHQMRLLTELLGTPTESDLGFTHNEDAKRYIRQLPNFPRQPLAKLFSHVNPMAIDL 300
Query：301 VDRMLTFDPNKRITVEEALNHPYLAKLHDPNDEPICLKPFSFDFEQQPLDEEQIKEMIYR 360
VDRMLTFDPN+RITVE+ALNH YLAKLHDPNDEPIC KPFSF+FEQQPLDEEQIKEMIY+
Sbjct：301 VDRMLTFDPNRRITVEQALNHQYLAKLHDPNDEPICQKPFSFEFEQQPLDEEQIKEMIYQ 360
Query：361 EAIALNPTYA 370
EAIALNPTY
Sbjct：361 EAIALNPTYG 370
Query：甘蓝型油菜BnMPK3的氨基酸序列
Sbjct：拟南芥AtMPK3的氨基酸序列(CAB75493)
表3为本发明的甘蓝型油菜BnMPK3蛋白与拟南芥AtMPK3的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
发明还包括甘蓝型油菜BnMPK3蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然甘蓝型油菜BnMPK3相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的甘蓝型油菜BnMPK3多肽时，可以将甘蓝型油菜BnMPK3编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成甘蓝型油菜BnMPK3蛋白表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法和一步法RT-PCR法技术分析甘蓝型油菜BnMPK3基因产物的表达，即分析甘蓝型油菜BnMPK3的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有甘蓝型油菜BnMPK3核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码甘蓝型油菜BnMPK3相关的核酸分子。
本发明还提供了检测样品中是否存在甘蓝型油菜BnMPK3相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于甘蓝型油菜BnMPK3相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的甘蓝型油菜BnMPK3核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选甘蓝型油菜BnMPK3相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与甘蓝型油菜BnMPK3相关基因相关的甘蓝型油菜cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选甘蓝型油菜cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对甘蓝型油菜BnMPK3相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自甘蓝型油菜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与甘蓝型油菜BnMPK3相关相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的甘蓝型油菜BnMPK3相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的甘蓝型油菜BnMPK3蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与甘蓝型油菜BnMPK3相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明具有实质性特点和显著进步，本发明在抗各种环境胁迫具有明显的作用，能够明显降低在干旱、水淹和病虫害土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。干旱、水淹和病虫害能够造成大部分农作物如水稻、棉花、甘蓝型油菜和小麦等生长缓慢甚至死亡，从而使其明显减产甚至颗粒无收。我国存在大面积的干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，及世界范围内也存在干旱半干旱、盐碱半盐碱地区，此外大面积的应用各种农药也严重污染环境，因此，本发明具有很大的应用价值。
【具体实施方式】
下面结合实验室试验数据，以具体实施例来进一步阐述本发明：
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
甘蓝型油菜BnMPK3基因的克隆
1.组织分离(isolation)
甘蓝型油菜(品种为“沪油15”)从市场上购得，将甘蓝型油菜置于28℃发芽24小时，然后播种于温室中，待甘蓝型油菜叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。
2.RNA的分离(RNA isolation)
取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)
根据拟南芥AtMPK3基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：
(1)RT-PCR
PCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到PCR产物(471bp)进行回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMPK3基因的同源性很高，故初步认为它是一个细胞分裂原激活的蛋白激酶基因。
(2)3’-RACE
PCR[AP+M301(5’-ATAGAGCACCTGAGCTTCTG-3’)]得到M3’(681bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMPK3基因的同源性很高，故初步认为它是一个与MAPK相关基因。
(3).5’-RACE
第一轮PCR[AAP+M501(5’-GCGTTCA(A/G)(C/G)AGAAGATTGCT-3’)]
第二轮PCR[(AUAP+M502(5’-TGGTGG(A/T)GGAAC(C/A)ACATCTC-3’)]得到M5’(约473bp)(过程同(1))
将测序结果的重叠区拼接，发现得到的片段既是该基因的完整编码区。
BLAST的结果证明从甘蓝型油菜中新得到的基因确为一个与拟南芥AtMPK3相关的基因。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的甘蓝型油菜BnMPK3蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。
实施例2
甘蓝型油菜BnMPK3基因的序列信息与同源性分析
本发明新的甘蓝型油菜BnMPK31全长cDNA的长度为1464bp，详细序列见SEQID NO.3，其中开放读框位于154-1263位核苷酸(1114个核苷酸)。根据全长cDNA推导出甘蓝型油菜BnMPK3的氨基酸序列，共370个氨基酸残基，分子量为42588.74道尔顿，等电点(pI)为5.79。详细序列见SEQ ID NO.3。
将甘蓝型油菜BnMPK3的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥基因AtMPK3在核苷酸水平上具有90％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与拟南芥基因AtMPK3(CAB75493)也有94％的相同性(附表3)。由此可见，甘蓝型油菜基因BnMPK3与拟南芥基因AtMPK3无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。拟南芥基因AtMPK3(CAB75493)已经被证明在脱水条件下明显增强表达，并发挥着重要的作用，可以认为甘蓝型油菜基因BnMPK3在抗逆方面也具有相似的作用。
实施例3
甘蓝型油菜基因BnMPK3蛋白或多肽在酵母中进行真核细胞表达及转化酵母的抗逆性鉴定
含目的基因(甘蓝型油菜基因BnMPK3基因)的表达载体的构建
根据甘蓝型油菜基因BnMPK3的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将甘蓝型油菜基因BnMPK3基因cDNA克隆至表达载体(如pYES2.1)，进一步转化大肠杆菌TOP10或DH5α，在保证阅读框架正确的前提下鉴定表达载体，再利用LiAc法将其转化酵母INVSIC。
1.准备：配制液体YPD培养基，1×TE，1×LiAc，1×LiAc/0.5×TE，变性的鲑鱼精DNA，包含该基因的pYES2.1载体，1×LiAc/40％/1×TE，不含尿嘧啶的培养基的筛选平板，以及其它试剂和器皿。
2.制备酵母感受态：挑单克隆的酵母菌株到10ml的YPD培养基中，在摇床上30℃过夜。在OD600值为0.4时转入到50ml YPD培养基中摇2-4小时。
2500rpm下离心沉淀细胞，用40ml的1×TE重新悬浮。
再在2500rpm下离心沉淀细胞，用2ml的1×LiAc/0.5×TE重新悬浮细胞，在室温放置10min。
3.转化：取100μl的酵母悬浮液，加入1μg已构建好的pYES2.1载体和100变性的鲑鱼精DNA，然后在30℃温浴30min。
加88μl DMSO，混匀，然后在42℃热激7min。
离心10s沉淀酵母细胞，除去上清液。然后用1ml 1×TE重新悬浮。
离心沉淀酵母细胞，用50-100μl 1×TE重悬。
4.筛选培养：将上述重悬液平铺在筛选培养基平板上。
5.转化酵母的抗性鉴定：挑单克隆的酵母菌株到10ml的YPD培养基中，在摇床上30℃过夜。在OD600值为0.4，取100μl的酵母分别稀释为1/3，1/9，1/27，1/81，1/243，然后依次取10μl点到含600mM甘露醇和0.4mM t-BuOOH的YPGR培养基平板上，30℃培养过夜。
含600mM甘露醇的YPGR培养基/升：1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，2％琼脂，2％半乳糖，1％棉子糖，600mM甘露醇
含0.4mM t-BuOOH的YPGR培养基/升：1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，2％琼脂，2％半乳糖，1％棉子糖，0.4mM t-BuOOH
鉴于编码BnMPK3，如拟南芥的AtMPK3基因已被证明在脱水条件下增强表达，而甘蓝型油菜基因BnMPK3转录水平与拟南芥的AtMPK3具有较高的同源性，可进一步对含甘蓝型油菜基因BnMPK3的转化酵母进行抗性鉴定。用600mM甘露醇和0.4mM t-BuOOH处理处理转化酵母后研究BnMPK3基因是否能够提高酵母的抗干旱和抗氧化的能力。酵母的生长结果证明，转化酵母BnMPK3在600mM甘露醇的培养基上生长量比对照处理多两个数量级；在0.4mM t-BuOOH的培养基上生长量比对照处理多一个数量级。这证明甘蓝型油菜BnMPK3基因确实能够提高真核细胞的抗旱和抗氧化的能力。而抗氧化的能力通常与植物的抗涝和抗病虫害的能力密切相关，故甘蓝型油菜BnMPK3基因具有更有效而广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良植物抗旱耐涝和抗病虫害的研究和产业化生产中。
实施例4
甘蓝型油菜基因BnMPK3在甘蓝型油菜中的拷贝数分析
采用常规方法从甘蓝型油菜叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用HindIII Xba I BamH和EcoR I酶切DNA[13μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司GeneImagesTM Contents CDP-StarTM labelling module(PRN3540)，我们将BnMPK3基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现在杂交膜上出现少量的杂交条带，说明甘蓝型油菜基因BnMPK3在甘蓝型油菜中是低拷贝。
实施例5
甘蓝型油菜BnMPK3基因在NaCl、甘露醇、H2O2的不同时间处理的表达谱分析
1.RNA的提取：将生长了3-5片叶的甘蓝型油菜幼苗经200mM甘露醇、200mMNaCl和200μM H2O2处理0分钟、2分钟、5分钟、20分钟、1小时、2小时、6小时、12小时和24小时，然后按照华舜公司提供的RNA抽提试剂盒抽提RNA，并进行定量。
2.采用一步反应法定量进行表达分析，利用One Step RNA PCR Kit(TaKaRaBiotechnology Co.，Ltd)，具体操作按照试剂盒说明书进行。每个反应包括2.5μl10×One Step RNA PCR buffer，5μl 25mM MgCl2，5μl dNTP混合液，20U RNase抑制剂，0.5U AMV Rtase XL，0.5U AMV-Optimized Taq，特异引物1(5’-ATGAACAACGCCGGCGGCCA-3’)和特异引物2(5’-CTAAGCATATGTTGGATTGAGTGC-3’)各10μMol，各种时间处理的RNA 2μl，然后补充无RNase水到25μl。PCR反应条件如下：50℃ 30分钟，94℃ 2分钟，然后进行94℃ 30秒，60℃ 30秒和72℃ 1分钟共30循环，最后72℃延伸5分钟。
3.反应结束后，取15μl PCR反应液在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，5V/cm电压电泳1小时左右，在凝胶成像系统上观察DNA量。
定量RT-PCR结果显示，甘蓝型油菜BnMPK3在甘露醇和H2O2处理5分钟后开始启动表达，甘露醇处理中在6小时后达到最高峰，随后表达降低；但H2O2处理中2小时后就达到最高峰随后降低。氯化钠能更快的启动BnMPK3的表达，即在2分钟就启动表达，并在1小时内达到最高峰随后降低。这些表达特点说明甘蓝型油菜BnMPK3是典型的信号传递蛋白，属于各种逆境处理早期表达基因，并启动各种与抗逆有关的基因的表达，提高植株的抗逆能力。
本发明涉及的序列及记号分列如下：
(1)SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：23bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii).分子类型：寡核苷酸
(iii).序列描述：SEQ ID NO.1
GCT(A/T/C/G)CTTCGTCA(C/T)(A/C/T)T(C/G/T)GATCATG
(2)SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：20bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii).分子类型：寡核苷酸
(iii).序列描述：SEQ ID NO.2
GACCA(A/T)ACATC(A/G/T)AT(A/T/C/G)GC(A/T/C/G)GC
(3)SEQ ID NO.3的信息
<110>上海交通大学
<120>甘蓝型油菜细胞分裂原激活的蛋白激酶3蛋白编码序列
<130>2
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1464
<212>DNA
<213>Brassica napus
<220>
<221>CDS
<222>(154)..(1263)
<400>1
tcttctcatt tcagtccctc atctaactgt aatataatta tatatataaa ggagtcacac 60
aataccttca gattcactat acctcaaagc acaacaagtc aagcttgaag ttgacttagc 120
gcgtcatcga ttgaaagaga gagagagaga gag atg aac aac gcc ggc ggc caa 174
Met Asn Asn Ala Gly Gly Gln
1 5
tat cca gat ttt ccg gcg gtg cag acg cac gga gga cag ttc ata agc 222
Tyr Pro Asp Phe Pro Ala Val Gln Thr His Gly Gly Gln Phe Ile Ser
10 15 20
tac gat atc ttc ggt agt tta ttc gag gtc aca tcc aag tac cgt cct 270
Tyr Asp Ile Phe Gly Ser Leu Phe Glu Val Thr Ser Lys Tyr Arg Pro
25 30 35
ccg att gtt cca atc ggt cgg ggc gca tac ggc atc gtt tgc tct gtg 318
Pro Ile Val Pro Ile Gly Arg Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ser Val
40 45 50 55
ttg gat tcg gag acg aac gag ctt gtg gcg atg aag aag ata gcc aac 366
Leu Asp Ser Glu Thr Asn Glu Leu Val Ala Met Lys Lys Ile Ala Asn
60 65 70
gcc ttt gat aat cac atg gac gcc aag cgt aca ctt cgc gag atc aag 414
Ala Phe Asp Asn His Met Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys
75 80 85
ctt ctt cgt cat ctc gat cat gaa aac atc ata gct ata aga gat gtg 462
Leu Leu Arg His Leu Asp His Glu Asn Ile Ile Ala Ile Arg Asp Val
90 95 100
gtt cct cca cca ctt aga aga gag ttc agt gat gtt tat atc gcc act 510
Val Pro Pro Pro Leu Arg Arg Glu Phe Ser Asp Val Tyr Ile Ala Thr
105 110 115
gag tta atg gac act gat ctt cat caa atc atc aga tcc aac cag ggc 558
Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Gly
120 125 130 135
ttg tct gag gaa cac tgt cag tac ttc ctg tac cag ctt ctt cga ggg 606
Leu Ser Glu Glu His Cys Gln Tyr Phe Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly
140 145 150
ctc aag tac atc cac tcg gct aaa gtt atc cac agg gat cta aag cct 654
Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Lys Val Ile His Arg Asp Leu Lys Pro
155 160 165
agc aat ctt ctc ctg aac gcc aac tgc gat tta aag atc tgt gat ttt 702
Ser Asn Leu Leu Leu Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe
170 175 180
ggt ctt gct aga ccc act tca gag aac gag ttt atg act gag tat gtt 750
Gly Leu Ala Arg Pro Thr Ser Glu Asn Glu Phe Met Thr Glu Tyr Val
185 190 195
gtt acc aga tgg tat aga gca cct gag ctt ctg ctc aac tca tcg gat 798
Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Asn Ser Ser Asp
200 205 210 215
tac aca gct gct ata gat gtt tgg tct gtt ggt tgt atc ttt atg gag 846
Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Met Glu
220 225 230
ctc atg aac aga aag cct ttg ttc cct ggt aaa gac cat gtc cat cag 894
Leu Met Asn Arg Lys Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asp His Val His Gln
235 240 245
atg cgc tta ttg aca gag ttg ctt ggc acg ccg aca gaa tca gat ctc 942
Met Arg Leu Leu Thr Glu Leu Leu Gly Thr Pro Thr Glu Ser Asp Leu
250 255 260
ggg ttt aca cac aac gag gat gcc aaa aga tac atc cgg cag ctt ccc 990
Gly Phe Thr His Asn Glu Asp Ala Lys Arg Tyr Ile Arg Gln Leu Pro
265 270 275
aac ttc cct cgc caa ccg tta gct aaa ctg ttc tct cat gtt aac tca 1038
Asn Phe Pro Arg Gln Pro Leu Ala Lys Leu Phe Ser His Val Asn Ser
280 285 290 295
ttg gcc att gat cta gtt gac aga atg ttg acg ttt gac ccc aac gaa 1086
Leu Ala Ile Asp Leu Val Asp Arg Met Leu Thr Phe Asp Pro Asn Glu
300 305 310
aga atc act gtt gaa gaa gct ctg aat cac ccg tac cta gcc aag ttg 1134
Arg Ile Thr Val Glu Glu Ala Leu Asn His Pro Tyr Leu Ala Lys Leu
315 320 325
cac gac ccg aat gat gag cca atc tgt cta aag cca ttc tct ttc gac 1182
His Asp Pro Asn Asp Glu Pro Ile Cys Leu Lys Pro Phe Ser Phe Asp
330 335 340
ttt gaa caa caa cct cta gac gag gaa cag ata aaa gag atg atc tac 1230
Phe Glu Gln Gln Pro Leu Asp Glu Glu Gln Ile Lys Glu Met Ile Tyr
345 350 355
agg gaa gcc att gca ctc aat cca aca tat gct tagaagagca gcaaccgaat 1283
Arg Glu Ala Ile Ala Leu Asn Pro Thr Tyr Ala
360 365 370
gaatggctaa atatcctgcc ctctagcatc tttgcttgtt cttttattca tgtacctttt 1343
ttccatgtgt aatcctattt gtttgtttaa cattgtatta ctgctagtga gtgagtgcat 1403
gtagctctca tgtaaaagta ctccagctac gaaatattta cttcacaaaa aaaaaaaaaa 1463
a 1464
<210>2
<211>370
<212>PRT
<213>Brassica napus
<400>2
Met Asn Asn Ala Gly Gly Gln Tyr Pro Asp Phe Pro Ala Val Gln Thr
1 5 10 15
His Gly Gly Gln Phe Ile Ser Tyr Asp Ile Phe Gly Ser Leu Phe Glu
20 25 30
Val Thr Ser Lys Tyr Arg Pro Pro Ile Val Pro Ile Gly Arg Gly Ala
35 40 45
Tyr Gly Ile Val Cys Ser Val Leu Asp Ser Glu Thr Asn Glu Leu Val
50 55 60
Ala Met Lys Lys Ile Ala Asn Ala Phe Asp Asn His Met Asp Ala Lys
65 70 75 80
Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg His Leu Asp His Glu Asn
85 90 95
Ile Ile Ala Ile Arg Asp Val Val Pro Pro Pro Leu Arg Arg Glu Phe
100 105 110
Ser Asp Val Tyr Ile Ala Thr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln
115 120 125
Ile Ile Arg Ser Asn Gln Gly Leu Ser Glu Glu His Cys Gln Tyr Phe
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Lys Val
145 150 155 160
Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Ala Asn Cys
165 170 175
Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Pro Thr Ser Glu Asn
180 185 190
Glu Phe Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu
195 200 205
Leu Leu Leu Asn Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser
210 215 220
Val Gly Cys Ile Phe Met Glu Leu Met Asn Arg Lys Pro Leu Phe Pro
225 230 235 240
Gly Lys Asp His Val His Gln Met Arg Leu Leu Thr Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Thr Pro Thr Glu Ser Asp Leu Gly Phe Thr His Asn Glu Asp Ala Lys
260 265 270
Arg Tyr Ile Arg Gln Leu Pro Asn Phe Pro Arg Gln Pro Leu Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Ser His Val Asn Ser Leu Ala Ile Asp Leu Val Asp Arg Met
290 295 300
Leu Thr Phe Asp Pro Asn Glu Arg Ile Thr Val Glu Glu Ala Leu Asn
305 310 315 320
His Pro Tyr Leu Ala Lys Leu His Asp Pro Asn Asp Glu Pro Ile Cys
325 330 335
Leu Lys Pro Phe Ser Phe Asp Phe Glu Gln Gln Pro Leu Asp Glu Glu
340 345 350
Gln Ile Lys Glu Met Ile Tyr Arg Glu Ala Ile Ala Leu Asn Pro Thr
355 360 365
Tyr Ala
370