联合治疗癌症的方法 本申请是申请日为 2004 年 8 月 12 日， 申请号为 200480031561.2( 国际申请号为 PCT/US2004/026161)， 发明名称为 “联合治疗癌症的方法” 的专利申请的分案申请。
发明领域 本发明涉及联合给予组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 抑制剂和抗癌药物的治疗癌症的方 法。第一个和第二个量一起构成治疗有效量。
发明背景
癌症是其中细胞群体在不同程度上对正常决定增殖和分化的控制机制不产生应 答的病症。
用于临床癌症治疗的治疗药物可分为 6 类 ： 烷化剂、 抗生素药、 抗代谢药、 生物制 剂、 激素药物和植物来源药物。
还 尝 试 通 过 诱 导 肿 瘤 细 胞 的 终 末 分 化 治 疗 癌 症 (M.B.， Roberts， A.B. 和 Driscoll， J.S.(1985)， Cancer ： Principles and Practice of Oncology， Hellman， S.， Rosenberg， S.A. 和 DeVita， V.T.， Jr. 编辑， 第 2 版， (J.B.Lippincott， Philadelphia) ； 第 49 页 )。据报道， 在细胞培养模型中， 通过使细胞暴露于各种刺激包括 ： 环 AMP 和维 甲 酸 (Breitman， T.R.， Selonick， S.E. 和 Collins， S.J.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77 ： 2936-2940 ； Olsson， I.L. 和 Breitman， T.R.(1982)Cancer Res.42 ： 3924-3927)、 阿 柔 比 星 和 其 它 蒽 环 霉 素 (Schwartz， E.L. 和 Sartorelli， A.C.(1982)CancerRes.42 ： 2651-2655) 进行分化。有大量证据表明瘤转化不需要破坏癌细胞分化的潜力 (Sporn 等 ； Marks， P.A.， Sheffery， M. 和 Rifkind， R.A.(1987)Cancer Res.47 ： 659 ； Sachs， L.(1978) Nature(Lond.)274 ： 535)。
有很多肿瘤细胞对正常增殖调节剂不产生反应的实例， 显然是其分化程序的表达 被阻断， 因而可诱导分化和终止复制。多种药物可诱导各种转化细胞系和初级人肿瘤移植 物以表达更多的分化特征。这些药物包括 ：
a) 极 性 化 合 物 (Marks 等 (1987) ； Friend， C.， Scher， W.， Holland， J.W. 和 Sato， T.(1971)Proc.Narl.Acad.Sci.(USA)68 ： 378-382 ； Tanaka， M.， Levy， J.， Terada， M.， Breslow， R.， Rifkind， R.A. 和 Marks， P.A.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)72 ： 1003-1006 ； Reuben， R.C.， Wife， R.L.， Breslow， R.， RifKind， R.A. 和 Marks， P.A.(1976) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)73 ： 862-866) ；
b) 维生素 D 和维甲酸的衍生物 (Abe， E.， Miyaura， C.， Sakagami， H.， Takeda， M.， Konno， K.， Yamazaki， T.， Yoshika， S. 和 Suda， T.(1981)Proc.Natl， Acad， Sci.(USA)78 ： 4990-4994 ； Schwartz， E.L.， Snoddy， J.R.， Kreutter， D.， Rasmussen， H. 和 Sartorelli， A.C.(1983)Proc.Am.Assoc.Cancer Res.24 ： 18 ； Tanenaga， K.， Hozumi， M. 和 Sakagami， Y.(1980)Cancer Res.40 ： 914-919) ；
c) 类固醇激素 (Lotem， J. 和 Sachs， L.(1975)Int.J.Cancer 15 ： 731-740) ；
d) 生 长 因 子 (Sachs， L.(1978)Nature(Lond.)274 ： 535， Metcalf， D.(1985)
Science， 229 ： 16-22) ；
e) 蛋白酶 (Scher， W.， Scher， B.M. 和 Waxman， S.(1983)Exp.Hematol.11 ： 490-498 ； Scher， W.， Scher， B.M. 和 Waxman， S.(1982)Biochem.& Biophys.Res.Comm.109 ： 348-354) ；
f) 肿 瘤 启 动 子 (Huberman， E. 和 Callaham， M.F.(1979)Proc.Natl.Acad， Sci. (USA)76 ： 1293-1297 ； Lottem， J. 和 Sachs， L.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76 ： 5158-5162) ； 和
g)DNA 或 RNA 合 成 抑 制 剂 (Schwartz， E.L. 和 Sartorelli， A.C.(1982)Cancer Res.42 ： 2651-2655， Terada， M.， Epner， E.， Nudel， U.， Salmon， J.， Fibach， E.， RifKind， R.A. 和 Marks， P.A.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)75 ： 2795-2799 ； Morin， M.J. 和 Sartorelli ， A.C.(1984)Cancer Res.44 ： 2807-2812 ； Schwartz ， E.L. ， Brown ， B.J. ， Nierenberg， M.， Marsh， J.C. 和 Sartorelli， A.C.(1983)Cancer Res.43 ： 2725-2730 ； Sugano， H.， Furusawa， M.， Kawaguchi， T. 和 Ikawa， Y.(1973)Bibl.Hematol.39 ： 943-954 ； Ebert， P.S.， Wars， I. 和 Buell， D.N.(1976)CancerRes.36 ： 1809-1813 ； Hayashi， M.， Okabe， J. 和 Hozumi， M.(1979)Gann70 ： 235-238)。
组 蛋 白 脱 乙 酰 酶 抑 制 剂 例 如 辛 二 酰 苯 胺 异 羟 肟 酸 (suberoylanilide hydroxamide acid)(SAHA) 属于该类药物， 它们具有诱导肿瘤细胞生长停止、 分化和 / 或调 亡能力 (Richon， V.M.， Webb， Y.， Merger， R. 等 (1996)PNAS 93 ： 5705-8)。这些化合物靶向 成为恶性肿瘤细胞能力的内在机制， 因为它们在有效抑制动物肿瘤生长的剂量下未出现毒 性 (Cohen， L.A.， Amin， S.， Marks， P.A.， Rifkind， R.A.， Desai， D. 和 Richon， V.M.(1999) Anticancer Research 19 ： 4999-5006)。 有多个证据表明组蛋白乙酰化和脱乙酰化是机理， 通过此类机理在细胞中实现转录调节 (Grunstein， M.(1997)Nature 389 ： 349-52)。据认 为， 通过改变组蛋白与核小体中螺旋 DNA 亲合力 ； 通过染色质结构中的变化发生这些作用。 已鉴定出 5 种组蛋白 ( 称为 H1、 H2A、 H2B、 H3 和 H4)。在核小体中发现组蛋白 H2A、 H2B、 H3 和 H4， 且 H1 是位于核小体之间的连接体。每个核小体在其核内含有两种组蛋白， 单独存在 于核小体结构的外层部分的 H1 除外。据认为， 当组蛋白乙酰化低时， 组蛋白与磷酸 DNA 骨 架结合的亲合力更大。该亲合力造成 DNA 与组蛋白紧密结合， 致使 DNA 难以转录调节元件 和机器。通过两个酶复合物组蛋白乙酰基转移酶 (HAT) 和组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 之间的 活性平衡发生调节乙酰化状态。据认为， 低乙酰化状态抑制有关 DNA 的转录。该低乙酰化 状态由包括 HDAC 酶的大多蛋白复合体催化。 HDACs 尤其表现出催化除去染色质核组蛋白的 乙酰基。
据认为， 经 X- 射线晶体分析法研究证实， 通过与酶的催化部位直接相互作用发生 SAHA 抑制 HDAC(Finnin， M.S.， Donigian， J.R.， Cohen， A. 等 (1999)Nature 401 ： 188-193)。 据认为， 抑制 HDAC 的结果对基因组无普遍性作用， 而是仅影响基因组的小子集 (Van Lint， C.， Emiliani， S.， Verdin， E.(1996)Gene Expression 5 ： 245-53)。用与 HDAC 抑制剂一 起培养的恶性肿瘤细胞系的 DNA 微排序 (microarrays) 提供的证据表明有其产物改变的 有限数量 (1-2％ ) 的基因。例如， 在培养基中用 HDAC 抑制剂处理细胞出现连续诱导依赖 细胞周期蛋白的激酶抑制剂 p21(Archer， S.Shufen， M.Shei， A.， Hodin， R.(1998)PNAS95 ： 6791-96)。该蛋白在抑制细胞周期中起重要作用。据认为， HDAC 抑制剂通过在 p21 基因区 域中蔓延组蛋白的高乙酰化状态增加 p21 转录率， 因而使基因可以转录机器。其表达不受HDAC 抑制剂影响的基因在区域关联组蛋白的乙酰化中没有变化 (Dressel， U.， Renkawitz， R.， Baniahmad， A.(2000)Anticancer Research 20(2A) ： 1017-22)。
在几个实例中表明， 破坏 HAT 或 HDAC 活性涉及恶性肿瘤表型的发展。例如， 在急 性早幼粒细胞白血病中， 由 PML 和 RARα 融合产生的瘤蛋白质似乎通过募集 HDACs 抑制特 异性基因转录 (Lin， R.J.， Nagy， L.， Inoue， S. 等 (1998)Nature 391 ： 811-14)。按该方式， 肿瘤细胞不能完成分化， 导致白血病细胞系过度增殖。
授予某些本发明人的美国专利号 5,369,108、 5,932,616、 5,700,811、 6,087,367 和 6,511,990 公开可用于选择性诱导肿瘤细胞终末分化的化合物， 这些化合物具有被亚甲 基柔性链或被刚性苯基分隔的两个极性端基， 其中极性端基的一个或两个是大疏水基团。 在酶测定中， 某些化合物在分子的同一末端还有与第一个疏水基团相同的大疏水基团， 该 基团进一步增加分化活性约 100 倍， 且在细胞分化测定中增加约 50 倍。用于本发明方法和 药用组合物的合成化合物的方法已在前述专利中充分描述， 其全部内容通过引用结合到本 文中。
已知目前的肿瘤治疗由用大于一种的抗肿瘤治疗剂联合治疗患者组成。 实例有将 放射治疗和化疗和 / 或细胞毒剂一起联合使用， 更新的是将免疫治疗例如使用肿瘤细胞特 异性治疗抗体与放射治疗联合。但是， 将各治疗相互联合以鉴别此类联合比单独的各方法 更有效的可能性需要大量的临床前和临床试验， 且没有这种实验就不可能预测何种联合显 示加和效应或甚至协同作用。
除了增加治疗效能目的外， 联合治疗的另一个目的是在得到的组合中可能减少各 成分的剂量， 以减少由大剂量的各成分引起的不需要或有害的副作用。
迫切需要发现治疗癌症的合适方法， 包括导致副作用减少和有效治疗和控制恶性 肿瘤的联合治疗。
发明概述
本发明基于组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 抑制剂例如辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) 可用 于与一种或多种抗癌药联合使用的发现， 提供治疗有效的抗癌作用。
意外地发现， 包括给予本文所述的 HDAC 抑制剂的第一治疗方案 (procedure) 和用 本文中所述的一种或多种抗癌药的第二治疗方案的组合可提供治疗有效抗癌作用。 每种治 疗 ( 给予 HDAC 抑制剂和给予抗癌药 ) 使用与其它治疗联合提供治疗有效治疗的量或剂量。
联合疗法可通过诱导癌细胞分化、 细胞生长停止和 / 或调亡起作用。 此外， HDAC 抑 制剂和抗癌药的作用可以是加和或协同作用。联合疗法尤其有利， 因为与单一药物疗法相 比， 在联合疗法中每个药物的剂量可减少， 同时仍然获得整体的抗肿瘤作用。
因此， 本发明涉及在有需要的患者中治疗癌症的方法， 该方法通过在第一治疗方 案中给予有需要的患者第一个量的辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) 或其药学上可接受的盐或 水合物， 和在第二治疗方案中给予第二个量的抗癌药物， 其中第一个和第二个量一起构成 治疗有效量。
本文中使用的治疗癌症是指部分或完全抑制、 延迟或预防哺乳动物例如人的癌症 发展包括癌转移 ； 抑制、 延迟或预防癌症复发包括癌转移 ； 或预防癌症发作或发展 ( 化学预 防 )。
本发明方法用于治疗多种癌症， 包括但不限于实体瘤 ( 例如肺、 乳腺、 结肠、 前列腺、 膀胱、 直肠、 脑或子宫内膜瘤 )、 血液恶性肿瘤 ( 例如白血病、 淋巴瘤、 骨髓瘤 )、 癌(例 如膀胱癌、 肾癌、 乳腺癌、 结肠直肠癌 )、 成神经细胞瘤或黑素瘤。这些癌症的非限定性实例 包括皮肤 T 细胞淋巴瘤 (CTCL)、 非皮肤周围 T 细胞淋巴瘤、 与人嗜 T 淋巴细胞病毒 (HTLV) 有关的淋巴瘤、 成人 T 细胞白血病 / 淋巴瘤 (ATLL)、 急性淋巴细胞白血病、 急性非淋巴细胞 白血病、 慢性淋巴细胞白血病、 慢性骨髓性白血病、 霍奇金病、 非霍奇金淋巴瘤、 多发性骨髓 瘤、 间皮瘤 ； 儿童实体瘤例如脑成神经细胞瘤、 成视网膜细胞瘤、 维尔姆斯瘤、 骨癌和软组织 肉瘤 ； 成人普通实体瘤例如头和颈癌 ( 例如口、 喉和食管癌 )、 泌尿生殖癌 ( 例如前列腺、 膀 胱、 肾、 子宫、 卵巢、 睾丸、 直肠和结肠癌 )、 肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 黑素瘤和其它皮肤癌 ； 胃 癌、 脑癌、 肝癌、 肾上腺癌、 肾癌、 甲状腺癌、 基底细胞癌、 溃疡性和乳头状鳞状细胞癌、 转移 性皮肤癌、 髓样癌、 骨样肉瘤、 尤因氏肉瘤、 veticulum 细胞肉瘤、 卡波西肉瘤、 成神经细胞瘤 和成视网膜细胞瘤。
该方法包括用第一治疗方案给予有需要的患者第一个量的 HDAC 抑制剂例如 SAHA， 和用第二治疗方案给予第二个量的抗癌药。第一和第二治疗一起构成治疗有效量。
本发明还涉及用于治疗癌症的药物组合。该药物组合包括第一个量的 HDAC 抑制 剂例如 SAHA 和第二个量的抗癌药。第一个和第二个量一起构成治疗有效量。 本发明还涉及第一个量的 HDAC 抑制剂和第二个量的抗癌药在制备用于治疗癌症 的药物中的用途。
在本发明的具体实施方案中， HDAC 抑制剂和抗癌药的组合是加和性的， 即联合治 疗方案产生各个成分单独给药时的加和效应结果。根据该实施方案， HDAC 抑制剂的量和抗 癌药的量一起构成治疗癌症的有效量。
在本发明的另一个具体实施方案中， 据认为， 当联合治疗方案产生的抗癌结果 ( 例如细胞生长停止、 调亡、 诱导分化、 细胞死亡 ) 比各个成分单独以治疗剂量给药时的加 和效应明显更好时， HDAC 抑制剂和抗癌药的组合是治疗协同性的。当结果明显更好时， 可 用标准统计分析测定。例如， 可采用 Mann-Whitney 检验或某些其它一般公认的统计分析。
治疗方案可按任何顺序序贯、 同时或其组合进行。例如， 给予 HDAC 抑制剂的第一 治疗方案可在第二治疗方案即抗癌药之前、 抗癌药的第二治疗方案之后、 与抗癌药的第二 治疗方案同时或其组合进行。 例如， 可决定 HDAC 抑制剂的总疗程。 可在开始用 HDAC 抑制剂 治疗前或用 HDAC 抑制剂治疗之后给予抗癌药。另外， 在给予 HDAC 抑制剂期间， 可给予抗癌 药治疗， 但不需要在整个 HDAC 抑制剂治疗期间发生。 同样， 在给予抗癌药期间， 可给予 HDAC 抑制剂治疗， 但不需要在整个抗癌药治疗期间发生。 在另一个实施方案中， 治疗方案包括用 HDAC 抑制剂或抗癌药的一种药物预治疗， 随后在治疗期间加入第二种药物。
在本发明的一个具体实施方案中， 可将 HDAC 抑制剂与任何一种或多种其它 HDAC 抑制剂、 烷化剂、 抗生素、 抗代谢药、 激素药、 植物来源药、 抗血管形成药、 分化诱导剂、 细胞 生长停止诱导剂、 细胞调亡诱导剂、 细胞毒药物、 生物药、 基因治疗药或其任何组合联合给 药。
在本发明的一个具体实施方案中， HDAC 抑制剂是辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA)， 它 可与任何一种或多种另外的 HDAC 抑制剂、 烷化剂、 抗生素、 抗代谢药、 激素药、 植物来源药、 抗血管形成药、 分化诱导剂、 细胞生长停止诱导剂、 细胞调亡诱导剂、 细胞毒药物、 生物药、 基因治疗药或其任何组合联合给药。
适用于本发明的 HDAC 抑制剂包括但不限于本文中定义的异羟肟酸衍生物、 短链 脂肪酸 (SCFAs)、 环四肽、 苯甲酰胺衍生物或亲电性酮衍生物。 适用于本发明方法的 HDAC 抑 制剂的具体非限定性实例有 ：
A) 选自以下的异羟肟酸衍生物 ： SAHA、 Pyroxamide、 CBHA、 曲古抑菌素 A(TSA)、 曲 古抑菌素 C、 水杨酰基二异羟肟酸、 壬二异羟肟酸 (Azelaic Bishydroxamic Acid)(ABHA)、 壬二酸 -1- 异羟肟酸酯 -9- 酰苯胺 (Azelaic-1-Hydroxamate-9-Anilide)(AAHA)、 6-(3- 氯 苯基脲基 ) 己异羟肟酸 (carpoic Hydroxamic Acid)(3Cl-UCHA)、 Oxamflatin、 A-161906、 Scriptaid、 PXD-101、 LAQ-824、 CHAP、 MW2796 和 MW2996 ；
B) 选 自 以 下 的 环 四 肽 ： Trapoxin A、 FR901228(FK 228 或 酯 肽 )、 FR225497、 Apicidin、 CHAP、 HC- 毒素、 WF27082 和 Chlamydocin ；
C) 选自以下的短链脂肪酸 (SCFAs) ： 丁酸钠、 异戊酸盐 ( 酯 )、 戊酸盐 ( 酯 )、 4- 苯 基丁酸盐 ( 酯 )(4-PBA)、 苯基丁酸盐 ( 酯 )(PB)、 丙酸盐 ( 酯 )、 丁酰胺、 异丁酰胺、 苯基乙酸 盐 ( 酯 )、 3- 溴丙酸盐 ( 酯 )、 三丁精、 丙戊酸和丙戊酸盐 ( 酯 ) ；
D) 选 自 以 下 的 苯 甲 酰 胺 衍 生 物 ： CI-994、 MS-27-275(MS-275) 和 MS-27-275 的 3′ - 氨基衍生物 ；
E) 选自以下的亲电性酮衍生物 ： 三氟甲基酮和 α- 酮酰胺例如 N- 甲基 -α- 酮酰 F) 包括天然产物、 psammaplins 和 Depudecin 的各种 HDAC 抑制剂。 具体的 HDAC 抑制剂包括 ： 由以下结构式代表的辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) ：胺； 和
由以下结构式代表的 Pyroxamide ：
由 以 下 结 构 式 代 表 的 间 羧 基 肉 桂 酸 二 羟 酰 胺 (m-Carboxycinnamic acid bishydroxamate)(CBHA) ：适用于本发明方法的 HDAC 抑制剂的其它非限定性实例有 ： 由以下结构代表的化合物 ：
其中 R3 和 R4 独立为取代或未取代的以下基团 ： 支链或非支链的烷基、 烯基、 环烷 基、 芳基、 烷氧基、 芳氧基、 芳基烷氧基或吡啶基 ； 环烷基、 芳基、 芳氧基、 芳基烷氧基或吡啶 基， 或 R3 和 R4 结合在一起形成哌啶基 ； R2 为羟氨基 ； 且 n 为 5-8 的整数。
由以下结构代表的化合物 ：
其中 R 为取代或未取代的以下基团 ： 苯基、 哌啶、 噻唑、 2- 吡啶、 3- 吡啶或 4- 吡啶， 且 n 为 4-8 的整数。
由以下结构代表的化合物 ：
其中 A 为酰胺部分， R1 和 R2 各自选自取代或未取代的芳基、 芳基烷基、 萘基、 吡啶氨 基、 9- 嘌呤 -6- 氨基、 噻唑氨基、 芳氧基、 芳基烷氧基、 吡啶基、 喹啉基或异喹啉基 ； R4 为氢、 卤素、 苯基或环烷基部分， 且 n 为 3-10 的整数。
适用于本发明的烷化剂包括但不限于二氯乙胺类 ( 氮芥例如苯丁酸氮芥、 环磷酰 胺、 异环磷酰胺、 氮芥、 美法仑、 乌拉莫司汀 )、 吖丙啶 ( 例如塞替派 )、 烷基酮磺酸酯 ( 例如 白消安 )、 亚硝基脲 ( 例如卡莫司汀、 洛莫司汀、 链佐星 )、 非经典烷化剂 ( 六甲蜜胺、 达卡巴 嗪和丙卡巴肼 )、 铂化合物 ( 卡铂和顺铂 )。
适用于本发明的抗生素为蒽环霉素 ( 例如多柔比星、 柔红霉素、 表柔比星、 伊达比 星和蒽二酮 )、 丝裂霉素 C、 博来霉素、 放线菌素 D、 plicatomycin。
适用于本发明的抗代谢药包括但不限于氟尿苷、 氟尿嘧啶、 甲氨蝶呤、 亚叶酸、 羟 基脲、 硫鸟嘌呤、 巯嘌呤、 阿糖胞苷、 喷司他丁、 磷酸氟达拉滨、 克拉曲滨、 天冬酰胺酶和吉西 他滨。在一个具体实施方案中， 抗代谢药为吉西他滨。
适用于本发明的激素药包括但不限于雌激素、 孕激素、 抗雌激素药、 雄激素、 抗雄 激素药、 LHRH 类似物、 芳化酶抑制剂、 己烯雌酚、 他莫昔芬、 托瑞米芬、 fluoxymesterol、 雷洛 昔芬、 比卡鲁胺、 尼鲁米特、 氟他胺、 氨鲁米特、 四唑、 酮康唑、 醋酸戈舍瑞林、 亮丙立德、 醋酸 甲地孕酮和米非司酮。
适用于本发明的植物来源药物包括但不限于长春新碱、 长春碱、 长春酰胺、 长春利
定、 长春瑞滨、 依托泊苷、 替尼泊苷、 紫杉醇和多西他赛。
适用于本发明的生物药包括但不限于免疫调节蛋白、 抗肿瘤抗原的单克隆抗体、 肿瘤抑制基因和癌疫苗。例如， 免疫调节蛋白可以为白介素 2、 白介素 4、 白介素 12、 干扰 素 E1、 干扰素 D、 α 干扰素、 红细胞生成素、 粒细胞 -CSF ； 粒细胞、 巨噬细胞 -CSF ； 芽孢杆菌 Cahnette-Guerin、 左旋咪唑或奥曲肽。此外， 肿瘤抑制基因可以为 DPC-4、 NF-1、 NF-2、 RB、 p53、 WT1、 BRCA 或 BRCA2。
可通过任何本领域技术人员已知的给药方法给予 HDAC 抑制剂 ( 例如 SAHA) 和抗 癌药。给药途径的实例包括但不限于口服、 肠胃外、 腹膜内、 静脉内、 动脉内、 透皮、 舌下、 肌 内、 直肠、 经口颊、 鼻内、 脂质体 ； 通过吸入、 阴道、 眼内 ； 通过导管或印模 (stent) 局部释放、 皮下、 脂肪内、 关节腔内、 鞘内或缓释剂型。
当然， SAHA 或其它 HDAC 抑制剂中任何一种的给药途径独立于抗癌药的给药途径。 目前优选的 SAHA 的给药途径为口服给药。因此， 按照该实施方案， 经口给予 SAHA， 可经口、 肠胃外、 腹膜内、 静脉内、 动脉内、 透皮、 舌下、 肌内、 直肠、 经口颊、 鼻内、 脂质体 ； 通过吸入、 阴道、 眼内 ； 通过导管或印模局部释放、 皮下、 脂肪内、 关节腔内、 鞘内或以缓释剂型给予第 二种药物 ( 抗癌药 )。
可按照任何剂量和给药方案给予 SAHA 或任何一种 HDAC 抑制剂， 与抗癌药的作用 一起达到有效治疗癌症的剂量。例如， 给予的 SAHA 或任何一种 HDAC 抑制剂的总日剂量可 最高达 800mg， 优选口服， 每日一次、 两次和三次， 连续 ( 每日 ) 或间断 ( 例如 3-5 日 / 周 )。
因此， 本发明涉及在有需要的患者中治疗癌症的方法， 该方法通过在第一治疗方 案中给予有需要的患者总日剂量最高达 800mg 的第一个量的辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) 或其药学上可接受的盐或水合物， 和在第二治疗方案中给予第二个量的抗癌药， 其中第一 个和第二个量一起构成治疗有效量。
在一个实施方案中， 以药用组合物给予 HDAC 抑制剂例如 SAHA， 优选适合口服给 药。 在目前优选的实施方案中， 用明胶胶囊口服给予 SAHA， 该胶囊可含有赋形剂例如微晶纤 维素、 交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁。
可按总日剂量和不同剂量方案给予 HDAC 抑制剂， 该总日剂量可随不同患者改变。 2 口服的合适剂量为总日剂量约 25-4000mg/m ， 每日一次、 每日两次或三次， 连续 ( 每日 ) 或 间断 ( 例如 3-5 日 / 周 )。此外， 可按周期给予组合物， 在各周期之间有停药期 ( 例如治疗 2-8 周， 在治疗之间有最高达 1 周停药期 )。
在一个实施方案中， 按约 200-600mg 剂量给予组合物， 每日一次。在另一个实施方 案中， 按约 200-400mg 剂量给予组合物， 每日二次。 在另一个实施方案中， 按约 200-400mg 剂 量间断例如每周三、 四或五天给予组合物， 每日二次。在一个实施方案中， 日剂量为 200mg， 可每日一次、 二次或三次给予。在一个实施方案中， 日剂量为 300mg， 可每日一次、 二次或三 次给予。在一个实施方案中， 日剂量为 400mg， 可每日一次、 二次或三次给予。
HDAC 抑制剂的任何一种或多种具体剂量和剂量方案对本领域技术人员而言为显 而易见的， 也适用于联合治疗中使用的任何一种或多种抗癌药。 此外， 还可以改变抗癌药的 具体剂量和剂量方案， 最佳的剂量、 给药方案和给药途径将根据具体用的抗癌药而定。
本发明还通过在第一治疗方案中给予患者第一个量的辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) 或其药学上可接受的盐或水合物， 和在第二治疗方案中给予第二个量的抗癌药， 提供选择性诱导瘤细胞终末分化、 细胞生长停止和 / 或调亡因而抑制患者的此类细胞增殖的 方法， 其中第一个和第二个量一起构成有效诱导细胞终末分化、 细胞生长停止、 细胞调亡的 量。
本发明还通过使细胞与第一个量的辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) 或其药学上可接 受的盐或水合物和第二个量的抗癌药接触， 提供选择性诱导瘤细胞终末分化、 细胞生长停 止和 / 或调亡从而抑制此类细胞增殖的体外方法， 其中第一个和第二个量一起构成有效诱 导细胞终末分化、 细胞生长停止、 细胞调亡的量。
鉴于两种治疗形式有关的差别毒性， 联合疗法可提供治疗优势。例如， 用 HDAC 抑 制剂治疗可导致抗癌药中未出现的特殊毒性， 反之亦然。 因此， 该差别毒性可允许每种治疗 在所述毒性不存在或最小的剂量下给予， 以便联合疗法一起提供治疗剂量， 同时避免联合 药物中各个成分的毒性。 而且， 当由于联合治疗增强或协同而达到疗效时， 例如明显优于加 和疗效， 每个药物的剂量甚至还可减少， 因而更大程度降低有关的毒性。
附图简述
通过以下本发明优选实施方案的更具体描述， 本发明的前述和其它目的、 特征和 优点将显而易见， 如附图所举例说明， 其中相似的对照特征是指不同角度的相同部分。 这些 图无需标度， 强调而非阐述本发明原理。 图1： SAHA 和吉西他滨组合在 T24 细胞系中的作用。如实验部分所述， 在指定时间 点， 细胞未处理 ( □ )， 用 2nM 吉西他滨处理 ( ◇ )， 用 5μM SAHA 处理 (o)， 或用 2nM 吉西他 滨和 5μM SAHA 组合处理 ( △ )。图 1A 表示细胞增殖， 图 1B 表示细胞生存力。
图2： SAHA 和吉西他滨组合在 LnCaP 细胞系中的作用。如实验部分所述， 在指定时 间点， ( □ ) 表示未处理细胞， ( ◇ ) 表示用 2nM 吉西他滨处理， (o) 表示用 5μM SAHA 处 理， 或 ( △ ) 表示用 2nM 吉西他滨和 5μM SAHA 组合处理。图 2A 表示细胞增殖， 图 2B 表示 细胞生存力。
图3： SAHA 和 5- 氮杂胞苷组合在 T24 细胞系中的作用。如实验部分所述， 在指定 时间点， ( □ ) 表示未处理细胞， ( ◇ ) 表示用 200nM 5- 氮杂胞苷 (AZ) 处理， (o) 表示用 5μMSAHA 处理， 或 ( △ ) 表示用 200nM5- 氮杂胞苷和 5μMSAHA 组合处理。图 3A 表示细胞 增殖， 图 3B 表示细胞生存力。星号 (*) 表示加入 SAHA 的时间点。
图4： SAHA 组合对 MDA-231 细胞增殖的作用。图 4A ： 细胞用指定浓度 SAHA 预处理 4 小时， 洗涤， 然后加入第二种药物保持 48 小时。图 4B ： 细胞用指定浓度 SAHA 预处理 48 小 时， 加入第二种药物保持 4 小时， 然后冲洗细胞。48 小时后， 用 MTS 定量测定细胞生长。
图5： SAHA 组合对 DU145 细胞增殖的作用。细胞用指定浓度 SAHA 预处理 48 小时， 加入第二种药物保持 4 小时， 然后冲洗细胞。48 小时后， 用 MTS 定量测定细胞生长。
图6： SAHA 组合对 DU145 细胞克隆发生的作用。细胞用 SAHA 处理 48 小时， 然后加 入第二种药物保持 4 小时， 然后冲洗细胞。2-3 周后评价集落形成。
图7： SAHA 组合对 MDA-231 细胞克隆发生的作用。细胞用 SAHA 处理 48 小时， 加入 第二种药物保持 4 小时， 然后冲洗细胞。2-3 周后评价集落形成。
图8： SAHA 组合对 U118 细胞克隆发生的作用。细胞用 SAHA 处理 48 小时， 加入第 二种药物保持 4 小时， 然后冲洗细胞。2-3 周后评价集落形成。
图9： 用 SAHA 和伊立替康处理 LnCap 细胞的抑制百分率。细胞与指定浓度的单独
SAHA 温育 ； 与单独伊立替康温育 ； 以及与 SAHA 和伊立替康组合温育。每个实验右手边柱状 图代表加和相互作用的计算效果。
图 10 ： 用 SAHA 和 5- 氟尿嘧啶 (5-FU) 处理 LnCap 细胞的抑制百分率。细胞与指 定浓度的单独 SAHA 温育 ； 与单独 5-FU 温育 ； 以及与 SAHA 和 5-FU 组合温育。每个实验右手 边柱状图代表加和相互作用的计算效果。
图 11 ： 用 SAHA 和多西他赛处理 LnCap 细胞的抑制百分率。细胞与指定浓度的单 独 SAHA 温育 ； 与单独多西他赛温育 ； 以及与 SAHA 和多西他赛组合温育。 每个实验右手边柱 状图代表加和相互作用的计算效果。
发明详述
本发明涉及通过在第一治疗方案中给予有需要的患者第一个量的 HDAC 抑制剂或 其药学上可接受的盐或水合物和在第二治疗方案中给予第二个量的抗癌药， 在有需要的患 者中治疗癌症的方法， 其中第一个和第二个量一起构成治疗有效量。HDAC 抑制剂和抗癌药 的作用可以是加和性或协同的。
本发明还涉及通过在第一治疗方案中给予有需要的患者第一个量的辛二酰苯胺 异羟肟酸 (SAHA) 或其药学上可接受的盐或水合物和在第二治疗方案中给予第二个量的 抗癌药， 在有需要的患者中治疗癌症的方法， 其中第一个和第二个量一起构成治疗有效量。 SAHA 和抗癌药的作用可以是加和性或协同的。 与本发明有关的术语 “治疗” 的各种语法形式是指预防 ( 即化学预防 )、 治愈、 逆 转、 减轻、 缓解、 最小化、 抑制或停止疾病状态、 疾病发展、 疾病病原体 ( 例如细菌或病毒 ) 或 其它异常病症的有害作用。例如， 治疗可涉及缓解疾病症状 ( 即不一定是全部症状 ) 或减 缓疾病发展。 因为某些本发明方法涉及物理去除病原体， 技术人员会认识到， 在暴露于病原 体前或同时给予本发明化合物 ( 预防治疗 ) 和暴露于病原体后 ( 甚至康复后 ) 给予本发明 化合物的情形中， 它们同等有效。
本文中所用的癌症治疗是指部分或完全抑制、 延迟或预防癌症包括癌转移的进 程； 抑制、 延迟或预防包括癌转移的癌的复发 ； 或预防 ( 化学预防 ) 哺乳动物例如人的癌症 发作或发展。另外， 本发明方法将用于化学预防治疗人癌症患者。但是， 本发明方法也可能 有效治疗其它哺乳动物的癌症。
本文中使用的术语 “治疗有效量” 是指联合疗法中第一和第二治疗的组合量有效。 该组合量实现需要的生物反应。 在本发明中， 需要的生物反应为部分或完全抑制、 延迟或预 防癌症包括癌转移的进程 ； 抑制、 延迟或预防癌症包括癌转移的复发 ； 或预防 ( 化学预防 ) 哺乳动物例如人的癌症发作或发展。
本文中可互换使用的术语 “组合治疗” 、 “联合疗法” 、 “联合治疗” 是指用至少两种 不同的治疗药物治疗个体。根据本发明， 个体用第一种治疗药物， 优选 SAHA 或另一种本文 所述的 HDAC 抑制剂治疗。第二种治疗药物可以是另一种 HDAC 抑制剂， 或可以是本文定义 的任何临床上确定的抗癌药。联合治疗可包括第三种或甚至更多的治疗药物。
该方法包括在第一治疗方案中给予有需要的患者第一个量的组蛋白脱乙酰酶抑 制剂如 SAHA， 和在第二治疗方案中给予第二个量的抗癌药。第一和第二治疗一起构成治疗 有效量。
本发明还涉及用于治疗癌症的药物组合。该药物组合包含第一个量的 HDAC 抑制
剂如 SAHA 和第二个量的抗癌药。第一个和第二个量一起构成治疗有效量。
本发明还涉及第一个量的 HDAC 抑制剂和第二个量的抗癌药在制备治疗癌症药物 中的用途。
在本发明的具体实施方案中， HDAC 抑制剂和抗癌药组合为加和性的， 即联合治疗 方案产生各个成分单独给药的加和效应结果。根据该实施方案， HDAC 抑制剂的量和抗癌药 的量一起构成治疗癌症的有效量。
在本发明的另一个具体实施方案中， 当联合治疗方案产生比各个组分以治疗剂量 单独给药的加和效应明显更好的抗癌结果时 ( 例如细胞生长停止、 调亡、 诱导分化、 细胞死 亡 )， 可认为 HDAC 抑制剂和抗癌药组合为治疗协同的。 当结果明显更好时， 可用标准统计分 析确定。例如可用 Mann-Whitney 检验或某些其他一般公认的统计分析。
治疗方案可按任何顺序序贯、 同时或其组合进行。 例如， 可在第二治疗方案即抗癌 药之前、 在抗癌药的第二种治疗之后、 与抗癌药的第二种治疗同时或其组合， 给予第一治疗 方案的 HDAC 抑制剂。例如， 可确定 HDAC 抑制剂的总疗程。可在用 HDAC 抑制剂治疗开始前 或用 HDAC 抑制剂治疗后给予抗癌药。另外， 在给予 HDAC 抑制剂期间， 可给予抗癌药治疗， 但不需要在整个 HDAC 抑制剂治疗期间发生。在另一个实施方案中， 治疗方案包括用 HDAC 抑制剂或抗癌药的一种药物预治疗， 随后加入第二种药物。 本发明方法用于治疗多种癌症， 包括但不限于实体瘤 ( 例如肺、 乳腺、 结肠、 前列 腺、 膀胱、 直肠、 脑或子宫内膜的肿瘤 ) ； 血液恶性肿瘤 ( 例如白血病、 淋巴瘤、 骨髓瘤 )、 癌 ( 例如膀胱癌、 肾癌、 乳腺癌、 结肠直肠癌 )、 成神经细胞瘤或黑素瘤。这些癌的非限定性实 例包括皮肤 T 细胞淋巴瘤 (CTCL)、 非皮肤周围 T 细胞淋巴瘤、 与人嗜 T 淋巴细胞病毒 (HTLV) 有关的淋巴瘤、 成人 T 细胞白血病 / 淋巴瘤 (ATLL)、 急性淋巴细胞白血病、 急性非淋巴细胞 白血病、 慢性淋巴细胞白血病、 慢性骨髓性白血病、 霍奇金病、 非霍奇金淋巴瘤、 多发性骨髓 瘤、 间皮瘤 ； 儿童实体瘤例如脑成神经细胞瘤、 成视网膜细胞瘤、 维尔姆斯瘤、 骨癌和软组织 肉瘤 ； 成人普通实体瘤例如头和颈癌 ( 例如口、 喉和食管 )、 泌尿生殖癌 ( 例如前列腺、 膀 胱、 肾、 子宫、 卵巢、 睾丸、 直肠和结肠癌 )、 肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 黑素瘤和其它皮肤癌 ； 胃 癌、 脑癌、 肝癌、 肾上腺癌、 肾癌、 甲状腺癌、 基底细胞癌、 溃疡性和乳头状鳞状细胞癌、 转移 性皮肤癌、 髓样癌、 骨样肉瘤、 尤因氏肉瘤、 veticulum 细胞肉瘤、 卡波西肉瘤、 成神经细胞瘤 和成视网膜细胞瘤。
在本发明的一个具体实施方案中， HDAC 抑制剂可与另外的 HDAC 抑制剂联合给药。 在本发明的另一个具体实施方案中， HDAC 抑制剂可与烷化剂联合给药。在本发明的另一个 具体实施方案中， HDAC 抑制剂可与抗生素药物联合给药。在本发明的另一个具体实施方案 中， HDAC 抑制剂可与抗代谢药联合给药。在本发明的另一个具体实施方案中， HDAC 抑制剂 可与激素药联合给药。在本发明的另一个具体实施方案中， HDAC 抑制剂可与植物来源药联 合给药。在本发明的另一个具体实施方案中， HDAC 抑制剂可与抗血管形成药联合给药。在 本发明的另一个具体实施方案中， HDAC 抑制剂可与分化诱导剂联合给药。在本发明的另一 个具体实施方案中， HDAC 抑制剂可与细胞生长停止诱导剂联合给药。在本发明的另一个具 体实施方案中， HDAC 抑制剂可与细胞调亡诱导剂联合给药。在本发明的另一个具体实施方 案中， HDAC 抑制剂可与细胞毒药物联合给药。在本发明的另一个具体实施方案中， HDAC 抑 制剂可与生物药联合给药。在本发明的另一个具体实施方案中， HDAC 抑制剂可与另外的
HDAC 抑制剂、 烷化剂、 抗生素、 抗代谢药、 激素药、 植物来源药、 抗血管形成药、 分化诱导剂、 细胞生长停止诱导剂、 细胞调亡诱导剂、 细胞毒药物或生物药的任何组合联合给药。
在本发明的一个具体实施方案中， HDAC 抑制剂为 SAHA， 它可与任何一种或多种其 它 HDAC 抑制剂、 烷化剂、 抗生素、 抗代谢药物、 激素药物、 植物来源药、 抗血管形成药、 分化 诱导剂、 细胞生长停止诱导剂、 细胞调亡诱导剂、 细胞毒药物、 生物药物、 基因治疗药物或其 任何组合联合给药。
鉴于与两种治疗形式有关的差别毒性， 联合疗法可提供治疗优势。例如， 用 HDAC 抑制剂治疗可导致用抗癌药时未出现的特殊毒性， 反之亦然。 因此， 该差别毒性可允许每种 治疗在所述毒性不存在或最小的剂量下给予， 以便联合疗法一起提供治疗剂量， 同时避免 联合药物中各个成分的毒性。 而且， 当由于联合治疗增强或协同而获得疗效时， 例如明显优 于加和疗效， 每个药物的剂量甚至还可进一步减少， 因而更大程度降低有关的毒性。
组蛋白脱乙酰酶和组蛋白脱乙酰酶抑制剂
本文中使用的术语组蛋白脱乙酰酶 (HDACs) 是催化除去核小体核组蛋白氨基末 尾上的赖氨酸残基中的乙酰基的酶。因此， HDACs 与组蛋白乙酰基转移酶 (HATs) 一起调节 组蛋白的乙酰化状态。组蛋白乙酰化影响基因表达， 且 HDACs 抑制剂例如基于异羟肟酸的 杂化极性化合物辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) 体外诱导转化细胞生长停止、 分化和 / 或凋 亡， 体内抑制肿瘤生长。根据结构同源性， HDACs 可分为三类。第 I 类 HDACs(HDACs 1、 2、 3 和 8) 具有酵母 RPD3 蛋白相似性， 位于细胞核内， 在与转录辅阻遏物相关的复合物中发现。 第 II 类 HDACs(HDACs 4、 5、 6、 7 和 9) 与酵母 HDA1 蛋白相似， 并且具有核和胞质亚细胞定位。 基于异羟肟酸的 HDAC 抑制剂例如 SAHA 抑制第 I 和 II 类 HDACs。第 III 类 HDACs 形成结构 不相近类 NAD 依赖性酶， 它们与酵母 SIR2 蛋白相关， 不受基于异羟肟酸的 HDAC 抑制剂的抑 制。
本文中使用的术语组蛋白脱乙酰酶抑制剂或 HDAC 抑制剂是体内、 体外或两者能 够抑制组蛋白脱乙酰化的化合物。因此， HDAC 抑制剂抑制至少一种组蛋白脱乙酰酶的活 性。由于抑制至少一种组蛋白脱乙酰化， 出现乙酰化组蛋白增加且乙酰化组蛋白蓄积是评 价 HDAC 抑制剂活性的合适生物标记。因此， 可测定乙酰化组蛋白蓄积的方法可用于测定目 的化合物的 HDAC 抑制活性。应理解可抑制组蛋白脱乙酰酶活性的化合物也可与其它底物 结合， 因此可抑制其它生物活性分子例如酶。还应理解本发明化合物能抑制以上阐述的任 何组蛋白脱乙酰酶或任何其它组蛋白脱乙酰酶。
例如， 在接受 HDAC 抑制剂的患者中， 可用适当对照测定在用 HDAC 抑制剂处理的外 周单核细胞和组织中的乙酰化组蛋白蓄积。
可用例如显示抑制至少一种组蛋白脱乙酰酶的酶试验体外测定具体化合物的 HDAC 抑制活性。另外， 测定在用具体组合物处理的细胞中乙酰化组蛋白的蓄积可测定化合 物的 HDAC 抑制活性。
测定乙酰化组蛋白蓄积的方法在文献中已熟知。参见， 例如 Marks， P.A. 等， J. Natl.Cancer Inst.92 ： 1210-1215 ， 2000 ， Butler ， L. M. 等， Cancer Res.60 ： 5165-5170(2000) ； Richon， V.M. 等， Proc.Natl.Acad.Sci.， USA， 95 ： 3003-3007， 1998 和 Yoshida， M. 等， J. Biol.Chem.， 265 ： 17174-17179， 1990。
例如， 测定 HDAC 抑制剂化合物活性的酶测定可进行如下。简单地说， 可通过在冰上， 无底物存在下， 将酶制剂与设定量的抑制剂化合物温育约 20 分钟， 测定 HDAC 抑制剂化 合物对纯化的人已附加表位的 ( 旗型 )HDAC1 亲合力的影响。可加入底物 ([3H] 乙酰基标 记的源自鼠红白血病细胞的组蛋白 )， 可将样品在 37 ℃下， 在总体积 30μL 中温育 20 分 钟。然后可终止反应， 可萃取释放出的乙酸酯， 通过闪烁计数测定释放的放射量。另一个用 于测定 HDAC 抑制剂化合物活性的测定方法是来自 Research Laboratories， Inc.， Plymouth Meeting， PA 的″ HDAC 荧光活性测定 ； 药物发现试剂盒 (Drug Discovery Kit)-AK-500″。
可如下进行体内研究。可给动物例如小鼠腹膜内注射 HDAC 抑制剂化合物。给药 后， 可在预定时间分离选择的组织例如脑、 脾、 肝等。可从基本上同 Yoshida 等， J. Biol. Chem.265 ： 17174-17179， 1990 所述的组织中分离组蛋白。可在 15％ SDS- 聚丙烯酰胺凝胶 进行等量组蛋白 ( 约 1μg) 电泳， 然后可转移至 Hybond-P 滤器 ( 得自 Amersham)。滤器可 用 3％乳阻塞， 可用兔纯化多克隆抗乙酰化组蛋白 H4 抗体 (α-Ac-H4) 和抗乙酰化组蛋白 H3 抗体 (α-Ac-H3)(Upstate Biotechnology， Inc.) 探测。可用轭合辣根过氧化物酶的山 羊抗兔抗体 (1 ∶ 5000) 和 SuperSignal 化学发光底物 (Pierce) 目测检查乙酰化组蛋白水 平。作为组蛋白的载样对照， 可进行平行凝胶电泳， 然后用考马斯蓝 (CB) 染色。
此外， 已表明基于异羟肟酸的 HDAC 抑制剂上调 p21WAF1 基因表达。 用标准方法使多 WAF1 WAF1 种转化细胞与 HDAC 抑制剂一起培养， 2 小时内诱导出 p21 蛋白。p21 基因诱导与在该 基因的染色质区域中乙酰化组蛋白蓄积有关。 因此， 可认为 p21WAF1 诱导涉及由 HDAC 抑制剂 导致的转化细胞中 G1 细胞周期停止。
HDAC 抑制剂有效治疗较宽范围的特征为瘤细胞增殖的疾病， 例如上文中所述的任 一癌症。但是， HDAC 抑制剂的治疗用途不限于治疗癌症。已发现 HDAC 抑制剂可用于很多 种疾病。
例如， 发现 HDAC 抑制剂尤其是 SAHA 用于治疗各种急性和慢性炎性疾病、 自身免疫 疾病、 变应性疾病、 与氧化应激性有关的疾病和特征为细胞过度增殖的疾病。非限定性实 例有关节炎症包括类风湿性关节炎 (RA) 和银屑病性关节炎 ； 炎性肠病例如节段性回肠炎 和溃疡性结肠炎 ； 脊锥关节病 ； 硬皮病 ； 银屑病 ( 包括 T 细胞介导的银屑病 ) 和炎性皮肤病 例如皮炎、 湿疹、 特应性皮炎、 过敏性接触性皮炎、 荨麻疹 ； 脉管炎 ( 例如坏死性、 皮肤和过 敏性脉管炎 ) ； 嗜酸性肌炎、 嗜酸性筋膜炎 ； 伴有皮肤或器官白细胞浸润的癌症、 局部缺血 性损伤包括脑缺血 ( 例如创伤所致脑损伤、 癫痫、 出血或中风， 其中每种情形可导致神经变 性)； HIV、 心力衰竭 ； 慢性、 急性或恶性肝病、 自身免疫性甲状腺炎 ； 全身性红斑狼疮、 斯耶 格伦 (sjorgren’ s) 综合征、 肺病 ( 例如 ARDS) ； 急性胰腺炎 ； 肌萎缩性侧索硬化症 (ALS) ； 早老性痴呆 ； 恶病质 / 厌食症 ； 哮喘 ； 动脉粥样硬化 ； 慢性疲劳综合征、 发烧 ； 糖尿病 ( 例如 胰岛素糖尿病或青少年糖尿病 ) ； 肾小球肾炎 ； 移植物对宿主排斥 ( 例如在移植手术中 ) ； 出血性休克 ； 痛觉过敏 ； 炎性肠病 ； 多发性硬化症 ； 肌病 ( 例如肌蛋白代谢， 尤其在脓毒症 中)； 骨质疏松症 ； 帕金森病 ； 疼痛 ； 早产 ； 银屑病 ； 再灌注损伤 ； 细胞因子引起的毒性 ( 例 如脓毒性休克、 内毒性休克 ) ； 放疗所致副作用、 颞的下颌骨关节病、 肿瘤转移 ； 或劳损、 扭 伤、 软骨损伤、 创伤例如灼伤、 矫形手术、 感染或其它疾病过程导致的炎症。 变应性疾病和病 症包括但不限于呼吸变应性疾病例如哮喘、 过敏性鼻炎、 过敏性肺病、 过敏性肺炎、 嗜酸性 肺炎 ( 例如吕弗勒 (Loeffler’ s) 综合征、 慢性嗜酸性肺炎 )、 迟发型超敏反应、 间质性肺病 (ILD)( 例如特发性肺纤维变性或与类风湿性关节炎、 全身性红斑狼疮、 关节强硬性脊椎 炎、 全身性硬化症、 斯耶格伦综合征、 多肌炎或皮肌炎有关的 ILD) ； 全身性过敏反应或超敏 反应、 药物过敏 ( 例如对青霉素、 头孢菌素类 )、 昆虫叮咬过敏等。
例如， 发现 HDAC 抑制剂尤其是 SAHA 可用于治疗各种神经变性疾病， 其非穷尽性列 举如下 ：
I. 特征在于无其它显著神经病学体征的进行性痴呆的病症， 例如早老性痴呆 ； 阿 尔茨海默病型老年性痴呆和皮克 (Pick’ s) 病 ( 脑叶萎缩 )。
II. 合 并 进 行 性 痴 呆 与 其 它 明 显 神 经 异 常 的 综 合 征， 例如 ： A) 主 要 在 成 人 中 出 现 的 综 合 征 ( 例 如 亨 廷 顿 舞 蹈 病、 合 并 痴 呆 与 运 动 失 调 和 / 或 帕 金 森 病、 进 行 性 核 上 麻 痹 (Steel-Richardson-Olszewski)、 弥散性雷维小体病和皮质齿状核 (corticodentatonigral) 变性表现的多系统萎缩 ) ； 和 B) 主要出现在儿童或青年成人中的 综合征 ( 例如哈 - 施 (Hallervorden-Spatz) 病和进行性家族性肌阵挛性癫痫 )。
III. 体态和运动逐渐发展异常的综合征， 例如震颤性麻痹 ( 帕金森病 )、 纹状体黑 质变性、 进行性核上麻痹、 扭转性肌张力障碍 ( 扭转性痉挛 ； 畸形性肌张力障碍 )、 痉挛性斜 颈和其它运动障碍、 家族性震颤和图雷特 (Gilles de la Tourette) 综合征。 IV. 进行性运动失调的综合征， 例如小脑退化 ( 例如小脑皮质变性和橄榄体脑桥 小脑萎缩 (OPCA)) ； 和脊髓小脑退化 ( 弗里德赖希 (Friedreich’ s) 共济失调及有关病症 )。
V. 中枢自主神经系统衰竭综合征 ( 夏 - 德雷格 (Shy-Drager) 综合征 )。
VI. 无感觉改变的肌无力和消瘦的综合征 ( 运动神经元疾病例如肌萎缩性侧索 硬化、 脊髓性肌萎缩 ( 例如婴儿脊髓性肌萎缩 (Werdnig-Hoffman)、 青少年脊髓性肌萎缩 (Wohlfart-Kugelberg-Welander) 和其它形式的家族性脊髓性肌萎缩 )、 原发性侧索硬化 和遗传性痉挛性截瘫。
VII. 合并有感觉改变的肌无力和消瘦的综合征 ( 进行性神经性肌萎缩 ； 慢性 家族性多神经病 )， 例如腓肌型肌萎缩 (Charcot-Marie-Tooth)、 肥大间质性多神经病 (Dejerine-Sottas) 和各种形式的慢性进行性神经病。
VIII. 进行性视觉缺失的综合征， 例如视网膜色素变性 ( 色素性视网膜炎 ) 和遗传 性视神经萎缩 ( 勒伯尔 (Leber’ s) 病 )。
通常， HDAC 抑制剂一般分为 5 类 ： 1) 异羟肟酸衍生物 ； 2) 短链脂肪酸 (SCFAs) ； 3) 环四肽 ； 4) 苯甲酰胺和 5) 亲电性酮。
因此， 本发明在其广义范围内包括含 HDAC 抑制剂和 / 或能抑制组蛋白脱乙酰酶的 任何其它类化合物的组合物， HDAC 抑制剂是 1) 异羟肟酸衍生物 ； 2) 短链脂肪酸 (SCFAs) ； 3) 环四肽 ； 4) 苯甲酰胺 ； 5) 亲电性酮 ； 用于抑制组蛋白脱乙酰酶， 诱导瘤细胞终末分化、 细 胞生长停止和 / 或凋亡， 和 / 或诱导肿瘤瘤细胞分化、 细胞生长停止和 / 或凋亡。
此类 HDAC 抑制剂的非限定性实例列举如下。应理解本发明包括本文中所述 HDAC 抑制剂的任何盐、 晶体结构、 无定形结构、 水合物、 衍生物、 代谢物、 立体异构体、 结构异构体 和前药。
A. 异羟肟酸衍生物， 例如辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA)(Richon 等， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 95,3003-3007(1998)) ； 间 羧 基 肉 桂 酸 二 羟 酰 胺 (CBHA)(Richon 等， 同 上)； pyroxamide ； 曲 古 抑 菌 素 类 似 物 例 如 曲 古 抑 菌 素 A(TSA) 和 曲 古 抑 菌 素 C(Koghe
等 1998.Biochem.Pharmacol.56 ： 1359-1364) ； 水 杨 酰 基 二 异 羟 肟 酸 (Andrews 等， International J.Parasitology 30， 761-768(2000)) ； 辛二酰二异羟肟酸 (SBHA)( 美国专 利号 5,608,108) ； 壬二异羟肟酸 (ABHA)(Andrews 等， 同上 ) ； 壬二酸 -1- 异羟肟酸酯 -9- 酰 苯 胺 (AAHA)(Qiu 等， Mol.Biol.Cell11， 2069-2083(2000)) ； 6-(3- 氯 苯 基 脲 基 ) 己 异 羟 肟 酸 (3Cl-UCHA) ； oxamflatin[(2E)-5-[3-[( 苯 磺 酰 基 ) 氨 基 苯 基 ]- 戊 -2- 烯 -4- 炔 酰 异 羟 肟 酸 (ynohydroxamic acid)](Kim 等 Oncogene， 18 ： 24612470(1999)) ； A-161906、 Scriptaid(Su 等 2000Cancer Research， 60 ： 3137-3142) ； PXD-101(Prolifix) ； LAQ-824 ； CHAP ； MW2796(Andrews 等， 同上 ) ； MW2996(Andrews 等， 同上 ) ； 或美国专利号 5,369,108、 5,932,616、 5,700,811、 6,087,367 和 6,511,990 中公开的任何异羟肟酸。
B. 环 四 肽， 例 如 trapoxin A (TPX)- 环 四 肽 ( 环 -(L- 苯 丙 氨 酰 基 -L- 苯 丙 氨 酰 基 -D-(2- 甲 基 ) 哌 啶 基 -L-2- 氨 基 -8- 氧 代 -9， 10- 表 氧 癸 酰 基 ))(Kijima 等， J Biol.Chem.268， 22429-22435(1993)) ； FR901228(FK228， 酯 肽 )(Nakajima 等， Ex.Cell Res.241， 126-133(1998)) ； FR225497 环 四 肽 (H.Mori 等， PCT 申 请 WO 00/08048(2000 年 2 月 17 日 )) ； apicidin 环四肽 [ 环 (N-O- 甲基 -L- 色氨酰基 -L- 异亮氨酰基 -D-(2- 甲 基 ) 哌 啶 基 -L-2- 氨 基 -8- 氧 代 癸 酰 基 )](Darkin-Rattray 等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93,1314313147(1996)) ； apicidin Ia、 apicidin Ib、 apicidin Ic、 apicidinIIa 和 apicidin IIb(P.Dulski 等， PCT 申 请 WO 97/11366) ； CHAP、 HC- 毒 素 环 四 肽 (Bosch 等， Plant Cell 7， 1941-1950(1995)) ； WF27082 环 四 肽 (PCT 申 请 WO 98/48825) ；和 chlamydocin(Bosch 等， 同上 )。 C. 短 链 脂 肪 酸 (SCFA) 衍 生 物， 例 如 丁 酸 钠 (Cousens 等， J.Biol.Chem.254， 1716-1723(1979)) ； 异戊酸盐 ( 酯 )(McBain 等， Biochem.Pharm.53 ： 1357-1368(1997)) ； 戊 酸盐 ( 酯 )(McBain 等， 同上 ) ； 4- 苯基丁酸盐 ( 酯 )(4-PBA)(Lea 和 Tulsyan， Anticancer Research， 15， 879-873(1995)) ； 苯 基 丁 酸 盐 ( 酯 )(PB)(Wang 等， Cancer Research， 59， 2766-2799(1999)) ； 丙酸盐 ( 酯 )(McBain 等， 同上 ) ； 丁酰胺 (Lea 和 Tulsyan， 同上 ) ； 异丁 酰胺 (Lea 和 Tulsyan， 同上 ) ； 苯基乙酸盐 ( 酯 )(Lea 和 Tulsyan， 同上 ) ； 3- 溴丙酸盐 ( 酯 ) (Lea 和 Tulsyan， 同上 ) ； 三丁精 (Guan 等， Cancer Research， 60， 749-755(2000)) ； 丙戊酸、 TM 丙戊酸盐 ( 酯 ) 和 Pivanex 。
D. 苯 甲 酰 胺 衍 生 物，例 如 CI-994 ； MS-275[N-(2- 氨 基 苯 基 )-4-[N-( 吡 啶 -3- 基 甲 氧 基 羰 基 ) 氨 基 甲 基 ] 苯 甲 酰 胺 ](Saito 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,4592-4597(1999)) ； 和 MS-275 的 3′ - 氨基衍生物 (Saito 等， 同上 )。
E. 亲电性酮衍生物， 例如三氟甲基酮 (Frey 等， Bioorganic & Med.Chem.Lett. (2002)， 12， 3443-3447 ； U.S.6,511,990) 和 α- 酮酰胺例如 N- 甲基 -α- 酮酰胺。
F. 其它 HDAC 抑制剂， 例如天然产物、 psammaplins 和 Depudecin(Kwon 等 1998. PNAS 95 ： 3356-3361)。
优选的基于异羟肟酸的 HDAC 抑制剂是辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA)、 间羧基肉桂 酸二羟酰胺 (CBHA) 和 pyroxamide。 SAHA 表明直接结合在组蛋白脱乙酰酶的催化袋中。 SAHA 诱导培养基中转化细胞细胞周期停止、 分化和 / 或凋亡， 且抑制啮齿动物肿瘤生长。SAHA 在实体瘤和血癌中有效诱导这些作用。SAHA 表明有效抑制动物中的肿瘤生长， 且对动物无 毒性。SAHA 诱导抑制肿瘤生长与乙酰化组蛋白在肿瘤中蓄积有关。SAHA 有效抑制致癌物
(N- 甲基亚硝基脲 ) 诱导的大鼠中乳房瘤的发展和继续生长。 在 130 天的研究中， 给予大鼠 含 SAHA 的饲料。因此， SAHA 是无毒、 口服活性抗肿瘤药， 其作用机理涉及抑制组蛋白脱乙 酰酶活性。
优选的 HDAC 抑制剂是在授予某些本发明人的美国专利号 5,369,108、 5,932,616、 5,700,811、 6,087,367 和 6,511,990 中公开的那些化合物， 其全部内容通过引用结合到本 文中， 其非限定性实例阐述如下 ：
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 1 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R1 和 R2 可以相同或不同 ； 当 R1 和 R2 相同时， 各自为取代或未取代的芳基氨 基、 环烷基氨基、 吡啶氨基、 哌啶子基、 9- 嘌呤 -6- 胺或噻唑氨基 ； 当 R1 和 R2 不同时， R1 ＝ R3-N-R4， 其中 R3 和 R4 各自独立， 彼此相同或不同， 并为氢原子、 羟基、 取代或未取代的支链或 非支链烷基、 烯基、 环烷基、 芳基烷氧基、 芳氧基、 芳基烷氧基或吡啶基， 或 R3 和 R4 结合在一 起形成哌啶基， R2 为羟氨基、 羟基、 氨基、 烷基氨基、 二烷基氨基或烷氧基， 且 n 为约 4 至约 8 的整数。
在式 1 的具体实施方案中， R1 和 R2 相同， 为取代或未取代的噻唑氨基 ； 且 n 为约 4 至约 8 的整数。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 2 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R3 和 R4 各自独立， 彼此相同或不同， 并为氢原子、 羟基、 取代或未取代支链或 非支链的烷基、 烯基、 环烷基、 芳基烷氧基、 芳氧基、 芳基烷氧基或吡啶基， 或 R3 和 R4 结合在 一起形成哌啶基， R2 为羟氨基、 羟基、 氨基、 烷基氨基、 二烷基氨基或烷氧基， 且 n 为约 4 至约 8 的整数。
在式 2 的一个具体实施方案中， R3 和 R4 各自独立， 彼此相同或不同， 并为氢原子、 羟基、 取代或未取代支链或非支链的烷基、 烯基、 环烷基、 芳基、 烷氧基、 芳氧基、 芳基烷氧基 或吡啶基， 或 R3 和 R4 结合在一起形成哌啶基 ； R2 为羟氨基、 羟基、 氨基、 烷基氨基或烷氧基 ； n 为 5-7 的整数 ； R3-N-R4 和 R2 不同。
在式 2 的另一个具体实施方案中， n 为 6。 在式 2 的还另一个实施方案中， R4 为氢原 子， R3 为取代或未取代的苯基， 且 n 为 6。在式 2 的还另一个实施方案中， R4 为氢原子， R3 为
取代的苯基， 且 n 为 6， 其中苯基的取代基选自甲基、 氰基、 硝基、 三氟甲基、 氨基、 氨基羰基、 甲基氰基、 氯、 氟、 溴、 碘、 2， 3- 二氟基、 2， 4- 二氟基、 2， 5- 二氟基、 3， 4- 二氟基、 3， 5- 二氟基、 2， 6- 二氟基、 1， 2， 3- 三氟基、 2， 3， 6- 三氟基、 2， 4， 6- 三氟基、 3， 4， 5- 三氟基、 2， 3， 5， 6- 四氟 基、 2， 3， 4， 5， 6- 五氟基、 叠氮基、 己基、 叔丁基、 苯基、 羧基、 羟基、 甲氧基、 苯氧基、 苄氧基、 苯 氨基氧基、 苯基氨基羰基、 甲氧基羰基、 甲基氨基羰基、 二甲氨基、 二甲氨基羰基或羟氨基羰 基。
在式 2 的另一个实施方案中， n 为 6， R4 为氢原子， 且 R3 为环己基。在式 2 的另一 个实施方案中， n 为 6， R4 为氢原子， 且 R3 为甲氧基。在式 2 的另一个实施方案中， n 为 6， 且 R3 和 R4 结合在一起形成哌啶基。在式 2 的另一个实施方案中， n 为 6， R4 为氢原子， 且 R3 为 苄氧基。在式 2 的另一个实施方案中， R4 为氢原子， 且 R3 为 γ- 吡啶基。在式 2 的另一个 实施方案中， R4 为氢原子， 且 R3 为 β- 吡啶基。在式 2 的另一个实施方案中， R4 为氢原子， 且 R3 为 α- 吡啶基。在式 2 的另一个实施方案中， n 为 6， 且 R3 和 R4 都为甲基。在式 2 的 另一个实施方案中， n 为 6， R4 为甲基， 且 R3 为苯基。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 3 结构代表的 HDAC 抑制剂或其药学上可 接受的盐或水合物， 和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 n 为 5 至约 8 的整数。
在式 3 的优选实施方案中， n 为 6。按照该实施方案， HDAC 抑制剂为 SAHA(4) 或其 药学上可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。SAHA 可由以下结构式代表 ：
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 5 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。在 一 个 实 施 方 案 中， 本 发 明 方 法 使 用 由 式 6 结 构 代 表 的 HDAC 抑 制 剂 (pyroxamide)， 或其药学上可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 7 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 8 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 9 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 10 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R3 为氢， 且 R4 为环烷基、 芳基、 芳氧基、 芳基烷氧基或吡啶基， 或 R3 和 R4 结合 在一起形成哌啶基 ； R2 为羟氨基 ； 且 n 为 5 至约 8 的整数。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 11 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R3 和 R4 独立为取代或未取代的以下基团 ： 支链或非支链的烷基、 烯基、 环烷 基、 芳基、 烷氧基、 芳氧基、 芳基烷氧基或吡啶基 ； 环烷基、 芳基、 芳氧基、 芳基烷氧基或吡啶 基， 或 R3 和 R4 结合在一起形成哌啶基 ； R2 为羟氨基 ； 且 n 为 5 至约 8 的整数。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 12 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 X 和 Y 各自独立， 彼此相同或不同， 并为羟基、 氨基或羟氨基、 取代或未取代的 烷氧基、 烷基氨基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基、 烷氧基氨基、 芳氧基氨基、 烷氧基 烷基氨基或芳氧基烷基氨基 ； R 为氢原子、 羟基、 基团、 取代或未取代的烷基、 芳基烷氧基或 芳氧基 ； m 和 n 各自独立， 彼此相同或不同， 各自为约 0 至约 8 的整数。
在一个具体的实施方案中， HDAC 抑制剂为式 12 化合物， 其中 X、 Y 和 R 各自为羟基， 且 m 和 n 均为 5。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 13 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 X 和 Y 各自独立， 彼此相同或不同， 并为羟基、 氨基或羟氨基、 取代或未取代的 烷氧基、 烷基氨基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基、 烷氧基氨基、 芳氧基氨基、 烷氧基 烷基氨基或芳氧基烷基氨基 ； R1 和 R2 各自独立， 彼此相同或不同， 为氢原子、 羟基、 取代或未 取代的烷基、 芳基、 烷氧基或芳氧基 ； m、 n 和 o 各自独立， 彼此相同或不同， 各自为约 0 至约 8 的整数。
在式 13 的一个具体实施方案中， X 和 Y 各自为羟基， 且 R1 和 R2 各自为甲基。在式 13 的另一个具体实施方案中， X 和 Y 各自为羟基， R1 和 R2 各自为甲基， n 和 o 各自为 6， 且m 为 2。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 14 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 X 和 Y 各自独立， 彼此相同或不同， 为羟基、 氨基或羟氨基、 取代或未取代的烷 氧基、 烷基氨基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基、 烷氧基氨基、 芳氧基氨基、 烷氧基烷 基氨基或芳氧基烷基氨基 ； R1 和 R2 各自独立， 彼此相同或不同， 为氢原子、 羟基、 取代或未取 代的烷基、 芳基、 烷氧基或芳氧基 ； m 和 n 各自独立， 彼此相同或不同， 各自为约 0 至约 8 的 整数。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 15 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 X 和 Y 各自独立， 彼此相同或不同， 为羟基、 氨基或羟氨基、 取代或未取代的烷 氧基、 烷基氨基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基、 烷氧基氨基、 芳氧基氨基、 烷氧基烷 基氨基或芳氧基烷基氨基 ； m 和 n 各自独立， 彼此相同或不同， 各自为约 0 至约 8 的整数。
在式 15 的一个具体实施方案中， X 和 Y 各自为羟基， 且 m 和 n 各自为 5。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 16 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 X 和 Y 各自独立， 彼此相同或不同， 为羟基、 氨基或羟氨基、 取代或未取代的烷 氧基、 烷基氨基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基、 烷氧基氨基、 芳氧基氨基、 烷氧基烷 基氨基或芳氧基烷基氨基 ； R1 和 R2 彼此独立， 相同或不同， 并为氢原子、 羟基、 取代或未取代 的烷基、 芳基烷氧基或芳氧基 ； m 和 n 各自独立， 彼此相同或不同， 各自为约 0 至约 8 的整数。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 17 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 X 和 Y 各自独立， 彼此相同或不同， 为羟基、 氨基或羟氨基、 取代或未取代的烷 氧基、 烷基氨基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基或芳氧基烷基氨基 ； 且 n 为约 0 至约 8 的整数。
在式 17 的一个具体实施方案中， X 和 Y 各自为羟氨基 ； R1 为甲基， R2 为氢原子 ； m 和 n 各自为 2。在式 17 的另一个具体实施方案中， X 和 Y 各自为羟氨基 ； R1 为羰基羟基氨 基， R2 为氢原子 ； m 和 n 各自为 5。在式 17 的另一个具体实施方案中， X 和 Y 各自为羟氨基 ； R1 和 R2 各自为氟基 ； m 和 n 各自为 2。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 18 结构代表的用 DAC 抑制剂， 或其药学 上可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 X 和 Y 各自独立， 彼此相同或不同， 为羟基、 氨基或羟氨基、 取代或未取代的烷 氧基、 烷基氨基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基、 烷氧基氨基、 芳氧基氨基、 烷氧基烷 基氨基或芳氧基烷基氨基 ； R1 和 R2 各自独立， 彼此相同或不同， 为氢原子、 羟基、 取代或未取 代的烷基、 芳基、 烷氧基、 芳氧基、 羰基羟基氨基或氟基 ； m 和 n 各自独立， 彼此相同或不同， 各自为约 0 至约 8 的整数。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 19 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R1 和 R2 各自独立， 彼此相同或不同， 为羟基、 烷氧基、 氨基、 羟基氨基、 烷基氨 基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基、 烷氧基氨基、 芳氧基氨基、 烷氧基烷基氨基或芳 氧基烷基氨基。在具体的实施方案中， HDAC 抑制剂为结构式 19 化合物， 其中 R1 和 R2 都为 羟氨基。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 20 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R1 和 R2 各自独立， 彼此相同或不同， 为羟基、 烷氧基、 氨基、 羟基氨基、 烷基氨 基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基、 烷氧基氨基、 芳氧基氨基、 烷氧基烷基氨基或芳 氧基烷基氨基。在具体的实施方案中， HDAC 抑制剂为结构式 20 化合物， 其中 R1 和 R2 都为 羟氨基。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 21 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R1 和 R2 各自独立， 彼此相同或不同， 为羟基、 烷氧基、 氨基、 羟基氨基、 烷基氨 基、 二烷基氨基、 芳基氨基、 烷基芳基氨基、 烷氧基氨基、 芳氧基氨基、 烷氧基烷基氨基或芳 氧基烷基氨基。
在具体的实施方案中， HDAC 抑制剂为结构式 21 化合物， 其中 R1 和 R2 都为羟氨基。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 22 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R 为被以下基团取代的苯氨基 ： 氰基、 甲基氰基、 硝基、 羧基、 氨基羰基、 甲基 氨基羰基、 二甲氨基羰基、 三氟甲基、 羟基氨基羰基、 N- 羟氨基羰基、 甲氧基羰基、 氯、 氟、 甲 基、 甲氧基、 2， 3- 二氟基、 2， 4- 二氟基、 2， 5- 二氟基、 2， 6- 二氟基、 3， 5- 二氟基、 2， 3， 6- 三氟 基、 2， 4， 6- 三氟基、 1， 2， 3- 三氟基、 3， 4， 5- 三氟基、 2， 3， 4， 5- 四氟基或 2， 3， 4， 5， 6- 五氟基 ； 且 n 为 4-8 的整数。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 23 结构代表的 HDAC 抑制剂 ( 间羧基肉 桂酸二羟酰胺 -CBHA)， 或其药学上可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 24 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方案中， 本发明方法使用式 25 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上可 接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R 为以下取代或未取代的基团 ： 苯基、 哌啶、 噻唑、 2- 吡啶、 3- 吡啶或 4- 吡啶， 且 n 为约 4 至约 8 的整数。
在式 25 的一个具体实施方案中， R 为取代的苯基。 在式 25 的另一个具体实施方案 中， R 为取代的苯基， 其中取代基选自甲基、 氰基、 硝基、 硫基 (thio)、 三氟甲基、 氨基、 氨基 羰基、 甲基氰基、 氯、 氟、 溴、 碘、 2， 3- 二氟基、 2， 4- 二氟基、 2， 5- 二氟基、 3， 4- 二氟基、 3， 5- 二 氟基、 2， 6- 二氟基、 1， 2， 3- 三氟基、 2， 3， 6- 三氟基、 2， 4， 6- 三氟基、 3， 4， 5- 三氟基、 2， 3， 5，
6- 四氟基、 2， 3， 4， 5， 6- 五氟基、 叠氮基、 己基、 叔丁基、 苯基、 羧基、 羟基、 甲氧基、 苯氧基、 苄 氧基、 苯氨基氧基、 苯基氨基羰基、 甲氧基羰基、 甲基氨基羰基、 二甲氨基、 二甲氨基羰基或 羟氨基羰基。
在式 25 的另一个具体实施方案中， R 为取代或未取代的 2- 吡啶、 3- 吡啶或 4- 吡 啶的基团， 且 n 为约 4 至约 8 的整数。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 26 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R 为取代或未取代的苯基、 吡啶、 哌啶或噻唑基团， 且 n 为约 4 至约 8 的整数， 或其药学上可接受的盐。
在式 26 的一个具体实施方案中， R 为取代的苯基。在式 26 的另一个具体实施方 案中， R 为取代的苯基， 其中取代基选自甲基、 氰基、 硝基、 硫基、 三氟甲基、 氨基、 氨基羰基、 甲基氰基、 氯、 氟、 溴、 碘、 2， 3- 二氟基、 2， 4- 二氟基、 2， 5- 二氟基、 3， 4- 二氟基、 3， 5- 二氟基、 2， 6- 二氟基、 1， 2， 3- 三氟基、 2， 3， 6- 三氟基、 2， 4， 6- 三氟基、 3， 4， 5- 三氟基、 2， 3， 5， 6- 四氟 基、 2， 3， 4， 5， 6- 五氟基、 叠氮基、 己基、 叔丁基、 苯基、 羧基、 羟基、 甲氧基、 苯氧基、 苄氧基、 苯 基氨基氧基、 苯基氨基羰基、 甲氧基羰基、 甲基氨基羰基、 二甲氨基、 二甲氨基羰基或羟氨基 羰基。
在式 26 的另一个具体实施方案中， R 为苯基， 且 n 为 5。在另一个实施方案中， n 为 5， 且 R 为 3- 氯苯基。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 27 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R1 和 R2 各自直接连接或通过连接基团连接， 而且为取代或未取代的下列基 团： 芳基 ( 例如苯基 )、 芳基烷基 ( 例如苄基 )、 萘基、 环烷基、 环烷基氨基、 吡啶氨基、 哌啶 子基、 9- 嘌呤 -6- 氨基、 噻唑氨基、 羟基、 支链或非支链的烷基、 烯基、 烷氧基、 芳氧基、 芳 基烷氧基、 吡啶基或喹啉基或异喹啉基 ； n 为约 3 至约 10 的整数， 且 R3 为异羟肟酸、 羟氨 基、 羟基、 氨基、 烷基氨基或烷氧基的基团。连接基团例如可以为酰胺部分、 O-、 -S-、 -NH-、 NR5、 -CH2-、 (CH2)m-、 -(CH ＝ CH)-、 亚苯基、 亚环烷基或其任何组合， 其中 R5 为取代或未取代 的 C1-C5 烷基。
在式 27 的某些实施方案中， R1 为 -NH-R4， 其中 R4 为取代或未取代的下列基团 ： 芳 基 ( 例如苯基 )、 芳基烷基 ( 例如苄基 )、 萘基、 环烷基、 环烷基氨基、 吡啶氨基、 哌啶子基、
9- 嘌呤 -6- 氨基、 噻唑氨基、 羟基、 支链或非支链的烷基、 烯基、 烷氧基、 芳氧基、 芳基烷氧 基、 吡啶基、 喹啉基或异喹啉基。
在一个实施方案中， 本发明方法使用由式 28 结构代表的 HDAC 抑制剂， 或其药学上 可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
其中 R1 和 R2 各自为取代或未取代的下列基团 ： 芳基 ( 例如苯基 )、 芳基烷基 ( 例如 苄基 )、 萘基、 环烷基、 环烷基氨基、 吡啶氨基、 哌啶子基、 9- 嘌呤 -6- 氨基、 噻唑氨基、 羟基、 支链或非支链的烷基、 烯基、 烷氧基、 芳氧基、 芳基烷氧基、 吡啶基、 喹啉基或异喹啉基 ； R3 为 异羟肟酸、 羟氨基、 羟基、 氨基、 烷基氨基或烷氧基的基团 ； R4 为氢、 卤素、 苯基或环烷基部 分； A 可以相同或不同， 代表酰胺部分、 O-、 -S-、 -NH-、 NR5、 -CH2-、 -(CH2)m-、 -(CH ＝ CH)-、 亚 苯基、 亚环烷基或其任何组合， 其中 R5 为取代或未取代的 C1-C5 烷基 ； 且 n 和 m 各自为 3-10 的整数。
在再一个具体实施方案中， 在化合物 27 或 28 范围内具有更特殊结构的化合物 有：
在一个实施方案中， 用于本发明方法的 HDAC 抑制剂由式 29 结构代表 ：
其中 A 为酰胺部分， R1 和 R2 各自选自取代或未取代的芳基 ( 例如苯基 )、 芳基烷基 ( 例如苄基 )、 萘基、 吡啶氨基、 9- 嘌呤 -6- 氨基、 噻唑氨基、 芳氧基、 芳基烷氧基、 吡啶基、 喹 啉基或异喹啉基 ； 且 n 为 3-10 的整数。
例如， 式 29 化合物可具有结构 30 或 31 ：
其中 R1、 R2 和 n 具有式 29 的含义。 在一个实施方案中， 用于本发明方法的 HDAC 抑制剂由式 32 结构代表 ：其中 R7 选自取代或未取代的芳基 ( 例如苯基 )、 芳基烷基 ( 例如苄基 )、 萘基、 吡 啶氨基、 9- 嘌呤 -6- 氨基、 噻唑氨基、 芳氧基、 芳基烷氧基、 吡啶基、 喹啉基或异喹啉基 ； n为 3-10 的整数， 且 Y 选自 ：
在一个实施方案中， 用于本发明方法的 HDAC 抑制剂由式 33 结构代表 ：
其中 n 为 3-10 的整数， Y 选自
且 R7′选自
在一个实施方案中， 用于本发明方法的 HDAC 抑制剂由式 34 结构代表 ：芳基 ( 例如苯基 )、 芳基烷基 ( 例如苄基 )、 萘基、 吡啶氨基、 9- 嘌呤 -6- 氨基、 噻唑 氨基、 芳氧基、 芳基烷氧基、 吡啶基、 喹啉基或异喹啉基 ； n 为 3-10 的整数， 且 R7′选自
在一个实施方案中， 用于本发明方法的 HDAC 抑制剂由式 35 结构代表 ：其中 A 为酰胺部分， R1 和 R2 各自选自取代或未取代的芳基 ( 例如苯基 )、 芳基烷基 ( 例如苄基 )、 萘基、 吡啶氨基、 9- 嘌呤 -6- 氨基、 噻唑氨基、 芳氧基、 芳基烷氧基、 吡啶基、 喹 啉基或异喹啉基 ； R4 为氢、 卤素、 苯基或环烷基部分， 且 n 为 3-10 的整数。
例如， 式 35 化合物可具有结构 36 或 37 ：
其中 R1、 R2、 R4 和 n 具有式 35 的含义。 在一个实施方案中， 用于本发明方法的 HDAC 抑制剂由式 38 结构代表 ：
其中 L 为选自以下的连接基团 ： 酰胺部分、 O-、 -S-、 -NH-、 NR5、 -CH2-、 -(CH2)m-、 -(CH ＝ CH)-、 亚苯基、 亚环烷基或其任何组合， 其中 R5 为取代或未取代的 C1-C5 烷基 ； 和其中 R7 和 R8 各自独立为取代或未取代的芳基 ( 例如苯基 )、 芳基烷基 ( 例如苄基 )、 萘基、 吡啶氨 基、 9- 嘌呤 -6- 氨基、 噻唑氨基、 芳氧基、 芳基烷氧基、 吡啶基、 喹啉基或异喹啉基 ； n 为 3-10 的整数， 且 m 为 0-10 的整数。
例如， 式 38 化合物可由式 (39) 结构代表 ：
适用于本发明方法的其它 HDAC 抑制剂包括以下更具体式中所示的那些抑制剂 ： 结构 (40) 代表的化合物或其对映体 ：
其中 n 为 3-10 的整数。在式 40 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (41) 代表的化合物或其对映体 ：
其中 n 为 3-10 的整数。在式 41 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (42) 代表的化合物或其对映体 ：
其中 n 为 3-10 的整数。在式 42 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (43) 代表的化合物或其对映体 ：
其中 n 为 3-10 的整数。在式 43 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (44) 代表的化合物或其对映体 ：
其中 n 为 3-1， 0 的整数。在式 44 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。结构 (45) 代表的化合物或其对映体 ：
其中 n 为 3-10 的整数。在式 45 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (46) 代表的化合物或其对映体 ：
其中 n 为 3-10 的整数。在式 46 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (47) 代表的化合物或其对映体 ：其中 n 为 3-10 的整数。在式 47 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (48) 代表的化合物或其对映体 ：
其中 n 为 3-10 的整数。在式 48 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (49) 代表的化合物或其对映体 ：
其中 n 为 3-10 的整数。在式 49 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (50) 代表的化合物或其对映体 ：其中 n 为 3-10 的整数。在式 50 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。 结构 (51) 代表的化合物或其对映体 ：其中 n 为 3-10 的整数。在式 51 的一个具体实施方案中， n ＝ 5。
此类化合物和其它 HDAC 抑制剂的其它实例可在以下文献中发现 ： 全部授予 Breslow 等的 1994 年 11 月 29 日颁发的美国专利号 5,369,108、 1997 年 12 月 23 日颁发 的美国专利号 5,700,811、 1998 年 6 月 30 日颁发的美国专利号 5,773,474、 1999 年 8 月 3 日颁发的美国专利号 5,932,616 和 2003 年 1 月 28 日颁发的美国专利号 6,511,990 ； 全部 授予 Marks 等的 1991 年 10 月 8 日颁发的美国专利号 5,055,608、 1992 年 12 月 29 日颁发 的美国专利号 5,175,191 和 1997 年 3 月 4 日颁发的美国专利号 5,608,108 ； 和 Yoshida， M. 等， Bioassays 17， 423-430(1995) ； Saito， A. 等， PNAS USA 96,4592-4597， (1999) ；
Furamai R. 等， PNAS USA 98(1)， 87-92(2001) ； Komatsu， Y. 等， Cancer Res.61(11)， 4459-4466(2001) ； Su， G.H. 等， Cancer Res.60， 3137-3142(2000) ； Lee， B.I. 等， Cancer Res.61(3)， 931-934 ； Suzuki， T. 等， J.Med.Chem.42(15)， 3001-3003(1999) ； 2001 年 3 月 15 日公布的 Sloan-Kettering Institute for Cancer Research and The Trustees of Columbia University 的 PCT 申 请 WO 01/18171 ； 公 布 的 Hoffmann-La Roche 的 PCT 申 请 WO 02/246144 ； 公布的 Novartis 的 PCT 申请 WO 02/22577 ； 公布的 Prolifix 的 PCT 申 请 WO 02/30879 ； 公布的 Methylgene， Inc. 的 PCT 申请 WO 01/38322(2001 年 5 月 31 日公 布 )、 WO 01/70675(2001 年 9 月 27 日公布 ) 和 WO 00/71703(2000 年 11 月 30 日公布 ) ； Fujisawa Pharmaceutical Co.， Ltd. 的 1999 年 10 月 8 日公布的 PCT 申请 WO 00/21979 ； Beacon Laboratories， L.L.C. 的 1998 年 3 月 11 日公布的 PCT 申请 WO98/40080 ； 和 Curtin M.(Current patent status of HDAC inhibitors(HDAC 抑制剂目前的专利状态 )Expert Opin.Ther.Patents(2002)12(9) ： 1375-1384 和其中引用的参考文献 )。
可 按 照 实 验 部 分 描 述 的 方 法， 或 按 照 美 国 专 利 号 5,369,108、 5,700,811、 5,932,616 和 6,511,990 中阐述的方法 ( 这些专利的内容通过引用整体结合到本文中 )， 或 按照本领域技术人员已知的任何其它方法合成 SAHA 或任何其它 HDACs。
HDAC 抑制剂的具体非限定性实例在下表中提供。应当注意， 本发明包括与以下所 代表化合物结构相似的任何化合物， 且它们能抑制组蛋白脱乙酰酶。
化学定义
“脂族基团” 为非芳族基团， 仅由碳和氢组成， 可任选含有一个或多个不饱和单位， 例如双键和 / 或三键。脂族基团可以为直链、 支链或环。当为直链或支链时， 脂族基团通常 含约 1 至约 12 个碳原子， 更通常含约 1 至约 6 个碳原子。当为环时， 脂族基团通常含约 3 至约 10 个碳原子， 更通常含约 3 至约 7 个碳原子。优选脂族基团为 C1-C12 直链或支链烷基 ( 即完全饱和脂族基团 )， 更优选 C1-C6 直链或支链烷基。实例包括甲基、 乙基、 正丙基、 异丙 基、 正丁基、 仲丁基和叔丁基。
本文中使用的 “芳族基团” ( 又称为 “芳基” ) 包括本文中定义的碳环芳基、 杂环芳 基 ( 又称为 “杂芳基” ) 和稠合的多环芳环系统。
“碳环芳基” 为 5-14 个碳原子的芳环， 包括与 5 元或 6 元环烷基例如茚满稠合的碳 环芳基。碳环芳基的实例包括但不限于苯基、 萘基例如 1- 萘基和 2- 萘基 ； 蒽基例如 1- 蒽 基、 2- 蒽基 ； 菲基 ； 芴酮基例如 9- 芴酮基、 茚满基等。任选碳环芳基被指定数目的下述取代 基取代。
“杂环芳基” (或 “杂芳基” ) 为 5-14 个环碳原子和 1-4 个选自 O、 N 或 S 的杂原子的 单环、 双环或三环芳环。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基例如 2- 吡啶基 ( 又称为 α- 吡 啶基 )、 3- 吡啶基 ( 又称为 β- 吡啶基 ) 和 4- 吡啶基 ( 又称为 γ- 吡啶基 ) ； 噻吩基例如 2- 噻吩基和 3- 噻吩基 ； 呋喃基例如 2- 呋喃基和 3- 呋喃基 ； 嘧啶基例如 2- 嘧啶基和 4- 嘧
啶基 ； 咪唑基例如 2- 咪唑基 ； 吡喃基例如 2- 吡喃基和 3- 吡喃基 ； 吡唑基例如 4- 吡唑基和 5- 吡唑基 ； 噻唑基例如 2- 噻唑基、 4- 噻唑基和 5- 噻唑基 ； 噻二唑基 ； 异噻唑基 ； 唑基例 如 2唑基、 4唑基和 5唑基 ； 异 唑基 ； 吡咯基 ； 哒嗪基 ； 吡嗪基等。可任选以上 定义的杂环芳基 ( 或杂芳基 ) 被指定数目的下述芳基的取代基取代。
“稠合多环芳族” 环系统为与一个或多个其它杂芳基或非芳族杂环稠合的碳环芳 基或杂芳基。实例包括喹啉基和异喹啉基， 例如 2- 喹啉基、 3- 喹啉基、 4- 喹啉基、 5- 喹啉 基、 6- 喹啉基、 7- 喹啉基和 8- 喹啉基、 1- 异喹啉基、 3- 喹啉基、 4- 异喹啉基、 5- 异喹啉基、 6- 异喹啉基、 7- 异喹啉基和 8- 异喹啉基 ； 苯并呋喃基例如 2- 苯并呋喃基和 3- 苯并呋喃 基； 二苯并呋喃基， 例如 2， 3- 二氢苯并呋喃基 ； 二苯并噻吩基 ； 苯并噻吩基， 例如 2- 苯并噻 吩基和 3- 苯并噻吩基 ； 吲哚基， 例如 2- 吲哚基和 3- 吲哚基 ； 苯并噻唑基例如 2- 苯并噻唑 基； 苯并 唑基例如 2- 苯并 唑基 ； 苯并咪唑基例如 2- 苯并咪唑基 ； 异吲哚基例如 1- 异 吲哚基和 3- 异吲哚基 ； 苯并三唑基 ； 嘌呤基 ； 硫茚基等。可任选稠合的多环芳环系统被指 定数目的本文中所述的取代基取代。
“芳烷基” ( 芳基烷基 ) 为被芳基优选苯基取代的烷基。优选的芳烷基为苄基。本 文描述了合适的芳基和合适的烷基。本文描述了芳烷基的合适取代基。
“芳氧基” 为通过氧与化合物连接的芳基 ( 例如苯氧基 )。
本文中使用的 “烷氧基” ( 烷基氧基 ) 为通过氧原子与化合物连接的直链或支链 C1-C12 烷基或环状 C3-C12 烷基。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、 乙氧基和丙氧基。
“芳基烷氧基” ( 芳基烷基氧基 ) 为通过芳基烷基的烷基部分上的氧与化合物连接 的芳基烷基 ( 例如苯基甲氧基 )。
本文中使用的 “芳基氨基” 为通过氮与化合物连接的芳基。
本文中使用的 “芳基烷基氨基” 为通过芳基烷基的烷基部分上的氮与化合物连接 的芳基烷基。
本文中使用的许多部分或基团被称为 “取代或未取代” 。当部分被称为取代时， 它 表示本领域技术人员已知的该部分可被取代的任何部分可被取代。例如， 可取代的基团可 以为被不为氢的基团 ( 即取代基 ) 置换的氢原子。可存在多个取代基。当存在多个取代基 时， 取代基可以相同或不同， 可在任何可取代的位置发生取代。 在本领域中熟知此类取代方 式。为例证目的 ( 无意限定本发明范围 )， 为取代基的某些基团实例有 ： 烷基 ( 其也可被一 个或多个取代基取代， 例如 CF3)、 烷氧基 ( 其可被取代， 例如 OCF3)、 卤素或卤基 (F、 Cl、 Br、 I)、 羟基、 硝基、 氧代基、 -CN、 -COH、 -COOH、 氨基、 叠氮基、 N- 烷基氨基或 N， N- 二烷基氨基 ( 其 中烷基也可被取代 )、 酯基 (-C(O)-OR， 其中 R 可以为例如烷基、 芳基等基团， 其可被取代 )、 芳基 ( 最优选苯基， 它可被取代 )、 芳基烷基 ( 它可被取代 ) 和芳氧基。
立体化学
许多有机化合物存在具有使平面偏振光的平面旋转能力的旋光形式。 在描述旋光 性化合物时， 用前缀 D 和 L 或 R 和 S 表示关于其手性中心的分子绝对构型。用前缀 d 和 l 或 (+) 和 (-) 代表化合物使平面偏振光旋转的符号， 用 (-) 或表示该化合物是左旋的。具 有前缀 (+) 或 d 的化合物是右旋的。对于确定的化学结构， 除它们是彼此的非叠加镜像之 外， 被称作立体异构体的这些化合物是相同的。 一种特殊的立体异构体又可称为对映体， 此 类异构体的混合物通常称为对映体混合物。50 ∶ 50 的对映体混合物称为外消旋混合物。本文中所述的多种化合物可具有一个或多个手性中心， 因此可存在不同的对映体。如果需 要可用星号 (*) 表示手性碳。当在本发明式中， 手性碳的键绘成直线时， 应理解为手性碳的 (R) 和 (S) 两种构型， 因此该式包括对映体及其混合物两者。与本领域用法相同， 当需要指 定手性碳的绝对构型时， 可将手性碳的一个键绘成楔形 ( 与平面以上的原子连接 )， 且另一 个可绘成虚线或短平行线的楔形 ( 与平面以下的原子连接 )。 可用 Cahn-Inglod-Prelog 系 统表示手性碳的 (R) 或 (S) 构型。
当本发明的 HDAC 抑制剂含有一个手性中心时， 这些化合物存在两种对映体形式， 且本发明包括对映体和对映体的混合物两者， 例如称为外消旋混合物的特殊的 50 ∶ 50 混 合物。可通过本领域技术人员已知的方法例如通过形成可分离的非对映体盐 ； 例如通过结 晶 ( 参见 CRC Handbook of Optical Resolutions via Diastereomeric Salt Formation by David Kozma(CRC Press， 2001)) ； 形成可分离的非对映体衍生物或络合物， 例如通过结 晶、 气相 - 液相或液相色谱 ； 使一种对映体与对映体特异性试剂选择性反应例如酶促酯化 ； 或在手性环境中进行气相 - 液相或液相色谱， 例如在手性载体例如键合手性配体的硅胶 上， 或在手性溶剂存在下， 拆分这些对映体。本领域技术人员将认识到， 当通过上述分离方 法之一将需要的对映体转化为另一种化学实体时， 需要进一步释出需要对映体的步骤。或 者， 可用旋光性试剂、 底物、 催化剂或溶剂， 通过不对称合成或通过不对称转化， 将一种对映 体转化为另一种对映体， 合成具体的对映体。 本发明化合物手性碳的具体绝对构型的符号应理解为表示该化合物的指定对映 体形式为对映体过量 (ee)， 或换言之基本上不含另一种对映体。例如，″ S″形式化合物 中基本上不含″ R″形式化合物， 因此是″ S″形式对映体过量。相反，″ R″形式化合物 中基本上不含″ S″形式化合物， 因此是″ R″形式对映体过量。本文中使用的对映体过量 是某种对映体存在大于 50％。 例如， 对映体过量可为约 60％或更多， 例如约 70％或更多， 例 如约 80％或更多， 例如约 90％或更多。在特殊的实施方案中， 当指明具体的绝对构型时， 所 述化合物的对映体过量至少约 90％。在更具体的实施方案中， 化合物的对映体过量至少约 95％， 例如至少约 97.5％， 例如至少 99％对映体过量。
当本发明化合物有两个或多个手性碳时， 它可具有大于两个的旋光异构体， 且存 在非对映体。例如， 当有两个手性碳时， 化合物可具有最高达 4 个旋光异构体和两对对映体 ((S， S)/(R， R) 和 (R， S)/(S， R))。对映体对 ( 例如 (S， S)/(R， R)) 互为镜像立体异构体。 不为镜像的立体异构体 ( 例如 (S， S) 和 (R， S)) 是非对映体。非对映体对可通过本领域技 术人员已知的方法例如色谱或结晶分离， 且每对中的各对映体可按上述方法分离。本发明 包括此类化合物的每个非对映体及其混合物。
除本文另有明确规定外， 本文中使用的表达形式和定冠词 “该” 包括单数和复数指 示物。因此， 例如 “活性药物” 或 “药理活性药物” 包括一个活性药物和组合的两个或多个 不同的活性药物， “载体” 包括两种或多种载体的混合物和一种载体等。
本发明还包括本文公开的 HDAC 抑制剂的前药。可用熟知的药物学技术制备此类 化合物的任何前药。
除以上列举的化合物外， 本发明还包括此类化合物的同系物和类似物的用途。在 本文中， 同系物是具有基本上与上述化合物结构相似的分子， 类似物是具有基本上生物相 似性的分子， 而无论结构是否相似。烷化剂
烷化剂与亲核性残基例如在生成 DNA 的核苷酸前体上的化学实体反应。它们通过 使这些核苷酸烷基化并阻止其装配到 DNA 中， 影响细胞分裂过程。
烷化剂的实例包括但不限于双氯乙胺 ( 氮芥例如苯丁酸氮芥、 环磷酰胺、 异环磷 酰胺、 氮芥、 美法仑、 乌拉莫司汀 )、 吖丙啶 ( 例如塞替派 )、 烷基酮磺酸酯 ( 例如白消安 )、 亚 硝基脲 ( 例如卡莫司汀、 洛莫司汀、 链佐星 )、 非典型烷化剂 ( 六甲蜜胺、 达卡巴嗪和丙卡巴 肼 )、 铂化合物 ( 卡铂和顺铂 )。这些化合物与磷酸酯、 氨基、 羟基、 巯基 (sulfihydryi)、 羧 基和咪唑基反应。
在生理条件下， 这些药物离子化， 产生与核酸和蛋白质连接的带正电荷的离子， 导致细胞周期抑制和 / 或细胞死亡。烷化剂是细胞周期期非特异性 (phasenonspecific) 药物， 因为它们独立于细胞周期的具体期而发挥它们的活性。氮芥和烷基酮磺酸酯 在 G1 或 M 期对细胞最有效。亚硝基脲、 氮芥和吖丙啶影响由 G1 和 S 期到 M 期的发展。 Chabner 和 Collins 编辑 (1990)″ Cancer Chemotherapy ： Principles and Practice″， Philadelphia ： JB Lippincott。
烷化剂对多种瘤疾病有活性， 治疗白血病和淋巴瘤以及实体瘤具有显著的活性。 在临床上， 此类药物通常用于治疗急性和慢性白血病 ； 霍奇金病 ； 非霍奇金淋巴瘤 ； 多发性 骨髓瘤 ； 原发性脑瘤 ； 乳腺、 卵巢、 睾丸、 肺、 膀胱、 子宫颈、 头和颈的癌和恶性黑素瘤。
常见烷化剂的主要毒性是骨髓抑制。 此外， 一般出现各种程度的肠胃道不良效应， 且各种器官毒性与具体化合物有关。 Black 和 Livingston(1990)Drugs 39 ： 489-501 ； 和 39 ： 652-673。
抗生素
抗生素 ( 例如细胞毒抗生素 ) 通过直接抑制 DNA 或 RNA 合成起作用， 因而在整个 细胞周期中有效。抗生素药物的实例包括蒽环霉素 ( 例如多柔比星、 柔红霉素、 表柔比星、 伊达比星和蒽二酮 )、 丝裂霉素 C、 博来霉素、 放线菌素 D、 plicatomycin。这些抗生素通过 靶向不同的细胞成分而干扰细胞生长。例如， 通常认为蒽环霉素在转录活性 DNA 的区域中 干扰 DNA 拓扑异构酶 II 的作用， 导致 DNA 解链。
通常认为博来霉素螯合铁， 且形成活化络合物， 然后它与 DNA 的碱基结合， 导致解 链和细胞死亡。
抗生素药物已用作多种瘤疾病的治疗药物， 包括乳腺、 肺、 胃和甲状腺的癌、 淋巴 瘤、 骨髓性白血病、 骨髓瘤和肉瘤。在该类中的蒽环霉素的主要毒性是骨髓抑制， 尤其是粒 细胞减少。粘膜炎通常伴随粒细胞减少， 且严重程度与骨髓抑制程度有关。还有与大剂量 给予蒽环霉素有关的明显心脏毒性。
抗代谢药
抗代谢药 ( 即抗代谢物 ) 是一类干扰对癌细胞的增殖和生理机能至关重要的代谢 过程的药物。 增殖活跃的癌细胞需要不断合成大量核酸、 蛋白质、 脂质和其它重要的细胞成 分。
许多抗代谢物抑制嘌呤或嘧啶核苷合成或抑制 DNA 复制的酶。某些抗代谢物还干 扰核糖核苷和 RNA 合成和 / 或氨基酸代谢和蛋白质合成。通过干扰重要的细胞成分合成， 抗代谢物可延迟或抑制癌细胞生长。抗代谢药物的实例包括但不限于氟尿嘧啶 (5-FU)、 氟尿苷 (5-FUdR)、 甲氨蝶呤、 亚叶酸、 羟基脲、 硫鸟嘌呤 (6-TG)、 巯嘌呤 (6-MP)、 阿糖胞苷、 喷 司他丁、 磷酸氟达拉滨、 克拉曲滨 (2-CDA)、 天冬酰胺酶和吉西他滨。
抗代谢药物已广泛用于治疗若干常见种类的癌症， 包括结肠、 直肠、 乳腺、 肝、 胃和 胰腺的癌、 恶性黑素瘤、 急性和慢性白血病、 毛细胞性白血病。在有丝分裂积极组织例如 骨髓或胃肠粘膜中抑制细胞增殖导致抗代谢物治疗的多种不良反应。用这些药物治疗的 患者一般经历骨髓抑制、 口腔炎、 腹泻和脱发。Chen 和 Grem(1992)Curr.Opin.Oncol.4 ： 1089-1098。
激素药物
激素药物是调节其靶器官生长和发育的一类药物。 大多数激素药物是性类固醇及 其衍生物和类似物， 例如雌激素、 孕激素、 抗雌激素药、 雄激素、 抗雄激素药和孕酮。这些激 素药物可作为性类固醇受体的拮抗剂， 下调受体表达和重要基因转录。此类激素药物的实 例有合成雌激素 ( 例如己烯雌酚 )、 抗雌激素药 ( 例如他莫昔芬、 托瑞米芬、 fluoxymesterol 和雷洛昔芬 )、 抗雄激素药 ( 比卡鲁胺、 尼鲁米特、 氟他胺 )、 芳化酶抑制剂 ( 例如氨鲁米特、 阿那曲唑和四唑 )、 促黄体激素释放激素 (LHRH) 类似物、 酮康唑、 醋酸戈舍瑞林、 亮丙立德、 醋酸甲地孕酮和米非司酮。
激素药物用于治疗乳腺癌、 前列腺癌、 黑素瘤和脑膜瘤。因为激素的主要作用通 过类固醇受体介导， 所以 60％受体 - 阳性乳腺癌对一线激素治疗产生反应 ； 且小于 10％受 体 - 阴性肿瘤产生反应。与激素药物有关的主要副作用是潮红。多发的表现形式是骨痛、 皮肤损害周围红斑突然增加以及诱发高钙血症。
孕激素尤其用于治疗子宫内膜癌， 因为这些癌症发生在暴露于孕激素不能拮抗的 高水平雌激素的妇女中。
抗雄激素药主要用于治疗前列腺癌， 它是激素依赖性的。 它们用于降低睾酮水平， 因而抑制肿瘤生长。
激素治疗乳腺癌涉及在乳腺瘤细胞中降低依赖激活雌激素受体的雌激素水平。 抗 雌激素药通过与雌激素受体结合并防止募集辅激活物因而抑制雌激素信号起作用。
LHRH 类似物用于治疗前列腺癌， 降低睾酮水平从而使肿瘤生长减少。
芳化酶抑制剂通过抑制合成激素所需的酶起作用。在绝经后的妇女中， 雌激素的 主要来源是通过芳化酶转化雄烯二酮。
植物来源药物
植物来源药物是来源于植物的药物或在这些药物的分子结构基础上修饰的一类 药物。它们通过阻止对细胞分裂至关重要的细胞成分装配来抑制细胞复制。
植物来源药物的实例包括长春花生物碱 ( 例如长春新碱、 长春碱、 长春酰胺、 长春 利定和长春瑞滨 )、 鬼臼毒素 ( 例如依托泊苷 (VP-16) 和替尼泊苷 (VM-26))、 紫杉烷类 ( 例 如紫杉醇和多西他赛 )。这些植物来源药物通常与抗有丝分裂药物的作用相同， 它们与微 管蛋白结合而抑制有丝分裂。据认为， 鬼臼毒素例如依托泊苷通过与拓扑异构酶 II 相互作 用， 导致 DNA 解链干扰 DNA 合成。
植物来源药用于治疗多种癌症。 例如， 长春新碱用于治疗白血病、 霍奇金和非霍奇 金淋巴瘤和儿童肿瘤成神经细胞瘤、 横纹肌肉瘤和维尔姆斯瘤。 长春碱用于抗淋巴瘤、 睾丸 癌、 肾细胞癌、 蕈样真菌病和卡波西肉瘤。已证实多西他赛有望具有抗晚期乳腺癌、 非小细胞肺癌 (NSCLC) 和卵巢癌的活性。
依托泊苷具有抗多种瘤的活性， 其中小细胞肺癌、 睾丸癌有反应， 且 NSCLC 最敏 感。
植物来源药物在接受治疗的患者中引起明显的副作用。 长春花生物碱表现为不同 的临床毒性。 长春花生物碱的副作用包括神经毒性、 血小板功能改变、 骨髓抑制和白细胞减 少。紫杉醇引起剂量限定性中性白细胞减少和相对缺乏其它造血细胞系。鬼臼毒素的主要 毒性是血液毒性 ( 中性白细胞减少和血小板减少 )。
其它副作用包括瞬时性肝酶异常、 脱发、 过敏反应和外周神经病。
生物药
生物药是单独使用或与化疗和 / 或放疗联合使用时引起癌症 / 肿瘤消褪的一类生 物分子。生物药的实例包括免疫调节蛋白， 例如细胞因子、 抗肿瘤抗原的单克隆抗体、 肿瘤 抑制基因和癌疫苗。
细胞因子具有极强的免疫调节活性。 某些细胞因子例如白介素 -2(IL-2， 阿地白介 素 ) 和 α- 干扰素 (IFN-α) 证实抗肿瘤活性， 已批准用于治疗患有转移性肾细胞癌和转移 性恶性黑素瘤的患者。IL-2 是对 T 细胞介导的免疫反应很重要的 T 细胞生长因子。据认 为， IL-2 对某些患者的选择性抗肿瘤作用是细胞介导的自我和非自我之间有区别免疫反应 的结果。
α- 干扰素包括具有叠加活性的大于 23 个的有关亚型。IFN-α 证实具有抗多种 实体瘤和血液恶性肿瘤的活性， 后者似乎尤其敏感。
干扰素的实例包括 α- 干扰素、 β- 干扰素 ( 成纤维细胞干扰素 ) 和 γ- 干扰素 ( 成纤维细胞干扰素 )。 其它细胞因子的实例包括红细胞生成素 (α- 红细胞生成素 )、 粒细 胞 -CSF( 非格司亭 ) 和粒细胞、 巨噬细胞 -CSF( 沙格司亭 )。其它非细胞因子免疫调节剂包 括芽孢杆菌 Calmette-Guerin、 左旋咪唑和奥曲肽， 作用类似天然产生的激素生长抑素的长 效八肽。
此外， 抗癌治疗可包括使用抗体和肿瘤接种疫苗方法使用的试剂的免疫疗法的治 疗。此类疗法中的主要药物是单独或携带例如毒素或化疗药物 / 对癌细胞产生细胞毒的药 物的抗体。 抗肿瘤抗原的单克隆抗体是引起抗肿瘤表达抗原的抗体， 优选肿瘤特异性抗原。 例如， 提出用单克隆抗体 ( 曲妥单抗 ) 抗在某些乳腺肿瘤中过度表达的人 表皮生长因子受体 2(HER2)， 包括转移性乳腺癌。HER2 蛋白过度表达与更具攻击性疾病和 临床预后较差有关。 单独用于治疗患有肿瘤过度表达 HER2 蛋白的转移性 乳腺癌患者。
抗肿瘤抗原的单克隆抗体的另一个实例为 ( 利妥昔单抗 )， 提出其 抗淋巴瘤细胞上的 CD20 和选择性减少正常和恶性 CD20+ 前 B 细胞和成熟 B 细胞。
RITUXAN 单独用于治疗患有复发或顽固性低级别或滤泡性、 CD20+B 细胞非霍奇金 淋巴瘤的患者。 ( 吉姆单抗奥佐米星 ) 和 ( 阿仑单抗 ) 是可使用的抗肿瘤抗原的单克隆抗体的又一个实例。
肿瘤抑制基因是作用为抑制细胞生长和分裂周期的基因， 因而阻止瘤发展。肿瘤 抑制基因突变导致细胞忽略一种或多种抑制信号网络成分， 克服细胞周期关卡， 且导致控 制细胞更高速度的生长 - 癌。肿瘤抑制基因的实例包括 Duc-4、 NF-1、 NF-2、 RB、 p53、 WT1、BRCA1 和 BRCA2。
DPC4 涉及胰腺癌， 并参与抑制细胞分裂的胞质途径。NF-1 编码抑制 Ras 的蛋白， 它是胞质抑制蛋白。 NF-1 涉及神经系统的神经纤维瘤和嗜铬细胞瘤和骨髓性白血病。 NF-2 编码涉及神经系统的脑膜瘤、 神经鞘瘤和室管膜细胞瘤的核蛋白。 RB 编码 pRB 蛋白， 它是细 胞周期的主要抑制剂核蛋白。RB 涉及成视网膜细胞瘤和骨、 膀胱、 小细胞肺和乳腺癌。P53 编码调节细胞分裂的 p53 蛋白， 并可诱导调亡。发现在多种癌中 p53 突变和 / 或失活。WTI 涉及肾维尔姆斯瘤。BRCA1 涉及乳腺和卵巢癌， BRCA2 涉及乳腺癌。肿瘤抑制基因可转移到 其中可发挥其肿瘤抑制功能的肿瘤细胞中。
癌疫苗是诱导身体对肿瘤产生特异性免疫反应的一类药物。处于研究、 开发和临 床试验中的大多数癌疫苗是肿瘤相关抗原 (TAAs)。TAAs 是存在于肿瘤细胞上， 且在正常 细胞上相对不存在或减少的结构 ( 即蛋白、 酶或碳水化合物 )。由于对肿瘤细胞相当独特， TAAs 为免疫系统识别提供靶， 并导致它们的破坏。 TAAs 的实例包括神经节苷脂 (GM2)、 前列 腺特异性抗原 (PSA)、 甲胎球蛋白 (AFP)、 癌胚抗原 (CEA)( 由结肠癌和其它腺癌例如乳腺、 肺、 胃和胰腺癌产生 )、 黑素瘤有关的抗原 (MART-1、 gap100、 MAGE 1， 3 酪氨酸酶 )、 乳头瘤病 毒 E6 和 E7 片断、 自体肿瘤细胞和异源肿瘤细胞的全细胞或部分 / 溶胞产物。
其它疗法
除用传统的细胞毒和激素疗法治疗癌症外， 还引入新近发展的治疗癌症的其它疗 法。
例如， 多种形式的基因疗法正在进行临床前或临床试验。
此外， 目前在开发基于肿瘤血管形成 ( 血管发生 ) 抑制的方法。该概念的目的是 切断由新形成的肿瘤血管系统提供的肿瘤营养和氧供给。
此外， 还尝试通过诱导瘤细胞终末分化的癌疗法。合适的分化剂包括在以下任何 一篇或多篇参考文献中公开的化合物， 这些文献的内容通过引用结合到本文中。
a) 极 性 化 合 物 (Marks 等 (1987) ； Friend， C.， Scher， W.， Holland， J.W. 和 Sato， T.(1971)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)68 ： 378-382 ； Tanaka， M.， Levy， J.， Terada， M.， Breslow， R.， Rifkind， R.A. 和 Marks， P.A.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)72 ： 1003-1006 ； Reuben， R.C.， Wife， R.L.， Breslow， R.， Rifkind， R.A. 和 Marks， P.A.(1976) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)73 ： 862-866) ；
b) 维生素 D 和维甲酸的衍生物 (Abe， E.， Miyaura， C.， Sakagami， H.， Takeda， M.， Konno， K.， Yamazaki， T.， Yoshika， S. 和 Suda， T.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)78 ： 4990-4994 ； Schwartz， E.L.， Snoddy， J.R.， Kreutter， D.， Rasmussen， H.， and Sartorelli， A.C.(1983)Proc.Am.Assoc.Cancer Res.24 ： 18 ； Tanenaga， K.， Hozumi， M. 和 Sakagami， Y.(1980)Cancer Res.40 ： 914-919) ；
c) 类固醇激素 (Lotem， J. 和 Sachs， L.(1975)Int.J.Cancer 15 ： 731-740) ；
d) 生 长 因 子 (Sachs， L.(1978)Nature(Lond.)274 ： 535， Metcalf， D.(1985) Science， 229 ： 16-22) ；
e) 蛋白酶 (Scher， W.， Scher， B.M. 和 Waxman， S.(1983)Exp.Hematol.11 ： 490-498 ； Scher， W.， Scher， B.M. 和 Waxman， S.(1982)Biochem.& Biophys.Res.Comm.109 ： 348-354) ；
f) 肿 瘤 启 动 子 (Huberman， E. 和 Callaham， M.F.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76 ： 1293-1297 ； Lottem， J. 和 Sachs， L.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76 ： 5158-5162) ； 和
g)DNA 或 RNA 合 成 抑 制 剂 (Schwartz， E.L. 和 Sartorelli， A.C.(1982)Cancer Res.42 ： 2651-2655， Terada， M.， Epner， E.， Nudel， U.， Salmon， J.， Fibach， E.， Rifkind， R.A. 和 Marks， P.A.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)75 ： 2795-2799 ； Morin， M.J. 和 Sartorelli ， A.C.(1984)Cancer Res.44 ： 2807-2812 ； Schwartz ， E.L. ， Brown ， B.J. ， Nierenberg， M.， Marsh， J.C. 和 Sartorelli， A.C.(1983)Cancer Res.43 ： 2725-2730 ； Sugano， H.， Furusawa， M.， Kawaguchi， T. 和 Ikawa， Y.(1973)Bibl.Hematol.39 ： 943-954 ； Ebert， P.S.， Wars， I. 和 Buell， D.N.(1976)Cancer Res.36 ： 1809-1813 ； Hayashi， M.， Okabe， J. 和 Hozumi， M.(1979)Gann70 ： 235-238)，
所有这些方法与 HDAC 抑制剂例如 SAHA 联合使用的用途在本发明范围内。
给药模式和剂量
本发明方法包括在第一治疗方案中给予有需要的患者第一个量的 HDAC 抑制剂例 如 SAHA， 和在第二治疗方案中给予第二个量的抗癌药。第一和第二治疗一起构成治疗有效 量。 本文中使用的术语 “患者” 是指治疗接受者。包括哺乳动物和非哺乳动物患者。在 特殊实施方案中， 患者为哺乳动物， 例如人、 犬科动物、 鼠科动物、 猫科动物、 牛、 羊、 猪或山 羊。在具体实施方案中， 患者是人。
HDAC 抑制剂给药
给药途径
可通过本领域技术人员已知的任何给药方法给予 HDAC 抑制剂 ( 例如 SAHA)。 给药 途径的实例包括但不限于口服、 肠胃外、 腹膜内、 静脉内、 动脉内、 透皮、 舌下、 肌内、 直肠、 经 口颊、 鼻内、 脂质体 ； 通过吸入、 阴道、 眼内 ； 通过导管或印模局部释放、 皮下、 脂肪内、 关节 腔内、 鞘内或缓释剂型。
例如， 本发明 HDAC 抑制剂可用这样的口服形式如片剂、 胶囊剂 ( 其中各自包括缓 释或定时释放制剂 )、 丸剂、 散剂、 颗粒剂、 酏剂、 酊剂、 混悬剂、 糖浆和乳剂给药。同样， 可以 静脉内 ( 一次性大容量浓注或输注 )、 腹膜内、 皮下或肌内形式给予 HDAC 抑制剂， 均使用制 药领域中普通技术人员熟知的形式。目前优选的 HDAC 抑制剂的给药形式是口服给药。
也可以长效注射制剂或植入制剂的形式给予 HDAC 抑制剂， 可按允许缓慢释放活 性成分的方法配制此类制剂形式。可将活性成分压缩成微丸或小圆柱体， 作为长效注射剂 或植入物皮下或肌内植入。植入物可采用惰性材料例如可生物降解的聚合物或合成硅酮， 例如硅橡胶、 硅酮橡胶或 Dow-Corning Corporation 生产的其它聚合物。
也可按脂质体释放系统例如小单层脂质体 (small unilamellar vesicles)、 大单 层脂质体 (large unilamellar vesicles) 和多层脂质体 (multilamellar vesicles) 给予 HDAC 抑制剂。可用各种磷脂例如胆固醇、 硬脂胺或卵磷脂形成脂质体。
也可用与化合物分子结合的单克隆抗体作独立载体释放 HDAC 抑制剂。
HDAC 抑制剂也可用可溶性聚合物作为靶向药物载体制备。此类聚合物包括聚乙 烯吡咯烷酮、 吡喃共聚物、 聚羟基 - 丙基 - 甲基丙烯酰胺 - 酚、 聚羟乙基 - 天冬酰胺 - 酚或 被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷 - 多熔素。此外， 可用可生物降解的聚合物制备 HDAC 抑制
剂， 用于实现控制释放药物， 例如聚乳酸、 聚乙醇酸、 聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、 聚 ε- 己 内酯、 聚羟基丁酸、 聚原酸酯、 聚缩醛、 聚二氢吡喃、 聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲 性嵌段共聚物。
在当前优选的实施方案中， 用明胶胶囊经口给予 HDAC 抑制剂例如 SAHA， 该明胶胶 囊可含有赋形剂例如微晶纤维素、 交联羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁。进一步优选的实施方 案是含有 200mg 固体 SAHA 和 89.5mg 微晶纤维素、 9mg 交联羧甲基纤维素钠和 1.5mg 硬脂酸 镁的明胶胶囊。
剂量和剂量方案
使用 HDAC 抑制剂的剂量方案可根据多种因素选择， 包括种类、 物种、 年龄、 体重、 性别和所治疗癌症类型 ； 所治疗癌症的严重程度 ( 即期 ) ； 给药途径 ； 患者的肾和肝功能 ； 和使用的具体化合物或其盐。普通医师或兽医可容易确定和处方治疗例如预防、 抑制 ( 完 全或部分 ) 或使该疾病发展停止所需有效量的药物。
例如， 可按最高达 800mg 总日剂量给予 SAHA 或任何一种 HDAC 抑制剂。可一日一 次 (QD) 给予 HDAC 抑制剂， 或分为多个日剂量， 例如一日两次 (BID) 和一日三次 (TID)。可 按最高达 800mg 例如 200mg、 300mg、 400mg、 600mg 或 800mg 总日剂量给予 HDAC 抑制剂， 该剂 量可按一日一次或可分为上述多个日剂量给予。优选口服给药。
此外， 可连续即每日或间断给药。本文中使用的术语 “间断” 表示在固定或不固定 间隔停止和开始。例如， 可每周 1-6 天间断给予 HDAC 抑制剂， 或它可表示按周期给药 ( 例 如连续 2-8 周每日给药， 然后停药期最高达 1 周 ) 或它可表示隔日给药。
可按 25-4000mg/m2 总日剂量给予患者 SAHA 或任何 HDAC 抑制剂。目前优选的治 疗方案包括连续每日一次、 两次或三次给予总日剂量约 200mg 至约 600mg。
另一个目前优选的治疗方案包括每周 3-5 日， 每日一次、 两次或三次间断给予总 日剂量约 200mg 至约 600mg。
在一个具体的实施方案中， 按 400mg 剂量每日一次， 或 200mg 剂量每日两次连续给 予 HDAC 抑制剂。
在另一个具体的实施方案中， 按 400mg 剂量， 每日一次， 或按 200mg 剂量每日两次， 每周三天间断给予 HDAC 抑制剂。
在另一个具体的实施方案中， 按 400mg 剂量， 每日一次， 或按 200mg 剂量每日两次， 每周四天间断给予 HDAC 抑制剂。
在另一个具体的实施方案中， 按 400mg 剂量， 每日一次， 或按 200mg 剂量每日两次， 每周五天间断给予 HDAC 抑制剂。
在一个具体的实施方案中， 按 600mg 剂量每日一次、 按 300mg 剂量每日两次或按 200mg 剂量每日三次， 连续给予 HDAC 抑制剂。
在另一个具体的实施方案中， 按 600mg 剂量每日一次， 按 300mg 剂量每日两次或按 200mg 剂量每日三次， 每周三天间断给予 HDAC 抑制剂。
在另一个具体的实施方案中， 按 600mg 剂量每日一次、 按 300mg 剂量每日两次或按 200mg 剂量每日三次， 每周四天间断给予 HDAC 抑制剂。
在另一个具体的实施方案中， 按 600mg 剂量每日一次、 按 300mg 剂量每日两次或按 200mg 剂量每日三次， 每周五天间断给予 HDAC 抑制剂。此外， 可按照上述任何方案， 连续几周给予 HDAC 抑制剂， 随后进入停药期。例如， 可按照上述任一方案， 给予 HDAC 抑制剂 2-8 周， 随后进入一周停药期， 或按 300mg 剂量， 每 日两次一周 3-5 天给药。在另一个具体的实施方案中， 连续两周， 每日三次给予 HDAC 抑制 剂， 随后停药一周。
患者经静脉内或皮下接受足以释放约 3-1500mg/m2/ 日， 例如约 3、 30、 60、 90、 180、 2 300、 600、 900、 1200 或 1500mg/m / 日量的 HDAC 抑制剂。可用多种合适的方式给予这样的 量， 例如在一段延长的时间内或一日一次或几次给予大体积低浓度的 HDAC 抑制剂。可每周 (7 日期 ) 一个或多个连续天、 间断天或其组合给予这些量。或者， 在短期内例如每周 (7 日 期 ) 连续、 间断或其组合的一天或多天， 一日一次给予小体积高浓度的 HDAC 抑制剂。例如， 2 每次治疗可连续 5 日按 300mg/m / 日剂量给予共 1500mg/m2。在另一个给药方案中， 连续天 2 2 数也可以是 5 天， 治疗持续连续 2 或 3 周， 总治疗给予 3000mg/m 和 4500mg/m 。
通常， 可制备静脉内制剂， 该制剂含 HDAC 抑制剂的浓度为约 1.0mg/mL 至约 10mg/ mL， 例 如 2.0mg/mL、 3.0mg/mL、 4.0mg/mL、 5.0mg/mL、 6.0mg/mL、 7.0mg/mL、 8.0mg/mL、 9.0mg/ mL 和 10mg/mL， 和按达到上述剂量的量给药。在一个实例中， 一天可给予患者足够体积的静 2 脉内制剂， 以便该日总剂量为约 300 至约 1500mg/m 。
优选按本领域中熟知的方法， 在 pH 约 5 至约 12 制备皮下制剂， 皮下制剂还包括合 适的下述缓冲剂和等渗剂。可将它们配制成通过每日一次或多次例如每日一次、 两次或三 次皮下给药， 释放日剂量的 HDAC 抑制剂。
也可通过局部使用合适的鼻内溶媒或通过透皮途径， 用本领域普通技术人员熟知 的透皮贴剂给予 HDAC 抑制剂。为按透皮释放系统的形式给药， 在整个剂量方案中， 给药剂 量自然是连续的而非间断的。
本文中所述的各种给药模式、 剂量和给药方案仅描述具体的实施方案， 无意限定 本发明的广义范围， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 剂量和给药方案的任何排列、 变化和组合均包括在本发明的范围内。
抗癌药的给药
HDAC 抑制剂的任何一种或多种具体剂量和剂量方案也适用于用于联合治疗的任 何一种或多种抗癌药。
此外， 抗癌药的具体剂量和剂量方案还可改变， 且最佳剂量、 给药方案和给药途径 根据具体使用的抗癌药而定。
自然， SAHA 或任一其它 HDAC 抑制剂的给药途径独立于抗癌药的给药途径。目前 优选的 SAHA 的给药途径是口服给药。 因此， 按照该实施方案， 经口给予 SAHA， 且第二种药物 ( 抗癌药 ) 可经口、 肠胃外、 腹膜内、 静脉内、 动脉内、 透皮、 舌下、 肌内、 直肠、 经口颊、 鼻内、 脂质体 ； 通过吸入、 阴道、 眼内 ； 通过导管或印模局部释放、 皮下、 脂肪内、 关节腔内、 鞘内或 以缓释剂型给药。
此外， 可通过相同的给药模式给予 HDAC 抑制剂和抗癌药， 即例如口服、 IV 给予两 种药物。但是， 通过一种给药模式例如口服给予 HDAC 抑制剂， 且通过另一种给药模式例如 IV 或上述任何一种或多种其它给药模式给予抗癌药也在本发明范围内。
通常给予的常用抗癌药和日剂量包括但不限于 ：
抗代谢物 ： 1. 甲氨蝶呤 20-40mg/m2 i.v.45102349927 A CN 102349930
说明书4-6mg/m2 p.o. 12000mg/m2 大剂量疗法 100mg/m2 1-2×80mg/m2 p.o. 4mg/m2 i.v. 25mg/m2 i.v. 0.14mg/kg 体重 i.v. 500-2600mg/m2 i.v. 1250mg/m2 p.o. 200mg/m2 i.v. 3000mg/m2 i.v. 大剂量疗法 800-1250mg/m2 i.v. 800-4000mg/m2 p.o. 0.6mg/m2 i.v. 45-6.0mg/m2 i.v. 45-60mg/m2 i.v. 60-80mg/m2 i.v. 10-12mg/m2 i.v. 35-50mg/m2 p.o. 10-12mg/m2 i.v. 10-15mg/m2 i.v.， i.m.， s.c. 2 10-20mg/ i.v. 350mg/m2 i.v. 1.5mg/m2 i.v. 6mg/m2 i.v. 150-200mg/m2 i.v. 480-550mg/m2 p.o. 8-10mg/m2 i.v. 15mg/m2 i.v. 3-6mg/m2 i.v. 40-100mg/m2 p.o. 750-1200mg/m2 i.v. 50-100mg/m2 p.o. 1500-2000mg/m2 i.v. 25-200mg/m2 p.o. 2-6mg/m2 p.o. 5000-8000mg/m2 i.v. 750-1500mg/m2 p.o.44/58 页2.6- 巯嘌呤 3.6- 硫乌嘌呤 4. 喷司他丁 5. 磷酸氟达拉滨 6. 克拉曲滨 7.5- 氟尿嘧啶 8. 卡培他滨 9. 阿糖胞苷 10. 吉西他滨 11. 羟基脲 12. 放线菌素 D 13. 柔红霉素 14. 多柔比星 15. 表柔比星 16. 伊达比星 17. 米托蒽醌 18. 博来霉素 19. 丝裂霉素 C 20. 伊立替康 (CPT-11) 21. 托泊替康 22. 氮芥 23. 磷酸雌莫司汀 24. 美法仑 25. 苯丁酸氮芥 26. 泼尼莫司汀 27. 环磷酰胺 28. 异环磷酰胺 29. 曲磷胺 30. 白消安 31. 曲奥舒凡抗生素 ：烷化剂 ：32. 塞替派 12-16mg/m2 i.v.
33. 卡莫司汀 (BCNU) 100mg/m2 i.v.
34. 洛莫司汀 (CCNU) 100-130mg/m2 p.o.
35. 尼莫司汀 (ACNU) 90-100mg/m2 i.v.
36. 达卡巴嗪 (OTIC) 100-375mg/m2 i.v.
37. 丙卡巴肼 100mg/m2 p.o.
38. 顺铂 20-120mg/m2 i.v.
39. 卡铂 300-400mg/m2 i.v.
抗有丝分裂药 ： 40. 长春新碱 1.5-2mg/m2 i.v.
41. 长春碱 4-8mg/m2 i.v.
42. 长春酰胺 2-3mg/m2 i.v.
43. 依托泊苷 (VP16) 100-200mg/m2 i.v.
100mg p.o.
44. 替尼泊苷 (VM26) 20-30mg/m2 i.v.
45. 紫杉醇 ( 泰素 ) 175-250mg/m2 i.v.
46. 多西他赛 ( 泰索帝 ) 100-150mg/m2 i.v.
激素、 细胞因子和维生
素： 47.α- 干扰素 2-10×106IU/m2
48. 泼尼松 40-100mg/m2 p.o.
49. 地塞米松 8-24mg p.o.
50.G-CSF 5-20μg/kg 体重 s.c.
51.aI/- 反式维甲酸 45mg/m2
52. 白介素 -2 18×106IU/m2
53.GM-CSF 250mg/m2
54. 红细胞生成素 150IU/kg tiw
联合给药
给予 HDAC 抑制剂的第一治疗方案可在第二治疗方案即抗癌药之前、 用抗癌药治 疗之后、 在抗癌药治疗同时或其组合进行。例如， 可确定 HDAC 抑制剂的总疗程。可在用该 抑制剂治疗开始前或用该抑制剂治疗后给予抗癌药。此外， 可在给予抑制剂期间给予抗癌 药物治疗， 但无需在整个抑制剂治疗期间发生。
可按照任何剂量和给药方案给予 SAHA 或任一 HDAC 抑制剂， 结合抗癌药物作用达 到有效治疗癌症的剂量。
药用组合物
如上所述， 可将含 HDAC 抑制剂和 / 或抗癌药物的组合物配制成适用于以下途径 给药的任何剂型 ： 口服、 肠胃外、 腹膜内、 静脉内、 动脉内、 透皮、 舌下、 肌内、 直肠、 经口颊、 鼻 内、 脂质体 ； 通过吸入、 阴道或眼内给药 ； 通过导管或印模局部释放给药， 或用于皮下、 脂肪 内、 关节腔内、 鞘内给药， 或以缓释剂型给药。
可将 HDAC 抑制剂和抗癌药配制在用于同时给药的同一个剂型中， 或可将它们配 制成两个独立的剂型， 可按上述同时或序贯给药。本发明还包括含 HDAC 抑制剂的药学上可接受的盐和 / 或抗癌药的药用组合物。 本 文中所述化合物的合适和适用于本发明方法的药学上可接受的盐可包括碱或酸加成盐例 如无机碱盐的盐， 例如碱金属盐 ( 例如锂盐、 钠盐、 钾盐等 )、 碱土金属盐 ( 例如钙盐、 镁盐 等 )、 铵盐 ； 有机碱盐， 例如有机胺盐 ( 例如三乙胺盐、 吡啶盐、 甲基吡啶盐、 乙醇胺盐、 三乙 醇胺盐、 二环己胺盐、 N， N′ - 二苄基乙二胺盐等 ) 等 ； 无机酸加成盐 ( 例如盐酸盐、 氢溴酸 盐、 硫酸盐、 磷酸盐等 ) ； 有机羧酸或磺酸加成盐 ( 例如甲酸盐、 乙酸盐、 三氟乙酸盐、 马来酸 盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 苯磺酸盐、 对甲苯磺酸盐等 ) ； 碱性或酸性氨基酸 ( 例如精氨酸、 天 冬氨酸、 谷氨酸等 ) 的盐等。
本发明还包括含 HDAC 抑制剂的水合物和 / 或抗癌药的药用组合物。术语 “水合 物” 包括但不限于半水合物、 一水合物、 二水合物、 三水合物等。
此外， 本发明还包括含任何固体或液体物理形式的 SAHA 或任何其它 HDAC 抑制剂 的药用组合物。例如， HDAC 抑制剂可以是晶体形式、 无定形并具有任何粒度。HDAC 抑制剂 颗粒可为微粉化或可为成团、 粉碎颗粒、 粉末、 油、 油悬浮液或固体或液体物理形式的任何 其它形式。
对于口服给药， 药用组合物可以是液体或固体。 合适的固体口服制剂包括片剂、 胶 囊剂、 丸剂、 颗粒剂、 微丸等。合适的液体口服制剂包括溶液、 混悬液、 分散体、 乳液、 油等。
常用作载体或稀释剂的任何惰性赋形剂， 例如胶、 淀粉、 糖、 纤维素物质、 丙烯酸酯 或其混合物可用于本发明制剂。 组合物还可含崩解剂和润滑剂， 此外， 可含一种或多种选自 以下的添加剂 ： 粘合剂、 缓冲剂、 蛋白酶抑制剂、 表面活性剂、 增溶剂、 增塑剂、 乳化剂、 稳定 剂、 增粘剂、 甜味剂、 成膜剂或其任何组合。此外， 本发明组合物可以是控释或即释制剂。
HDAC 抑制剂作为活性成分可与根据预定给药形式适当选择的合适药用稀释剂、 赋 形剂或载体 ( 本文中统称为 “载体” 物质或 “药学上可接受的载体” ) 混合在一起给药。本 文中使用的 “药学上可接受的载体” 包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、 分散介质、 包 衣剂、 抗细菌和抗真菌剂、 等渗剂和延迟吸收剂等。
合适的载体在本领域中的标准参考教材最新版 Remington′ s Pharmaceutical Sciences 中有描述， 其通过引用结合到本文中。
对于液体制剂， 药学上可接受的载体可以是水或非水溶液、 混悬液、 乳液或油。非 水溶剂的实例有丙二醇、 聚乙二醇和注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、 醇 / 水溶 液、 乳液或混悬液， 包括盐水和缓冲介质。油的实例有石油、 动物、 植物或合成来源的那些 油， 例如花生油、 大豆油、 矿物油、 橄榄油、 葵花油和鱼肝油。溶液或混悬液还可包括以下组 分： 无菌稀释剂例如注射用水、 盐水溶液、 不挥发油、 聚乙二醇、 甘油、 丙二醇或其它合成溶 剂； 抗细菌剂例如苯甲醇或尼泊金甲酯 ； 抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠 ； 螯合剂例 如乙二胺四乙酸 (EDTA) ； 缓冲剂例如乙酸盐、 柠檬酸盐或磷酸盐和调节张度的试剂例如氯 化钠或葡萄糖。可用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调节 pH。
也可使用脂质体和非水溶媒例如不挥发油。 本领域中熟知用于药物活性物质的此 类介质和试剂的用途。除与活性化合物不配伍的任何常用介质或试剂外， 其在组合物中的 用途是可期的。还可将辅助活性化合物加入组合物中。
固体载体 / 稀释剂包括但不限于胶、 淀粉 ( 例如玉米淀粉、 预胶化淀粉 )、 糖 ( 例如 乳糖、 甘露醇、 蔗糖、 葡萄糖 )、 纤维素物质 ( 例如微晶纤维素 )、 丙烯酸酯 ( 例如聚甲基丙烯酸酯 )、 碳酸碳、 氧化镁、 滑石粉或其混合物。
此外， 组合物还可含粘合剂 ( 例如阿拉伯胶、 玉米淀粉、 明胶、 卡波姆、 乙基纤维 素、 瓜尔胶、 羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮 )、 崩解剂 ( 例如玉米淀粉、 马铃薯淀粉、 藻酸、 二氧化硅、 交联羧甲基纤维素钠、 交联聚乙烯吡咯烷酮、 瓜尔胶、 淀粉羟 乙酸钠、 羧甲基淀粉钠 (Primogel))， 各种 pH 和离子强度的缓冲剂 ( 例如 tris-HCl、 乙酸 盐、 磷酸盐 )、 阻止表面吸附的添加剂例如白蛋白或明胶、 清洁剂 ( 例如吐温 20、 吐温 80、 泊 洛沙姆 F68、 胆酸盐 )、 蛋白酶抑制剂、 表面活性剂 ( 例如十二烷基硫酸钠 )、 渗透促进剂、 增溶剂 ( 例如甘油、 聚乙二醇 )、 助流剂 ( 例如胶体二氧化硅 )、 抗氧化剂 ( 例如抗坏血酸、 焦亚硫酸钠、 丁基化羟基苯甲醚 )、 稳定剂 ( 例如羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素 )、 增粘 剂 ( 例如卡波姆、 胶体二氧化硅、 乙基纤维素、 瓜尔胶 )、 甜味剂 ( 例如蔗糖、 阿司帕坦、 柠檬 酸 )、 矫味剂 ( 例如薄荷、 水杨酸甲酯或橙味香精 )、 防腐剂 ( 例如硫柳汞、 苯甲醇、 尼泊金 酯 )、 润滑剂 ( 例如硬脂酸、 硬脂酸镁、 聚乙二醇、 十二烷基硫酸钠 )、 助流剂 ( 例如胶体二氧 化硅 )、 增塑剂 ( 例如酞酸二乙酯、 枸橼酸三乙酯 )、 乳化剂 ( 例如卡波姆、 羟丙基纤维素、 十二烷基硫酸钠 )、 聚合物包衣剂 ( 例如泊洛沙姆或其乙二胺衍生物 (poloxamines))、 包衣 剂和成膜剂 ( 例如乙基纤维素、 丙烯酸酯、 聚甲基丙烯酸酯 ) 和 / 或助剂。
在一个实施方案中， 使活性化合物和防止化合物从体内快速消除的载体一起制 备， 例如控释制剂包括植入物和微囊释药系统。可使用生物降解、 生物相容聚合物， 例如乙 烯醋酸乙烯酯、 聚酐、 聚乙醇酸、 胶原、 聚原酸酯和聚乳酸。 制备此类制剂的方法对本领域技 术人员而言显而易见。也可从 Alza Corporation 和 Nova Pharmaceuticals， Inc 购买原 料。也可用脂质体混悬液 ( 包括用病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体 ) 作药学 上可接受的载体。这些可按本领域技术人员已知的方法例如按美国专利号 4,522,811 中所 述方法制备。
配制便于给药和剂量均匀的剂量单位形式的口服组合物尤其最好。 本文中所用的 剂量单位形式是指适用于治疗患者的单位剂量的物理不连续单位 ； 每单位含预计产生需要 疗效的预定量活性化合物和组合应用的需要药用载体。 本发明剂量单位形式的规格由活性 化合物的独特特征、 欲达到的具体疗效和用于治疗个体的组合此类活性化合物技术的内在 限制所决定并直接取决于这些因素。
可将药用组合物和用药说明书一起包括在容器、 包装或分配器中。
在本领域中容易理解含活性成分的药用组合物的制备， 例如通过混合、 制粒或片 剂形成方法。活性治疗成分通常与药学上可接受和与活性成分配伍的赋形剂混合。用于口 服给药的活性药物与通常用于该目的的添加剂例如溶媒、 稳定剂或惰性稀释剂混合， 通过 常用方法转化为合适的给药形式， 例如以上详述的片剂、 包衣片剂、 硬或软明胶胶囊剂 ； 水、 醇或油溶液等。
给予患者的化合物量小于患者中毒量。在某些实施方案中， 给予患者的化合物量 小于导致患者血浆中化合物浓度等于或超过该化合物毒性水平的量。优选， 使患者血浆中 化合物的浓度保持在约 10nM。在另一个实施方案中， 使患者血浆中化合物的浓度保持在约 25nM。在另一个实施方案中， 使患者血浆中化合物的浓度保持在约 50nM。在另一个实施方 案中， 使患者血浆中化合物的浓度保持在约 100nM。在另一个实施方案中， 使患者血浆中化 合物的浓度保持在约 500nM。在另一个实施方案中， 使患者血浆中化合物的浓度保持在约1000nM。在另一个实施方案中， 使患者血浆中化合物的浓度保持在约 2500nM。在另一个实 施方案中， 使患者血浆中化合物的浓度保持在约 5000nM。用 HMBA 发现， 给予化合物的量在 2 2 2 约 5g/m / 日至约 30g/m / 日， 尤其约 20g/m / 日有效而不在患者中产生毒性。在实施本发 明中， 应给予患者的最佳化合物量取决于具体使用的化合物和所治疗癌症的类型。
制剂中活性成分和各种赋形剂的百分比可以改变。例如， 组合物可含 20-90％， 优 选 50-70％ ( 重量 ) 活性药物。
对于 IV 给药， 可用葡萄糖醛酸、 L- 乳酸、 乙酸、 柠檬酸或在静脉内给药可接受的 pH 范围内的具有适度缓冲能力的任何药学上可接受的酸 / 共轭碱作为缓冲剂。也可使用其中 已用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠将 pH 调至需要范围内的氯化钠溶液。通常， 静脉内给药制 剂的 pH 范围可为约 5 至约 12。含 HDAC 抑制剂 ( 其中 HDAC 抑制剂具有异羟肟酸部分 ) 的 静脉内给药制剂的优选 pH 范围可为约 9 至约 12。
优选按本领域中熟知的方法， 在 pH 约 5 至约 12 的范围内制备皮下制剂， 该制剂也 包含合适的缓冲剂和等渗剂。 可将它们配制成每日一次或多次皮下给药释放日剂量的活性 药物。选择制剂的合适缓冲剂和 pH 取决于给予 HDAC 抑制剂的溶解性， 本领域普通技术人 员容易作出选择。在皮下制剂中也可使用其中已用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠将 pH 调至 需要范围内的氯化钠溶液。通常， 皮下制剂的 pH 范围可为约 5 至约 12。具有异羟肟酸部分 的 HDAC 抑制剂的皮下制剂的优选 pH 范围可为约 9 至约 12。
也可通过局部使用合适的鼻内溶媒， 以鼻内形式给予本发明组合物， 或通过透皮 途径， 用该领域普通技术人员熟知的透皮贴剂的那些形式给药。为以透皮释放系统形式给 药， 在整个给药方案中， 给药剂量自然是连续而非间断。
本发明还通过使细胞与第一个量的辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) 或其药学上可接 受的盐或水合物和第二个量的抗癌药接触， 提供体外选择性诱导瘤细胞终末分化、 细胞生 长停止和 / 或调亡的方法， 因而抑制此类细胞的增殖， 其中第一个和第二个量一起构成有 效诱导细胞终末分化、 细胞生长停止、 细胞调亡的量。
尽管本发明方法可体外实施， 但预期选择性诱导瘤细胞终末分化、 细胞生长停止 和 / 或调亡的方法的优选实施方案将包括体内接触细胞， 即通过给予需要治疗的有潜伏瘤 细胞或肿瘤细胞的患者这些化合物。
因此， 本发明还通过在第一治疗方案中给予患者第一个量的辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) 或其药学上可接受的盐或水合物， 和在第二治疗方案中给予第二个量的抗癌药， 提 供选择性诱导瘤细胞终末分化、 细胞生长停止和 / 或调亡的方法， 因而在患者中抑制此类 细胞增殖， 其中第一个和第二个量一起构成有效诱导细胞终末分化、 细胞生长停止、 细胞调 亡的量。
在随后的实验详述部分， 用实施例说明本发明。 描述该部分以帮助理解本发明， 但 不会也无意以任何方式限定权利要求书中描述的本发明。
实验详述部分
实施例 1 ：
合成 SAHA
可按下述方法， 或美国专利 5,369,108( 其通过引用整体结合到本文中 ) 描述的方 法或按任何其它方法合成 SAHA。合成 SAHA 步骤 1- 合成辛二酸单酰苯胺 (Suberanilic acid)在 22L 烧瓶中， 加入 3,500g(20.09mol) 辛二酸， 将该酸加热融化。升温至 175℃， 然后加入 2,040g(21.92mol) 苯胺。升温至 190℃， 在该温度下保持 20 分钟。将融化物倾 入含有 4,017g 氢氧化钾 50L 水溶液的 Nalgene 罐中。将混合物搅拌 20 分钟， 随后加入融 化物。按相同规模重复进行该反应， 将第二批融化物倾入相同氢氧化钾溶液中。将混合物 充分搅拌后， 关闭搅拌器， 使混合物沉降。然后使混合物通过硅藻土垫 (4,200g) 过滤 ( 过 滤产物除去中性副产物 ( 由苯胺在辛二酸的两端发生化学反应产生 )。滤液含有产物的盐 和未反应辛二酸的盐。使混合物沉降， 因为过滤非常缓慢， 需要几天 )。将滤液用 5L 浓盐 酸酸化 ； 将混合物搅拌 1 小时， 然后使其沉降过夜。 将产物过滤， 收集， 在漏斗上用去离子水 洗涤 (4×5L)。将湿滤饼放入含有 44L 去离子水的 72L 烧瓶中， 将混合物加热至 50℃， 将固 体通过热过滤分离 ( 需要的产物混杂有在热水中溶解度大的多的辛二酸。热研磨几次， 除 去辛二酸。用 NMR[D6DMSO] 检查产物， 以监控辛二酸的除去 )。在 50℃下， 用 44L 水重复进 行热研磨。将产物再次通过过滤分离， 用 4L 热水冲洗。在真空干燥箱中， 用 Nash 泵作真空 源 (Nash 泵是液体 ( 水 ) 环泵， 抽真空度达约 29 英寸汞柱。间断充入氩气， 以用于帮助输 送水 )， 在 65℃下干燥过周末 ； 得到 4,182.8g 辛二酸单酰苯胺。
产物仍含少量辛二酸 ； 因此， 在 65℃下， 一次用约 300g 产物分批进行热研磨。将 每一部分过滤， 再用热水 ( 总共约 6L) 彻底冲洗。重复该过程以纯化整批产物。这样就完 全除去产物中的辛二酸。在烧瓶中合并固体产物， 与 6L 甲醇 / 水 (1 ∶ 2) 一起搅拌， 然后 过滤分离， 在滤器上晾干过周末。将其置于盘中， 在用 Nash 泵和氩气流的真空干燥箱中， 在 65℃下干燥 45 小时。终产物的重量为 3,278.4g(32.7％收率 )。
步骤 2- 合成辛二酸 - 酰苯胺甲酯 (Methyl Suberanilate)
向装有机械搅拌器和冷凝器的 50L 烧瓶中加入 3,229g 来自前步的辛二酸单酰苯 胺、 20L 甲醇和 398.7g Dowex 50WX2-400 树脂。将混合物加热至回流， 保持回流 18 小时。 将混合物过滤， 除去树脂珠， 在旋转蒸发仪上， 将滤液蒸发至残渣。
将旋转蒸发仪中的残渣转移至装有机械搅拌器和冷凝器的 50L 烧瓶中。向该烧瓶 中加入 6L 甲醇， 将混合物加热， 得到溶液。然后加入 2 L 去离子水， 停止加热。搅拌下， 使 混合物冷却， 然后将烧瓶置于冰浴中， 使混合物冷却。将固体产物过滤分离， 滤饼用 4 L 冷 甲醇 / 水 (1 ∶ 1) 冲洗。在使用 Nash 泵的真空干燥箱中， 在 45℃下， 将产物干燥总共 64 小 时， 得到 2,850.2g(84％收率 ) 辛二酸 - 酰苯胺甲酯， CSL 批号 98-794-92-31。
步骤 3- 合成粗 SAHA
向配有机械搅拌器、 热电偶和惰性气体插管的 50 L 烧瓶中加入 1,451.9g 盐酸羟 胺、 19 L 无水甲醇和 3.93 L 30％甲醇钠的甲醇溶液。然后向烧瓶中加入 2,748.0g 辛二 酸 - 酰苯胺甲酯， 随后加入 1.9 L 30％甲醇钠的甲醇溶液。将混合物搅拌 16 小时又 10 分 钟。将反应烧瓶 ( 烧瓶 1) 中的约一半反应混合物转移至装有机械搅拌器的 50 L 烧瓶 ( 烧 瓶 2) 中。然后将 27 L 去离子水加入烧瓶 1， 将混合物搅拌 10 分钟。用 pH 计测定 pH ； pH 为 11.56。通过加入 100ml 30％甲醇钠的甲醇溶液将混合物的 pH 调节至 12.02 ； 得到澄清溶 液 ( 此时反应混合物含有少量固体。调节 pH， 得到澄清溶液， 从中沉淀出产物 )。按相同方 法将烧瓶 2 中的反应混合物稀释 ； 加入 27 L 去离子水， 向混合物中加入 100ml 30％甲醇钠 溶液调节 pH， 得到 pH 12.01( 澄清溶液 )。
通过加入冰醋酸将各烧瓶中的反应混合物酸化， 沉淀产物。 烧瓶 1 的终 pH 为 8.98， 且烧瓶 2 的终 pH 为 8.70。将两个烧瓶中的产物用布氏漏斗和滤布过滤分离。用 15L 去离 子水洗涤滤饼， 掩盖漏斗， 在真空下， 将漏斗上的产物部分干燥 15.5h。移去产物， 将产物置 于 5 只玻璃盘中。 将这些盘放入真空干燥箱中， 将产物干燥至恒重。 第一干燥期为 22 小时， 在 60℃下， 用 Nash 泵作真空源和用氩气流。从真空干燥箱中取出盘， 称重。将盘放回干燥 箱， 再用油泵作真空源不用氩气流， 干燥产物 4h 又 10 分钟。将该物质包装在双层 4-mill 聚乙烯袋中， 放入塑料外壳容器中。取样后， 终重量为 2633.4g(95.6％ )。
步骤 4- 重结晶粗 SAHA
使粗 SAHA 在甲醇 / 水中重结晶。配有机械搅拌器、 热电偶、 冷凝器和惰性气体插 管的 50L 烧瓶中加入待结晶的粗 SAHA(2,525.7g)， 随后加入 2,625ml 去离子水和 15,755ml 甲醇。将物料加热至回流， 得到溶液。然后将 5,250ml 去离子水加入反应混合物中。停止 加热， 使混合物冷却。 当混合物足够冷 (28℃ ) 以致可安全处理烧瓶时， 从加热套移去烧瓶， 放入用作冷浴的浴盆中。将冰 / 水加入该浴盆， 使混合物冷却至 -5℃。将混合物在该温度 以下保持 2 小时。将产物过滤分离， 滤饼用 1.5L 冷甲醇 / 水 (2 ∶ 1) 洗涤。掩盖漏斗， 在 真空下， 将产物部分干燥 1.75h。从漏斗上移去产物， 并置于 6 只玻璃盘中。将这些盘放入 真空干燥箱中， 在 60℃下， 用 Nash 泵作真空源和用氩气流， 将产物干燥 64.75h。取出盘， 称 重， 然后放回干燥箱， 再在 60℃下干燥 4h， 得到恒重。第二干燥期的真空源是油泵， 不使用 氩气流。将物质包装在双层 4-mill 聚乙烯袋中， 放入塑料外壳容器中。取样后， 终重量为 2,540.9g(92.5％ )。
实施例 2
SAHA 和吉西他滨组合在 T24 细胞系中的作用
SAHA 与吉西他滨联合使用， 导致观测到大于通过单独使用各药物所获得加和效应 的联合协同作用。
材料和方法 ：
将细胞按 1.25×104 细胞 /ml 密度接种在含 10％ FCS 的 MEMα 培养基中， 任其附 着在孔上。
将吉西他滨溶于 MEMα 培养基中， 用 1NNaOH 将 pH 调节至 7。通过用完全培养基系 列稀释吉西他滨制备各浓度吉西他滨。由 1mM 储备液制备各浓度 SAHA。
细胞不处理， 通过吸出孔和再加入指定浓度的相关培养基单独用 SAHA 处理、 单独 用吉西他滨处理或用 SAHA 和吉西他滨的组合同时处理。然后将细胞用含化合物或各化合 物组合的培养基培养。
为测定增殖和生存力， 收获一式三份细胞样品， 在确定时间点统计增殖和生存力。 为收获细胞， 用 0.5ml 胰蛋白酶除去各孔中内容物， 转移至 15ml 试管中， 将细胞离心， 再悬 浮在 1ml 培养基中。在血细胞计数器上统计收获的细胞用于增殖。通过锥虫蓝排除测定生 存力。
结果 ：
将 T24 细胞培养在完全培养基中 ( 对照 )， 与 2nM 吉西他滨一起、 与 5μM SAHA 一 起或与 2nM 吉西他滨和 5μM SAHA 的组合一起培养 96 小时。
结果绘制在图 1A( 显示细胞增殖 ) 和图 1B( 显示细胞生存力 ) 中。如图 1 所示， 用 SAHA 和吉西他滨组合处理的细胞明显比单独的 SAHA 或吉西他滨抑制更多的细胞增殖。
吉西他滨和 SAHA 的组合产生比各成分单独给药时的加和效应明显更好的结 果 - 即协同反应， 提供超过加和反应的增加优势。
实施例 3
SAHA 和吉西他滨组合在 LnCap 细胞系中的作用
材料和方法 ：
将细胞按 2.5×104 细胞 /ml 密度接种在含 10％ FCS 的 RMPI 培养基中， 任其附着 在孔上。
将吉西他滨溶于培养基中， 用 1N NaOH 将 pH 调节至 7。通过用完全培养基系列稀 释吉西他滨制备各浓度的吉西他滨。由 1mM 储备液制备各浓度的 SAHA。
细胞不处理， 通过吸出孔和再加入指定浓度的相关培养基单独用 SAHA 处理、 单独 用吉西他滨处理或用 SAHA 和吉西他滨的组合同时处理。然后将细胞用含化合物或各化合 物组合的培养基培养。
为测定增殖和生存力， 按以上实施例 2 中所述收获一式三份细胞样品， 在指定时 间点统计增殖和生存力。
结果 ：
将 LnCap 细胞培养在完全培养基中 ( 对照 )， 与 2nM 吉西他滨一起、 与 5μMSAHA 一 起或与 2nM 吉西他滨和 5μM SAHA 的组合一起培养 72 小时。
结果绘制在图 2A( 显示细胞增殖 ) 和图 2B( 显示细胞生存力 ) 中。如图 2 所示， 单独用吉西他滨处理细胞对细胞产生小的作用， 而用 SAHA 处理明显抑制增殖。用 SAHA 和 吉西他滨组合处理产生加和效应。
实施例 4
SAHA 和 5- 氮杂胞苷组合在 T24 细胞系中的作用
材料和方法 ：
在 37℃下， 在 T-150 瓶中， 用含 10％ FCS 的 RPMI 培养细胞。用完全培养基将细胞 4 稀释至 5.0×10 细胞 /ml 密度。将细胞在 37℃下温育 14 小时， 然后用 5- 氮杂胞苷处理， 使细胞附着在孔上。
由 1mM 储备液通过系列稀释制备各浓度的 5- 氮杂胞苷。在完全培养基中温育 14小时后， 从孔吸出， 用 1ml 指定浓度的 5- 氮杂胞苷代替培养基。将细胞在 5- 氮杂胞苷中预 温育 27.5 小时， 然后加入 SAHA。
由 1mM 储备液制备各浓度的 SAHA。
在单独培养基中 ( 对照 ) 或用 5- 氮杂胞苷预温育后， 从孔吸出， 用 1ml 单独培养 基 ( 对照 )、 含单独 5- 氮杂胞苷的培养基、 含单独 SAHA 的培养基或含 5- 氮杂胞苷和 SAHA 组合的培养基代替孔内容物。
为测定增殖和生存力， 按以上实施例 2 中所述收获一式三份细胞样品， 在指定时 间点统计增殖和生存力。
结果 ：
按上述方法将 T24 细胞用完全培养基 ( 对照 ) 培养， 用 200nM 5- 氮杂胞苷培养、 用 5μM SAHA 培养或用 200nM 5- 氮杂胞苷和 5μMSAHA 组合培养。
结果绘制在图 3A( 显示细胞增殖 ) 和图 3B( 显示细胞生存力 ) 中。如图 3 所示， 单独用 5- 氮杂胞苷或单独用 SAHA 处理细胞明显抑制增殖。用 SAHA 和 5- 氮杂胞苷组合处 理产生加和效应， 相对于初始细胞计数获得基本上完全抑制增殖。
实施例 5
SAHA 和依托泊苷、 多柔比星、 5- 氟尿嘧啶、 米托蒽醌和奥沙利铂的组合在乳腺癌、 成胶质细胞瘤和前列腺癌细胞系中的作用
研究目的 ：
这些研究的目的是确定 SAHA 和表 1 中列出的治疗药物的组合是否比任一单独药 物更有效抑制细胞生长和集落形成。所有组合药物均有市售， 可从 Sigma 购买。在这些研 究中， 对代表三种普通癌类型的 5 种不同细胞系进行测试 ( 表 2)。在两种试验中观测到几 种药物的抗增殖作用， 一般观测到加和效应。
表 1. 用于与 SAHA 组合的药物
治疗药物 依托泊苷 (Eto) 多柔比星 (Dox) 5- 氟尿嘧啶 (5-FU) 米托蒽醌 (Mitox) 奥沙利铂 (Oxal)
细胞系 MDA-231 乳腺表 2. 用于 SAHA 组合研究的细胞系U-118 成胶质细胞瘤 DU-145 前列腺 PC-3 前列腺 LnCap 前列腺
细胞生长试验 ：
细胞生长抑制试验使用市售 MTS 测定方法， 又称为 Cell Titer 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(96 孔细胞滴定板单水溶液细胞增殖测定法 )。MTS 试剂含新四唑 化合物 [3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-5-(3- 羧基甲氧基苯基 )-2-(4- 磺 ， 内盐 ] 和电子偶合试剂 ( 吩嗪硫酸乙酯 ； PES)。 通过将少量 MTS 试剂直 产物量直接与培养基中的活细胞数目成比例。按两种不同苯基 )-2H- 四唑接加入培养孔中， 温育 1-4 小时进行试验， 然后用 96 孔板阅读器记录 490nM 处吸收度。通 过 490nM 处吸收度测量的甲方法实施 MTS 测定方法的处理方案。在一种方法中， 将接种的细胞用 SAHA 预处理 4 小时， 然后在加入联合药物之前洗涤除去 SAHA， 剩余物温育 48 小时。 另一种方法中， 用 SAHA 处理 细胞 48 小时， 然后加入第二种药物， 保持 4 小时。然后洗涤细胞， 任其生长 48 小时。
集落形成试验 ：
集落形成试验操作如下。在 6cm 皿中按 200-300 细胞 / 皿接种细胞， 任其附着 24 小时。用 SAHA 处理细胞 48 小时， 然后加入联合药物， 再保持 4 小时。然后洗涤细胞， 使集 落生长 2-3 周， 然后用 2％结晶紫的甲醇溶液染色。 统计每只皿中具有阈值尺寸 ( ～ 0.2mm) 的所有集落。在每一处理组中， 一式两份统计皿， 集落数 / 皿的范围如误差线所示。
结果 ：
A.SAHA 组合对 MDA-231 细胞增殖的作用 ( 图 4)
在一个实验中， 用指定浓度的 SAHA 预处理 MDA-231 乳腺癌细胞 4 小时， 洗涤， 然后 加入第二种药物， 保持 48 小时。用 MTS 试验定量细胞生长。结果绘制在图 4A。
在另一个实验中， 用指定浓度的 SAHA 预处理细胞 48 小时， 加入第二种药物， 保持 4 小时， 然后洗涤细胞。48 小时后， 用 MTS 试验定量细胞生长。结果绘制在图 4B。
如图 4 所示， SAHA 和指定浓度的治疗药物依托泊苷、 多柔比星、 5- 氟尿嘧啶、 米托 蒽醌和奥沙利铂组合处理比单独各药物处理产生更强的抗增殖作用。 该作用显然是加和性 的。
B.SAHA 组合对 DU145 细胞增殖的作用 ( 图 5)
用指定浓度的 SAHA 预处理细胞 48 小时， 加入第二种药物， 保持 4 小时， 然后洗涤 细胞。48 小时后， 用 MTS 试验定量细胞生长。
如图 5 所示， SAHA 和指定浓度的治疗药物依托泊苷、 多柔比星、 5- 氟尿嘧啶、 米托 蒽醌和奥沙利铂组合处理比单独各药物处理产生更强的抗增殖作用。 该作用显然是加和性 的。
C.SAHA 组合对 DU145 细胞克隆发生的作用 ( 图 6)用 SAHA 处理细胞 48 小时， 然后加入第二种药物， 保持 4 小时， 然后洗涤细胞。2-3 周后， 评价集落形成。
如图 6 所示， SAHA 和指定浓度的治疗药物依托泊苷、 多柔比星和奥沙利铂组合处 理比单独各药物处理减少的集落数目程度更大。该作用显然是加和性的。
D.SAHA 组合对 MDA-231 细胞克隆发生的作用 ( 图 7)
用 SAHA 处理细胞 48 小时， 然后加入第二种药物， 保持 4 小时， 然后洗涤细胞。2-3 周后， 评价集落形成。
如图 7 所示， SAHA 和指定浓度的治疗药物依托泊苷、 多柔比星、 5- 氟尿嘧啶和奥沙 利铂组合处理比单独各药物处理减少的集落数目程度更大。该作用显然是加和性的。
E.SAHA 组合对 U118 细胞克隆发生的作用 ( 图 8)
用 SAHA 处理细胞 48 小时， 然后加入第二种药物， 保持 4 小时， 然后洗涤细胞。2-3 周后， 评价集落形成。
如图 8 所示， SAHA 和指定浓度的治疗药物依托泊苷、 多柔比星、 5- 氟尿嘧啶和奥沙 利铂组合处理比单独各药物处理减少的集落数目程度更大。该作用显然是加和性的。
实施例 6
SAHA 和化疗药物伊立替康、 5- 氟尿嘧啶和多西他赛的联合作用
研究目的和概述 ：
这些研究的目的是当体外给予三种临床使用的抗癌药 ： 伊立替康、 5- 氟尿嘧 啶 (5-FU) 和多西他赛与 SAHA 的配对组合时， 评价 SAHA 对转化膀胱癌 (T24)、 前列腺癌 (LnCap)、 乳腺癌 (MCF7)、 非霍奇金淋巴瘤 (DLCL) 和结肠类癌瘤 (LCC18) 细胞系的作用。
用 SAHA 与这些药物之一的各种组合处理转化细胞， 以便评价每对 (SAHA 加药物 ) 是否能产生加和、 协同或拮抗抗增殖作用。结果表明 SAHA 与伊立替康、 5- 氟尿嘧啶和多西 他赛的联合作用大多数是加和性。在某些实验中， 发现协同作用。如下文所述， 最明显的协 同作用发生在用 SAHA 和多西他赛组合的 LnCap 细胞中。
伊立替康、 5- 氟尿嘧啶和多西他赛
这三种药物目前各自在临床上用于癌症化疗， 均已广泛表征。
伊立替康的作用是稳定核拓扑异构酶 I/DNA 复合物， 其导致 DNA 断裂的单链蓄积， 从而导致调亡。在临床上， 它用于治疗包括乳腺、 结肠直肠、 子宫颈、 卵巢和小细胞 / 非小细 胞肺癌的很多种癌症 (Hardman W.E. 等 (1999)BrJCancer81， 440-448)。
5- 氟尿嘧啶 (5-FU) 作用同嘧啶拮抗剂， 抑制脱氧尿苷酸甲基化为胸苷酸并随后 合成 DNA 和 RNA(http://www.nursespdr.com/members/database/ndrhtml/fluorouracil. html)。 该药物作为化疗药物最近数十年已广泛使用， 临床上也与其它抗癌药包括伊立替康 联合使用 (Awada A. 等 (2002)Eur J. Cancer 38， 773-778)。
多西他赛临床上用作破坏肿瘤细胞中微管网络的抗肿瘤药， 它可帮助抑制细胞分 裂。 通过与游离微管蛋白结合， 它促进装配， 且抑制微管解聚 (Chou T. 等 (1991)Synergism and Antagonism in Chemotherapy.New York ： Academic Press)。
材料和方法 ：
在 5 种人癌细胞系中进行药物组合实验 ： T24( 膀胱癌 )、 LnCap( 前列腺 )、 MCF7( 乳 腺 )、 DLCL( 非霍奇金淋巴瘤 ) 和 LCC18( 结肠类癌瘤 )。在 37℃， 分别在其需要的以下培养基中培养和温育各细胞系 ： MEMα(10％ FCS)、 RPMI 1640(10％ FCS)、 DME HG(10％ FCS)、 增 强 RPMI(10％ FCS) 和 Hites 培养基 (5％ FCS)。
将贴壁细胞系 (T24、 LnCap、 MCF7 和 LCC18) 置于 96 孔板中， 保持 24 小时， 然后用 SAHA 和抗癌药处理， 时间可容许细胞附着在孔底。在实验的同一天， 将 DLCL 细胞系悬浮液 置于 96 孔板中。对于 T24、 LnCap、 DLCL 和 LCC18， 将含 2000 个细胞的 200μL 接种到各孔 中。对于 MCF7， 按 4000 细胞 / 孔接种， 以用于该细胞系的慢细胞周期计数。在各 SAHA 和抗 癌药组合实验中， 将细胞接种在两个 96 孔板上。
在处理的同一天， 用细胞系特异性培养基制备所有 SAHA 和组合药物处理。不接受 处理的细胞用作对照组。
为给予处理贴壁细胞系 (T24、 LnCap、 MCF7)， 抽出各孔中的培养基， 用含需要浓度 一种或多种药物的 200μL 培养基替换。对于所有其它细胞系 (OCC18 和 DLCL)， 将含 10 倍 需要浓度的一种或多种药物的 22μL 培养基加入各孔中 200μL 培养基中。
处理后， 将细胞在 37℃下温育 4 天。 在第四天， 用 20μLalamarBlurTM( 一种水性染 料 ) 处理各孔， 在 37℃下温育 4 小时。 当被细胞吸附时， 染料在增殖细胞中的还原大于在非 增殖细胞中的还原， 因为 NADPH、 FADH、 FMNH 和 NADH 的浓度增加。 用 SpectaMax 分光荧光仪微量滴定孔板阅读器 (Molecular Devices Corporation， Sunnyvale， CA)， 通过 荧光测量该还原。数据以荧光发射强度单位表达， 为温育时间的函数， 用 SOFTmax v.4.0 软件 (Molecular Devices Corp.Sunnyvale， CA) 分析。为评价药物处理 4 天后细胞 生长的抑制百分率， 使用下式 ：
100-( 用相同处理的平均强度单位 / 孔 )*100
( 对照组的平均强度单位 / 孔 )
用以下式计算各评价抑制百分率的标准误百分率 ：
100-( 用相同处理的强度单位 / 孔标准误 )*100
( 对照组的强度单位 / 孔标准误 )
使用的每种药物处理浓度根据每种药物抑制 50％增殖的剂量。测试以下浓度 ：
a)50 ％有效剂量 /4 ； b)50％有效剂量 /2 ； c)50 ％有效剂量 ； d)50 ％有效剂量 *2 ； 和 e)50％有效剂量 *4。 在初步实验中测定每种药物抑制 50％增殖的剂量， 其中用多种浓度 的单独 SAHA 和伊立替康、 5-FU 和单独多西他赛处理细胞。 在药物浓度和用各种浓度的抑制 百分率之间定义多项式关系， 用该函数预测抑制 50％细胞增殖所需的每种药物的浓度。
建立以下标准用于评价加和、 协同和拮抗相互作用 ：
如果用 SAHA 加药物组合处理的细胞抑制百分率大于单独用 SAHA 或单独用抗癌药 处理的细胞抑制百分率， 但小于或等于如果纯加和性 ( 即单独用 SAHA 抑制百分率 + 单独用 药物抑制百分率 ) 的药物组合处理预期的细胞抑制百分率， 将观测到加和性相互作用。
如果用 SAHA 加药物组合处理的细胞抑制百分率大于用如果纯加和性 ( 即单独用 SAHA 抑制百分率 + 单独用药物抑制百分率 ) 药物组合处理预期的细胞抑制百分率， 将观测 到协同作用。
如果单独用 SAHA 或单独用抗癌药处理的细胞抑制百分率大于预期的用药物组合 处理的细胞抑制百分率， 将观测到拮抗相互作用。
结果 ：A. 测定 50％细胞增殖有效剂量 ：
分析与增加浓度的 SAHA 组合的伊立替康、 5-FU 和多西他赛的 50％细胞增殖有效 剂量。结果列在表 3 和 4 中。SAHA 和各抗癌药的组合导致抑制 50％细胞生长所需的药物 浓度降低。几乎在每个实验中， 增加 SAHA 浓度导致达到该抑制量的所需药物浓度较低。例 如， 抑制 50％ T24 膀胱癌细胞需要单独的伊立替康 5.1nM ； 但是， 当联合给予 0.625μM SAHA 和伊立替康时， 所需药物浓度减少至 4.1nM。 例如， 当 SAHA 浓度进一步增加至 2.5μM 时， 需 要的伊立替康浓度继续减少 (1.9nM)。
表3： T2450％抑制 . 代表性组合处理的有效剂量
*所有 SAHA 浓度均为 μM。单独 SAHA ： 5.0μM 表4： LnCap 50％抑制 . 代表性组合处理的有效剂量所有 SAHA 浓度均为 μM。单独 SAHA ： 1.7μM
B.SAHA 和伊立替康 ：
在以下 4 种细胞系中测试 SAHA 和伊立替康组合 ： T24、 LnCap、 DLCL 和 LCC18。经 评价， 在所有 4 种细胞系中的相互作用大多数为加和性。
结 果 按 每 种 类 型 相 互 作 用 ( 加 和、 协同和拮抗 ) 占测试的组合处理总作用 (100％ ) 的百分率表示。
表5： 用 SAHA 和伊立替康组合处理后， 不同细胞系中观测到的相互作用
细胞类型 T24 加和 (％ ) 86 协同 (％ ) 0 拮抗 (％ ) 14*58102349927 A CN 102349930 LCC18 DLCL LnCap
说62 50 59明书19 10 25 19 40 1657/58 页在 T24 膀胱癌细胞中， 86％组合处理产生加和相互作用。未报道协同作用。14％ 处理产生拮抗相互作用。加和相互作用发生在高和低浓度 SAHA 和伊立替康处理中 (SAHA ： 0.625-10μM， 伊立替康 ： 2.6-10nM)。
在 LnCap 前列腺细胞系中， 25 ％组合处理产生协同作用。59 ％处理产生加和 相互作用， 该作用大多数发生在中和高浓度 SAHA 和从低到高浓度的伊立替康中 (SAHA ： 0.5-2μM ； 伊立替康 ： 2.6-10nM)。
对 DLCL 进行组合处理， 一半产生加和相互作用， 40％是拮抗性的。拮抗作用大多 数发生在较高浓度。
62％处理的 LCC18 细胞表现加和相互作用， 同时 19％为协同相互作用， 和相同百 分率的拮抗作用。任何浓度范围的 SAHA 对相互作用无特异性， 但所有协同相互作用发生在 低伊立替康浓度 (1.9nM)。
表示个体反应的代表性曲线绘制在图 9 中 (LnCap)。绘制出其它细胞系的类似曲 线 ( 未显示 )。
B.SAHA 和 5- 氟尿嘧啶 ：
与伊立替康组合相同， 多数 SAHA 和 5-FU 组合处理产生加和相互作用。在 4 种细 胞系中测试 SAHA 和 5-FU 组合 ： T24、 LnCap 和 LCC18。
结 果 按 每 种 类 型 相 互 作 用 ( 加 和、 协同和拮抗 ) 占测试的组合处理总作用 (100％ ) 的百分率表示。
表6： 用 SAHA 和 5-FU 组合处理后， 在不同细胞系中观测到的相互作用
细胞类型 T24 LCC18 LnCap
加和 (％ ) 80 49 60 协同 (％ ) 6 7 33 拮抗 (％ ) 14 44 7在 T24 膀胱癌细胞中， 80％组合处理产生加和相互作用。这些作用大多数发生在 中和高浓度 SAHA(2.5μM-10μM)。
在 LnCap 前列腺细胞系中， 33％组合处理产生协同作用。60％处理产生加和相互 作用， 它们大多数发生在中和高浓度 SAHA(1.0-2.0μM)。 多数协同作用发生在低 SAHA 浓度 (0.5μM)
49％ LCC18 处理产生加和相互作用。44％ LCC18 处理产生拮抗作用。相互作用没 有发生在任何具体浓度范围内。
表示个体反应的代表性曲线绘制在图 10 中 (LnCap)。 绘制出其它细胞系的类似曲线 ( 未显示 )。
C.SAHA 和多西他赛 ：
在 T24、 LnCap 和 LCC18 细胞上进行 SAHA 和多西他赛组合实验。
结 果 按 每 种 类 型 相 互 作 用 ( 加 和、 协同和拮抗 ) 占测试的组合处理总作用 (100％ ) 的百分率表示。
表7： 用 SAHA 和多西他赛组合处理后， 在不同细胞系中观测到的相互作用
细胞类型 T24 LCC18 LnCap
加和 (％ ) 80 72 38 协同 (％ ) 5 8 56 拮抗 (％ ) 15 20 6在 T24 膀胱癌细胞中， 80％组合处理产生加和相互作用， 5％相互作用是协同的。
最大的协同作用 (56％ ) 发生在 SAHA/ 多西他赛组合在 LnCap 细胞中的实验中。 该协同作用主要发生在低和中等 SAHA 浓度范围 (0.25-1μM)。38％处理在多数 SAHA 高浓 度 (2.0μM) 中产生加和相互作用。
组合处理 LCC18 细胞， 分别产生 72％的加和作用和 8％协同作用。
表示个体反应的代表性曲线绘制在图 11 中 (LnCap)。 绘制出其它细胞系的类似曲 线 ( 未显示 )。
总之， 这些结果表明通常 SAHA 与伊立替康、 5-FU 和多西他赛相互作用大多数为加 和性。但是， 重要的是 SAHA 和多西他赛在 LnCap 细胞中的相互作用大多数是协同的。在几 个测试浓度中， 发现其它协同作用， 尤其在 LnCap 细胞系中。
结论 ：
以上所有组合研究的结果表明用 SAHA 和其它抗癌药组合治疗可用于癌症疗法， 因为与单一药物疗法相比， 可减少联合疗法中的每种药物的剂量， 同时仍获得整体抗肿瘤 效果。当发现两种药物之间如上所述协同作用时， 组合治疗尤其有用。
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