用于干细胞富集的切向流过滤装置和方法 本申请是申请日为 2004 年 11 月 19 日、 发明名称为 “用于干细胞富集的切向流过 滤装置和方法” 的中国发明专利申请 No.200480034667.8 的分案申请。
相关申请的相互参照
本申请要求 2003 年 11 月 24 日申请的美国临时申请号 60/524,511 的利益， 其全 部公开内容在此引入作为参考。
背景技术 在研究或治疗中常常渴望使用富含干细胞的细胞群体。 干细胞的典型来源包括骨 髓、 全外周血、 白细胞提取法或单采血液成分术的产物， 特别是来自 “动员的” 供体， 或其它 较不常见的来源， 如脐带血和组织或器官悬液。 已经用几种方法进行了干细胞的富集。 典型
的方法包括密度梯度法 ( 例如 红细胞和粒细胞， 这常常通过胶态二氧化硅等等 )、 淘洗法、 离心、 密度梯度离心来完成。 这些方法中的每低渗休克造成红细胞裂解和这些方法的各种组合。举例来说， 从骨髓纯化干细胞需要除去 一个都有缺点， 其中之一是进行富集步骤后需要艰苦的洗涤步骤， 例如除去密度梯度离心 介质。
富集后， 典型地通过重复方法洗涤细胞。该步骤通常包括将富集的细胞悬液放入 离心管中和使用离心机使细胞沉淀至管底。从离心机中取出管子， 并从沉淀细胞中倾倒出 上清液。向管中添加洗液， 并重悬细胞沉淀。这些步骤典型地重复 2 至 4 次。
这种洗涤方法的一个缺点是连续重悬和离心可降低细胞存活力并增加细胞裂解。 离心洗涤的另一个缺点是细菌或其它传染物污染细胞的机会。即使所有的材料保持无菌， 离心管的重复开启、 吸管和洗液瓶暴露于空气仍可以引起污染。 污染风险足够显著， 一些医 疗管理机构已经要求只有 “封闭” 系统才能用于细胞操作。
过滤法也已经用于从血液中除去细胞， 同时保留其它血液成分用于随后使用。这 种方法通常以不可回收的形式将细胞截留于过滤器中， 同时允许其它血液成分通过过滤器 并进入收集容器。 例如， 过滤器可以用来从血液中除去白细胞， 因此使输血后同种免疫反应 的发生率减到最小。白细胞的除去典型地是使用由织结的塑料纤维网制成的过滤器进行 的。通常安排该网将白细胞截留于具有足够厚度的网状基质中， 使得细胞截留遍及过滤器 的厚度， 因此保持过滤器不堵塞， 因为如果白细胞被截留于平面表面将发生堵塞。
除了细胞的物理截留之外， 过滤器的材料和大表面面积允许白细胞不可逆地粘附 于表面。这些粘附细胞中的很多正是一些医疗操作中渴望的细胞。所产生的截留和粘附于 过滤器的组合建立了用于在输血治疗之前除去白细胞的高效率方法。然而， 当白细胞是期 望的细胞时， 这种过滤方法没有益处。
各种颗粒的分级分离中有用的一种方法是切向流过滤 (TFF) 或 “交叉流” 过滤。 TFF 依靠与多孔膜过滤器表面平行的液体运动。膜的小孔允许液体和典型地小于小孔的液 体内的颗粒通过。此外， 与过滤器平行的液体交叉流 ( 或 “切向” 流 ) 防止了大于过滤器表 面上小孔的颗粒的集结。TFF 已被用于各种物质的粗分离。Genovesi(J.Parenter.Aci.Technol.， 37 ： 81， 1983) 已综述了切向流过滤在药物领域中的应用， 包括无菌注射用水的过滤、 溶剂系统的澄 清和从肉汤和细菌培养物过滤酶。 Marinaccio 等 (WO 85/03011) 报道了用于从血浆除去的 血液中除去微粒血液成分的方法， 和 Robinson 等 ( 美国专利 5,423,738) 描述了使用 TFF 从血液中除去血浆， 允许血细胞和血小板再输注给患者。
在其它用途中， 已报道 TFF 用于啤酒的过滤 (EP 0 208 450)， 具体而言是用于除 去微粒如酵母细胞和其它悬浮固体。Kothe 等 ( 美国专利 4,644,056) 公开了 TFF 在从奶或 初乳中纯化免疫球蛋白中的用途， 和 Castino( 美国专利 4,420,398) 描述了它在从含有抗 病毒物质以及病毒颗粒和细胞的肉汤中分离抗病毒物质如干扰素中的用途。 类似地， TFF 已 经用于从细胞碎片中分离细菌酶。(Quirk 等， Enzyme Microb.Technol.， 6： 201， 1984)。此 外， 切向流过滤装置已经用于悬浮于培养基中的细胞的浓缩。 ( 参见例如 Radlett， J； Appl. Chem.Biotechnol.， 22 ： 495， 1972)。
也 已 报 道 了 TFF 根 据 大 小 分 离 脂 质 体 和 脂 质 颗 粒。(Lenk 等， 美国专利 5,948,441)。TFF 允许从脂质体和脂质颗粒的异质群体形成和分离具有限定粒度范围的脂 质体和脂质颗粒。( 参见 Lenk 等， 前述 )。
然而， 尽管 TFF 已经用于生物液体的粗分级分离和例如脂质体的分离， 但是本领 域尚未认识到 TFF 用于分离限定特征不同的活细胞群体的用途。尤其是， 尚未提出与从其 它骨髓细胞或从血细胞和组织或器官悬液中选择性分离干细胞， 同时保持无菌、 细胞存活 力和再生活性相关的独特问题。此外， 目前的方法尚未解决其它细胞群体例如具有重叠粒 度范围的群体的除去。
因此， 本领域还需要从其它骨髓或血液成分， 包括血浆、 红细胞和 / 或血小板选择 性富集干细胞， 同时保持无菌、 细胞存活力以及再生和细胞活性的另外的装置和方法。 本发 明满足了这些和其它需要。 发明内容
本发明涉及从骨髓、 血液和血液制品、 组织和组织或器官制备物分离干细胞或祖 细胞。 特别是， 使用切向流过滤装置制备富含干细胞的细胞群体。 提供了使用该装置制备富 含干细胞群体的方法。 使用本发明的装置和方法获得的富含干细胞等的细胞群体可用于制 备为了例如骨髓重构或损伤组织包括心肌等等的修复的目的而适于输注给个体的组合物。
本发明的切向流过滤装置包括具有交叉流室、 滤液室和在它们之间配置的过滤器 的去除装置。过滤器在一侧 - 渗余物表面， 与交叉流室处于液体互通， 而在另一侧 - 滤液表 面， 与滤液室处于液体互通。 交叉流室具有适于将样品， 如包含干细胞的骨髓或血液成分引 入交叉流室并且与过滤器的渗余物表面平行的入口。交叉流室也提供了出口， 安排在该室 与过滤器的渗余物表面相对部分的中心。 适用于切向流过滤装置的过滤器典型地具有范围 约 1 至约 10 微米的平均孔径。在用于富集干细胞的某些实施方案中， 过滤器具有约 3 至约 7 微米或约 3 至约 5.5 微米的平均孔径。 典型地， 去除装置以一次性使用可任意处理的部件 提供。
此外， 该装置可以包括提供样品进入交叉流室入口的预定进料速度的单元和控制 滤液通过过滤器并进入滤液室的过滤速度的单元。 过滤速度控制单元将过滤速度限制于小于过滤器无压迫的过滤速度。 包含干细胞的样品可以通过来源装置如白细胞提取装置或包 含从例如白细胞提取装置收集的样品的容器等来提供。
切向流过滤装置可以进一步包括回收装置。 回收装置包括可以以环形式与去除装 置的交叉流室相互连接的入口和出口。在该装置的这个实施方案中， 交叉流室入口与回收 装置出口处于液体互通， 而交叉流室出口与回收装置入口处于液体互通。回收装置可以进 一步包括样品入口和洗涤入口。在切向流过滤装置的某些实施方案中， 样品入口和洗涤入 口是单个共用入口。典型地， 洗涤入口与替换物或洗液来源处于液体互通。替换物或洗液 可以是例如等渗缓冲液或组织培养基。
回收装置的样品入口与样品来源如包含干细胞的骨髓或血液成分处于液体互通。 在本发明的一个实施方案中， 包含骨髓或血液成分的样品来源是装有针的注射器或特别设 计用于从供体或患者取出骨髓的专门装置。2002 年 6 月 19 日申请的美国临时专利申请编 号 60/390,730 和 WO 2004/000444 中更详细描述了 TFF 装置和该装置的操作， 在此每篇申 请文件全面引入作为参考。
本发明装置的一个实施方案包括用于富集骨髓样品中的干细胞的切向流过滤装 置。 该装置包括去除装置， 该去除装置包括由过滤器隔开的交叉流室和滤液室， 其中交叉流 室具有入口和出口， 出口安排在该室上部的中心， 而其中入口安排在过滤器上方并将液体 引入与过滤器基本上平行的交叉流室 ； 用于提供样品通过交叉流室入口的预定进料速度的 单元 ； 和用于调节通过过滤器的过滤速度的单元 ； 其中过滤器具有约 5 微米的孔径大小 ； 和 由此样品中的干细胞被富集于交叉流室的渗余物中。 在本发明的另一个实施方案中， 提供了用于富集血液成分样品中的干细胞的切向 流过滤装置， 其中该装置包括去除装置， 其中去除装置包括滤液室之下并由过滤器隔开的 交叉流室， 交叉流室具有入口和出口， 出口安排在该室下部的中心， 而其中入口安排在过滤 器之下并将液体引入与过滤器基本上平行的交叉流室 ； 用于提供样品通过交叉流室入口的 预定进料速度的单元 ； 和用于保持通过过滤器的过滤速度的单元 ； 其中过滤器具有约 5 微 米的孔径大小 ； 和由此样品中的干细胞被富集于交叉流室的渗余物中。
本发明还提供了用于从包含干细胞的骨髓成分、 血液成分、 组织或组织或器官制 备物的样品分离干细胞的方法。该方法步骤包括 ： (1) 将样品通过去除装置中的入口引入 去除装置 ； (2) 使样品经受与具有约 1 至约 10 微米孔径大小的过滤器基本上平行的交叉 流； (3) 使液体通过过滤器经受过滤 ； 和 (4) 从样品中选择性除去非干细胞成分， 形成富含 干细胞的细胞群体。在引入去除装置之前， 样品可以经受通过白细胞提取法、 密度离心、 差 异裂解法、 过滤或血沉棕黄层的制备的部分纯化或富集。 在一个实施方案中， 诱导样品流经 交叉流室中具有涡流运动的过滤器表面。另外， 可以用洗液洗涤富含干细胞的细胞群体。
在本发明的一个特定实施方案中， 使细胞样品， 如包含干细胞的骨髓成分样品接 触包含引起样品中具有类似干细胞公称尺寸的细胞皱缩的试剂的预处理溶液。 皱缩的细胞 易于通过滤过膜提供含更丰富干细胞的细胞群体。在一个具体实施方案中， 诱导经历皱缩 的细胞是粒细胞， 如中性白细胞等等。对这个实施方案有用的一种特定溶液包括例如含含 有效量二甲基亚砜 (DMSO) 的生理学可接受溶液。生理学可接受溶液可以是例如低渗盐溶 液如稀释的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。 可供选择地， 预处理溶液可以包括含有例如糖如甘露醇 或葡萄糖的高渗溶液， 或可以是高渗盐溶液。 在又一个实施方案中， 通过用防止皱缩的细胞
膨胀的试剂处理或预处理细胞样品来防止被诱导皱缩的细胞再膨胀。在一个实施方案中， 抗膨胀试剂是防止酪氨酸磷酸化的试剂， 例如染料木素等等。 在再另一个实施方案中， 抗膨 胀试剂抑制钠 - 氢交换的作用。在又一个实施方案中， 其中悬浮有例如包含骨髓成分的细 胞样品的溶液不含阻断通过防止诱导细胞再膨胀的钠 - 氢交换剂进行氢和钠交换的钠盐。
在本发明的方法中， 从细胞样品中除去的非干细胞成分包括例如基质、 血浆、 血 小板、 红细胞等等。富集的细胞群体可以包含至少约 10％干细胞， 但是典型地包含至少约 20％或更多干细胞。在本发明方法的一个实施方案中， 步骤 (1)、 (2) 和 (3) 重复至少两次 以形成富含干细胞的细胞群体。 富含干细胞的细胞群体可以用于输注给需要干细胞治疗的 患者。
在另外的实施方案中， 富含干细胞的细胞群体可以被诱导形成对治疗有用的其它 细胞类型， 包括例如内皮细胞、 平滑肌细胞、 心肌细胞、 神经元、 树突细胞和其它细胞类型。 各种干细胞诱导方法为本领域技术人员所熟知。
用于本发明方法中的细胞样品典型地是从个体供体收集的。 供体可以是接受干细 胞治疗的患者或另一个个体。 在从供体收集细胞样品之前， 供体可以经历用干细胞动员剂， 例如 M-CSF、 G-CSF、 GM-CSF， 或高或低剂量环磷酰胺等等治疗， 以产生富含造血干细胞的细 + 胞群体。 干细胞动员剂诱导释放入外周血流的 CD34 干细胞增殖。 然后将来自个体供体的骨 髓、 血液例如除去白细胞的样品、 组织或组织或器官制备物引入本发明的切向流过滤 (TFF) 装置。 TFF 装置包括交叉流室、 滤液室和与交叉流室和滤液室处于液体互通的过滤器。 典型 地， TFF 装置中使用的过滤器具有约 3 至约 5.5 微米的孔径大小。富含造血细胞的细胞样 品通过 TFF 装置以预定进料速度和预定过滤速度再循环， 预定进料速度典型地是预定过滤 速度的至少五倍 ； 而预定过滤速度小于过滤器无压迫的过滤速度 ； 提供富含 CD34+ 白细胞 的分离的细胞群体。该方法可以产生基本上无非白细胞血液成分的富集细胞群体， 非白细 胞血液成分包括血浆、 血小板和红细胞。用这种方法产生的富集细胞群体可增加 CD34+ 细 胞的百分比以构成细胞群体的约 2％至约 10％、 约 5％至约 40％或更多。
参考说明书的剩余部分， 对本发明的性质和优点的进一步理解将变得明显。 附图说明 图 1A 直至 1C 描绘了从血液制品样品中分离白细胞以及单核细胞的切向流过滤装 置的实施方案。图 1A 提供了用于富集白细胞的装置的实施方案， 其中交叉流室在过滤室上 方。图 1B 描绘了该装置的正面图， 其中样品进料在过滤器下面而滤液向上通过过滤器进行 单核细胞的富集。图 1C 是图 1B 中描绘的装置的俯视图。
具体实施方案的描述
本发明提供了处理骨髓成分、 血液成分、 组织或组织或器官悬液的非均相混合物 的细胞样品以提供干细胞富集群体的方法。在本发明的一个方面， 提供了通过选择性除去 非干细胞成分例如基质、 血浆、 血小板和 / 或红细胞等等而富集干细胞的方法。在另一个方 面， 提供了从混合物中选择性除去其它大细胞类型， 包括多形核细胞例如粒细胞而富集干 细胞的方法。在一个特定方法中， 可以用皱缩近乎相同大小的非干细胞的试剂处理骨髓样 品使得皱缩的非干细胞通过 TFF 装置的过滤器并与干细胞分离开来。
干细胞富集群体典型地是从包含骨髓成分的样品或液体混合物制备的。在此使
用的术语 “骨髓成分” 是指典型存在于骨髓中的任何物质， 包括典型地以患病以及非患病状 态存在的物质。骨髓成分包括干细胞并可以包括例如淋巴细胞、 单核细胞、 红细胞、 中性白 细胞、 嗜酸性粒细胞、 自然杀伤 (NK) 细胞和 / 或血小板、 可溶或不溶蛋白或蛋白复合物 ( 例 如酶、 免疫球蛋白或免疫球蛋白 - 抗原复合物 )， 或其它大分子成分， 例如脂质或可以物理 分离的全血的任何其它部分， 不论它的精确分子或细胞组成， 包括例如基质、 血浆或血清如 何。
在进行本发明的方法之前， 可以部分富集样品或液体混合物中的干细胞。 术语 “干 + 细胞” 与术语 “前体细胞” “祖细胞” 或 “CD34 细胞” 可互换使用。这些术语包括造血干细 胞， 造血干细胞包括例如淋巴样、 髓样和类红祖细胞， 以及可以产生下列细胞的祖细胞 ： 内 皮细胞 ； 肌细胞， 包括平滑肌细胞和心肌细胞 ； 神经细胞和骨骼细胞， 包括形成骨和软骨的 细胞。
在本发明的某些方面， 使含有多形核细胞 (PMNs) 或粒细胞的细胞群体与干细胞 分离开来。 这个群体典型地含有中性白细胞、 嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞和它们的前体， 且在本申请中被称为 PMNs。
在此使用的术语 “干细胞群体” 是指包括干细胞的任何细胞类群。干细胞群体可 以包括如上那些， 大量干细胞亚型或特定亚型， 例如内皮细胞或肌细胞前体或祖细胞。 术语 “富集” 和 “富含” 意思是使用在此简单描述的和在 2002 年 6 月 19 日申请的美国临时专利 申请编号 60/390,730 和 WO 2004/000444( 每篇在此全面并入作为参考 ) 中更充分描述的 装置处理骨髓成分的混合物， 和遵循本发明方法产生相对于其它成分， 有活力干细胞的百 分比高于原始细胞样品 ( 即富集前 ) 的细胞群体。在此使用的术语 “有活力的” 是指在合 适的培养条件下或再输注给患者或合适的动物模型时能够分化的干细胞。 根据本发明的装置利用切向流过滤富集干细胞群体。术语 “切向流过滤” 和 “交叉 流过滤” 可互换使用并且是指从液体混合物分离悬浮颗粒 ( 例如细胞 )， 包括从液体混合物 中颗粒的非均相混合物分离限定特征 ( 例如期望的粒度范围 ) 的颗粒。使液体混合物 ( 例 如样品液体 ) 在与过滤器基本上平行或相切 ( 例如过滤器表面面对样品液体 ) 的样品室中 通过或循环而分离颗粒， 典型地在少许正压下， 包含浓缩颗粒或干细胞的液体混合物与膜 表面相切持续流动。
通常， 对移入 “滤液” 中的颗粒， 即， 通过过滤器的那部分液体， 和保留在 “渗余物” 中的颗粒的确定取决于各种因素。这类因素包括例如过滤器孔径、 进料速度、 过滤速度、 液 体混合物中颗粒的浓度、 温度和液体混合物的粘度。在此使用的 “孔径大小” 是指过滤器中 小孔的平均尺寸。 “进料速度” 是指样品 ( 例如液体混合物 ) 引入放置过滤器的室中的速 度。 在样品通过过滤器再循环多次时 ( 例如在根据本发明的装置的一个特定实施方案中 )， 进料速度也被称为 “再循环速度” 。 “交叉流” 是指液体混合物基本上平行 ( 即， 在任何方向 上都与过滤器表面平行 ) 流过过滤器。 “交叉流动速度” 是指样品或液体混合物在过滤器上 方或基本上平行于过滤器流动的速度。液体混合物的交叉流动速度通常取决于各种参数， 包括例如进料速度和放置过滤器的室的大小和形状。 “过滤速度” 是指液体混合物通过过滤 器的流动速度。根据本发明的装置和方法的过滤速度典型地是小于无压迫 ( 即空心管 ) 的 过滤速度。 “排出速度” 是指液体混合物从交叉流室除去的速度， 不同于通过过滤器的液体 混合物 ( 即滤液 )。排出速度通常等于进料速度减去过滤速度。
在此使用的术语 “过滤器” 是指由任何材料或组合材料制成且具有很多小孔的任 何物品， 小孔允许样品或液体混合物的一种或多种成分 ( 例如血液和 / 或骨髓成分 ) 经受 穿过该物品的交叉流而使它通过， 由此将那些成分 ( 例如非干细胞、 蛋白质、 血浆、 血清、 血 小板等等 ) 与其它成分 ( 例如干细胞 ) 分开。过滤器表面可以具有任何合适的面积， 例如 直径约 42 至约 145mm， 尽管可以使用更大或更小面积的过滤器。在某些实施方案中， TFF 装 置中仅仅使用一个过滤器。在其它实施方案中， TFF 装置中可以使用另外的过滤器。
典型地在本发明 TFF 装置中使用的过滤器可以选自各种有机聚合物过滤器。这种 过滤器包括但不限于尼龙、 聚偏 1， 1- 二氟乙烯 (PVDF)、 醋酸 / 硝酸纤维素、 聚砜、 聚碳酸酯、 聚乙烯、 聚酯、 聚丙烯和聚酰胺的微孔膜。还可以使用其它过滤器， 如陶瓷过滤器和金属过 滤器。可以使用亲水性和疏水性、 带电荷和不带电荷的过滤器。在某些应用中， 可以优选亲 水性过滤器。
本发明的过滤器典型地包括穿越过滤器区域分布的很多小孔。在某些实施方案 中， 过滤器具有孔径大小细微变化的很多小孔。例如， 孔径大小的变化性可以是约 ±20％， 或在约 ±0 ％至约 ±20 ％的范围内。在典型的实施方案中， 使用 “核微孔” 或 “径迹蚀刻 (track etched)” 过滤器 ( 例如， 聚乙烯或聚碳酸酯径迹蚀刻滤膜 (Osmonics， Minnetonka， MN))。这些过滤器在材料中典型地具有严格控制的孔径大小的光滑表面。这 种过滤器典型地通过无孔塑料平片暴露于足够有力穿透塑料薄片的放射性微粒源来制备。 然后通过暴露于化学溶剂或蚀刻剂扩大 “径迹” 直径。径迹蚀刻条件可以控制孔径大小。
本发明利用骨髓、 血液、 组织或组织或器官悬液中各种细胞类型之间的差异来富 集干细胞。这样的差异可以包括例如大小、 形状和 / 或可变形性的差异。人骨髓、 血液、 组 织或组织或器官悬液中细胞的大小和可变形性典型地依据细胞类型而变化。红细胞 ( 红血 细胞 ) 典型地是双凹盘形、 无核、 大直径约 7 微米尺寸和相对可变形的。多形核白细胞典型 地是球状的， 同样约 7 微米， 但是比红细胞可变形性小。单核的细胞中， 淋巴细胞典型地是 7 至 10 微米， 而单核细胞通常在 10 至 15 微米范围之内。干细胞通常与单核细胞尺寸范围 相同。
在各个实施方案中， 选择过滤器孔径大小以富集干细胞， 和 / 或分级分离骨髓、 血 液成分、 组织或组织或器官悬液， 从而富集收集的干细胞细胞群体。例如， 在某些实施方案 中， 使用具有约 5 微米孔径大小的过滤器通过 TFF 可以分离具有 10 至 15 微米公称直径的 干细胞， 和具有 7 微米公称直径的红细胞。 在其它实施方案中， 过滤器孔径大小可以在约 1 至约 10 微米， 约 3 至约 8 微米， 或 约 3 至约 5.5 微米的范围内。孔径大小在约 3 微米范围内的过滤器可以保留大多数干细胞 和白细胞， 并致使从干细胞除去红细胞的效率较低。相比之下， 孔径大小在约 8 微米范围内 的过滤器可以实现红细胞的更有效除去， 但是增加滤液中干细胞和白细胞的损失。典型地 使用约 3 至约 5.5 微米孔径大小的过滤器富集干细胞。
从其它骨髓、 血液、 组织或组织或器官悬液成分富集干细胞还可能受进料速度、 过 滤速度和 / 或样品或液体混合物中细胞浓度的影响。例如， 红细胞比其它细胞类型更易变 形， 因此更容易通过孔径大小小于红细胞大直径 ( 例如小于约 7 微米 ) 的过滤器。在具体 实例中， 使用孔径大小约 5.5 微米的过滤器可以将红细胞与白细胞分离。
从其它细胞骨髓成分或组织或器官悬液成分富集干细胞还可能受到在相同进料
或再循环速度下， 保持小于无压迫 ( 即空心管 ) 过滤速度的过滤速度的影响。在其它实施 方案中， 通过保持大于过滤速度的进料或再循环速度可以减少白细胞至滤液的损失。在示 例性实施方案中， 进料或再循环速度可以是过滤速度的至少约五倍， 至少约 10 倍， 至少约 20 倍， 至少约 50 倍， 或至少约 100 倍。
用于通过 TFF 进行干细胞分级分离的包含各种骨髓成分、 血液成分、 组织或组织 或器官悬液的样品或液体混合物可以从各种来源获得， 并可以包括任何不同处理阶段的血 液制品的液体混合物。例如， 骨髓和血液来源可以是人或非人。此外， 液体混合物可以是例 如骨髓、 全血、 全血的各种稀释物、 或已经受例如除去血浆或其它血液成分的处理的全血或 血液稀释物、 或组织或器官悬液。 因此， 液体混合物可以包括例如已至少部分富集干细胞的 血细胞群体。
骨髓或血液成分、 骨髓或血细胞的群体、 或组织或器官悬液可以用本领域技术人 员已知的方法来制备。这类方法典型地包括收集肝素化骨髓或血液、 单采血液成分术或白 细胞提取法、 暗黄覆盖层的制备、 玫瑰花结、 离心、 密度梯度离心 ( 例如密度梯度材料包括 蔗糖等等 )、 非白细胞的差异裂解法、 过滤等等。 包含骨髓或血液成分的液体混合物可以随意任选被稀释或浓缩。例如， 在某些实 施方案中， 骨髓或血液成分以 1 ∶ 2、 1 ∶ 5、 1 ∶ 10 或任何其它合适的稀释度稀释。骨髓或 血液成分可以稀释于例如等渗缓冲液 ( 例如 PBS 或 HEPES 缓冲盐水 )、 组织培养基等等中。 6 8 典型地， 经受 TFF 的骨髓或血液成分的样品具有每毫升约 10 至约 10 个细胞的细胞浓度， 其中至少 10 至 20％是干细胞。 此外， PMNs 数量从细胞数量的约 60 至约 75％减少至约 50％ 或更少。
骨髓或血细胞群体， 或组织或器官悬液可以根据干细胞富集群体的期望用途， 从 各种类型的受试者获得。例如受试者可以是健康受试者。可供选择地， 细胞可以从需要骨 髓重构的受试者获得， 例如由于化疗治疗， 已经发现具有受损骨髓的癌症患者。 骨髓或血细 胞群体还可以从已经给予干细胞动员剂例如 M-CSF、 GM-CSF、 G-CSF、 或低或高剂量环磷酰胺 的个体收集 (Deliliers 等， Leuk.Lymphoma 43 ： 1957， 2002) 等等。该个体可以是将接受富 集细胞群体的患者， 亲戚或 HLA 匹配个体。
如图 1A 直至 1C 描绘的根据本发明的装置典型地包括交叉流室 (3) 和滤液室 (4)。 过滤器 (5) 位于两者之间并且一个表面与交叉流室 ( 渗余物表面 ) 进行液体流通而另一个 表面与滤液室 ( 滤液表面 ) 进行液体流通。交叉流室、 滤液室和过滤器包括去除装置 (1)。 去除装置可以以一次性使用可任意处理的部件提供、 灭菌并为用于本发明的分离方法作准 备。去除装置部件可以用于待富集干细胞的每个样品。在本发明的一个特定实施方案中， 交叉流室典型地具有约 55ml 的容积， 而滤液室具有约 25ml 的容积。过滤器直径典型地基 本上与交叉流室的直径相同。在用于证明本发明实用性的某些实施方案中， 过滤器直径为 约 140mm 至约 143mm。
在本发明的方法中， 液体混合物通过典型地邻近过滤器的渗余物表面的液体入口 (6) 进入交叉流室 (3)， 使得液体混合物 ( 例如样品 ) 进入与过滤器的渗余物表面基本上平 行的该室。典型地， 液体通过液体出口 (7) 从交叉流室 (3) 除去， 液体出口 (7) 通常位于垂 直于过滤器的渗余物表面的一部分交叉流室。 在某些示范性实施方案中， 交叉流室入口 (6) 直径约 7mm 至约 8mm， 而交叉流室出口 (7) 直径约 8mm 至约 10mm。滤液通过滤液室 (4) 中
的出口 (8) 除去。
典型地， 液体混合物以足够的进料速度引入交叉流室， 该进料速度足以使穿过过 滤器表面 ( 渗余物表面 ) 的液体混合物交叉流处于足够高的速度， 以致在过滤器的接触表 面， 即分界层， 温和地破裂和逆向混合液体和细胞。在此使用的 “分界层” 是指邻近于和在 过滤器的渗余物侧的那个液体层， 典型地由液体通过过滤器留下的那层。分界层的这种破 裂通过防止过滤器接触表面的物质与过滤器粘结或变得停滞而促进有效过滤， 与过滤器粘 结或变得停滞会阻碍有效过滤。然而， 液体混合物的进料速度通常不足以引起大量白细胞 裂解。
在某些实施方案中， 骨髓或血液成分通过将液体混合物泵入交叉流室 (3) 而通过 过滤器的渗余物表面。用于驱动液体交叉流穿过过滤器的泵称为 “交叉流泵” 或 “再循环 泵” (14)。交叉流泵可以包括与交叉流室 (3) 进行液体流通足以将液体混合物引入该室并 以特定进料速度穿过过滤器， 不引起细胞实质性破坏 ( 例如细胞裂解 ) 的任何泵送装置。 适 合用于本发明的交叉流泵可以包括例如蠕动泵、 活塞泵、 隔膜泵或滚柱泵。例如， 在期望维 持 TFF 装置为 “封闭” 系统的一部分的情况下， 可以使用蠕动泵。
液体混合物典型地以超过过滤速度的进料速度泵入交叉流室 (3)。在示范性实施 方案中， 进料速度约 1680ml/ 分钟， 而过滤速度约 15ml/ 分钟。在其它示范性实施方案中， 进料速度约 1600 至约 1800ml/ 分钟， 而过滤速度约 10 至约 20ml/ 分钟。 非干细胞物质 ( 例 如， 红细胞、 免疫复合物、 蛋白质、 PMNs 等等 ) 通过过滤器 (5) 进入滤液室 (4)。 如上所讨论， 过滤速度典型地小于无压迫的 ( 即空心管 ) 速度。过滤速度可以通 过例如降低或限制滤液室出口的大小、 使用第二个泵单元 ( 例如 “过滤泵” ) 限制流动等等 来控制。
在另一个示范性实施方案中， 液体混合物引入装置导致液体内产生涡流运动。这 可以如下进行， 例如通过引入液体混合物， 基本上平行于圆柱形交叉流室中的环形过滤器， 以例如过滤速度的约 5 或约 10 至约 100 倍的进料速度。流通物通过位于垂直于过滤器且 典型地与过滤器表面中心相邻的圆柱形室中的出口 (7) 除去。这种布置引起液流朝向过滤 器的中心向内螺旋。该液流典型地不汹涌或不处于使得引起干细胞实质性裂解的高速度。 如上所讨论， “交叉流” 也可以 “擦洗” 过滤器表面以防止粘结或停滞在分界层。通过校准进 料速度使得它相对于过滤速度大 ( 例如至少约 5 倍 )， 所产生的干细胞富集群体当与相对于 样品细胞群体中总细胞数量的干细胞百分比相比时， 可以为至少约 5％， 或至少约 20％， 或 至少约 60％或更多干细胞。
在另一个示范性实施方案中， 使渗余物再循环以提高分离效率。 例如， 可以将包含 骨髓或血液成分、 或组织或器官制备物的液体混合物引入交叉流室， 和在过滤期间， 渗余物 可以通过交叉流室中的液体出口 (7) 收回到另一个室， 例如最初提供液体的室 (“回收装 置” ； (2))。回收装置中的液体混合物接着可以再次引入交叉流装置。通过以 “环形式” 连 接回收装置 (2) 和去除装置 (1)， 可以完成液体混合物的连续再循环和过滤。可供选择地， 渗余物可以通过交叉流室 (3) 的液体出口 (7) 收回并直接再次引入交叉流室入口 ( 即， 不 通过回收装置或另一个室 )。液体混合物可以通过交叉流装置任何合适的一段时间。在某 些实施方案中， 液体混合物可以再循环约 5 至约 60 分钟或更长时间， 以达到期望的干细胞 纯度或富集。
在又一个实施方案中， 液体混合物的体积可以通过添加缓冲液、 洗液或其它溶液 ( 统称为 “替换液” ) 来调节。洗液可以例如在回收装置中 ( 例如通过溶液入口 ； (13))、 在 去除装置中、 在泵 (14) 中、 在伸向或来自去除装置的管线中、 或在任何其它方便的位置与 液体混合物合并。渗余物中的细胞因此可以以相同操作被富集和洗涤。典型地， 洗液与细 胞等渗。 合适的缓冲液和洗液可以包括各种缓冲液 ( 例如， 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或 HEPES 缓冲盐水 ))、 组织培养基等等。
在某些实施方案中， 在封闭的无菌系统中富集包含来自， 例如， 骨髓、 血液、 组织、 或组织或器官制备物的细胞群体的细胞样品中的干细胞群体。这里使用的术语 “封闭的无 菌系统” 或 “封闭系统” 是指其中使对非无菌、 周围或循环空气或其它非无菌条件的暴露减 到最少或消除的系统。 富集细胞群体的封闭系统通常排除在开口管中离心、 露天转移细胞、 在组织培养平板或未密封瓶中培养细胞等等。 整个过滤装置， 包括， 例如， 任何细胞容器、 培 养箱、 组织培养容器或用于细胞处理的其它装置 ( 下文 ) 可以维持为 “封闭” 系统。在典型 的实施方案中， 封闭系统允许干细胞的无菌富集， 和任选地， 从初始收集容器转移至可密封 的组织培养容器中， 不暴露于非无菌空气。典型地， 蠕动泵 ( 图 1A 和 1C ； (15)) 单元用于封 闭系统。 在本发明的另一个方面， 通过从混合物选择性除去非干细胞骨髓或血液成分， 包 括， 例如， 基质、 血浆、 血小板、 红细胞等等， 基本上富集骨髓或血液成分、 或组织或器官悬液 的非均相混合物中的干细胞。在此使用的术语 “基本上富集” 是指渗余物中回收的细胞群 体， 在如期望多的再循环周期后， 包含典型地至少约 5％， 更典型地至少约 20％， 或至少约 60％的期望细胞类型 ( 例如干细胞 )。 在其它实施方案中， 富集骨髓或血液成分等等的非均 相混合物中的干细胞而形成基本上无非干细胞成分的干细胞群体。在此使用的术语 “基本 上无” 是指干细胞富集群体包含至少约 10％至约 50％干细胞。
已经确定了某些变量影响本装置的性能。例如， 过滤器的孔径大小、 液体的总体 积、 再循环和过滤速度， 以及这两个速度之间的比率和运行时间可以影响干细胞的产量。 为 确定任选的干细胞分离条件， 利用参数的变化进行分离运行， 其中以定时的间隔对细胞浓 缩物 ( 渗余物 ) 和滤液采样以监测随时间推移的性能。由这些结果， 可以确定任选的过滤 器孔径、 总的系统容积、 再循环和过滤速度。
在本发明这个方面的示范性实施方案中， TFF 装置包括约 55ml 容积的交叉流室 (3) 和约 25ml 容积的滤液室 (4)。此外， 该装置包括下列 ： 具有约 1 至约 10 微米、 更典型地 约 2 至约 8 微米、 或甚至更典型地约 3 至约 5 微米的孔径大小的许多小孔的过滤器 ； 过滤器 直径约 142mm。在这个实施方案中， 进料速度设置为约 1600 至约 1800ml/ 分钟 ； 和过滤速 度约 12 至约 17ml/ 分钟。初始液体混合物典型地具有每毫升至少约 107 个细胞 ( 例如白 细胞和其它细胞 ) 的细胞浓度。用本发明实施方案获得的富集干细胞群体包含约 1.1 至约 2 千万个细胞， 干细胞占总细胞数量的约 10％至约 20％。
在本发明的另一个方面， 通过从混合物选择性除去非干细胞成分， 包括例如从混 合物除去基质和淋巴细胞， 基本上富集骨髓或血液成分的非均相混合物中的干细胞。在此 使用的术语 “选择性除去” 是指优先除去一种细胞类型并富集另一种细胞类型。在这个方 面的示范性实施方案中， TFF 装置包括约 55ml 容积的交叉流室 (3) 和约 25ml 容积的滤液室 (4)。此外， 该装置包括下列 ： 具有约 1 至约 10 微米、 或约 2 至约 8 微米、 或约 3 至约 5 微米
的孔径大小的过滤器 ； 约 1600 至约 1800ml/ 分钟的进料速度 ； 约 12 至约 17ml/ 分钟的过滤 速度 ； 过滤器直径约 142mm。初始液体混合物典型地具有每毫升至少约 107 个细胞 ( 例如干 细胞和其它细胞 ) 的细胞浓度。在这个实施方案中， 该装置以逆向方式运行。
在本发明又一个实施方案中， 来自骨髓、 血液、 组织或来自组织或器官制备物的血 液成分的非均相混合物被预处理以促进与干细胞具有类似大小和可变形性的某些细胞类 型的除去。这类细胞可以包括多形核粒细胞， 包括中性粒细胞、 嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细 胞等等。在一个实施方案中， 这种预处理包括使骨髓或血液成分接触可以实现渗透压梯度 穿过细胞膜的试剂， 从而通过水流出而诱导细胞皱缩。这种试剂可以包括并不限于二甲基 亚砜、 甘油、 氯化钠等等。当使用 DMSO 时， DMSO 的有效终浓度可以是约 5％至约 20％， 或约 10％至约 15％。在特定实施方案中， 有效 DMSO 浓度是约 12.5％或约 15％。DMSO 可以溶于 具有低离子强度的缓冲液或生理学可接受溶液。可以使用的另一个试剂是甘油。甘油的有 效量是 0.5mol/L 至约 2.5mol/L。在具体实施方案中， 甘油终浓度是约 1mol/L。细胞与这 些试剂的接触可以导致不需要的粒细胞裂解。通过顺序暴露于 DMSO 和甘油可以进行裂解。 使用的溶液可以包括具有低渗透强度的溶液介质。 诱导的非期望细胞皱缩使得这些细胞更 易受通过过滤而除去的作用并允许通过切向流过滤选择性除去这些细胞群体。 还可以包括 有效量的防止分离过程中细胞再膨胀的试剂。 这种试剂可以包括但不限于防止酪氨酸磷酸 化的试剂如染料木素， 或抑制钠 - 氢交换剂作用的试剂。
富集细胞群体的培养、 扩充和分化
在本发明的一个实施方案中， 本发明的方法用于获得可用于产生对例如同种异体 或自体移植有用的组合物的干细胞富集群体。 在特定实施方案中， 遵循切向流分离操作， 进 一步富集干细胞富集群体中的造血干细胞。从外周血白细胞来源富集造血干细胞的方法 是本领域已知的并可以被改动而用于如在此所述分离的干细胞富集群体。例如， 使用例如 + 免疫磁性分离技术富集可以进一步干细胞富集群体中的 CD34 ( 参见例如 Rowley 等， Bone Marrow Transplant.21 ： 1253， 1998 ； Denning-Kendall et al.， Br.J.Haematol.105 ： 780， 1999)。骨髓或血液供体可以从接受移植的患者、 近亲、 HLA 匹配个体等等分离。
在又一个实施方案中， 本发明的方法也用于获得非干细胞亚型， 例如富含祖细胞 ( 例如造血或内皮祖细胞 ) 或分泌感兴趣因子 ( 例如造血或血管生成生长因子 ) 的细胞的 细胞群体。例如， 通过例如 VEGFR-2 和 AC133( 以及例如 VE- 钙黏着蛋白和 E- 选择蛋白 ) 的共表达， 循环内皮祖细胞 (CEPs) 可以被鉴定为循环 CD34+ 细胞亚型。 ( 参见例如 Peichev 等， Blood 95 ： 952， 2000.)。可以使用， 例如使用针对 VEGFR-2 和 AC133 的抗体的免疫磁性 分离技术进一步富集白细胞富集群体中的 CEPs。同样， 在从供体分离细胞群体和使用 TFF 富集之前， 可以动员个体供体中的 CEPs。 在这个方法中， 可以用细胞因子， 例如 VEGF 治疗供 体。( 参见例如， Gill 等， Circ Res.， 88 ： 167， 2001)。此外， 在其它实施方案中， 通过白细胞 富集群体与例如 VEGF、 bFGF、 IGF-1、 EGF 和 FBS 一起在纤连蛋白覆盖的表面上培养， 然后弃 去非粘附细胞而获得内皮样循环血管发生细胞 (CACs)( 该细胞分泌例如 VEGF、 HGF、 G-CSF 和 GM-CSF)( 参见例如 Rehman 等， Circulation 107 ： 1164， 2003)。
此外， 可以培养干细胞富集群体以诱导多能祖细胞或干细胞的扩充。 例如， 通过与 造血生长因子例如 IL-1、 IL-3、 IL-6、 干细胞因子 (SCF)、 粒细胞 - 单核细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 和 G-CSF( 参见， 例如 Sun 等， Haematologica 88 ： 561， 2003) 的组合一起培养， 可以体外扩充 CD34+ 干细胞。随后可以用任何各种细胞因子和生长因子处理祖细胞或干细胞 以诱导分化为造血或非造血系的细胞。
在其它实施方案中， 干细胞富集群体可以在适于诱导分化 ( 例如祖细胞的分 化或更分化细胞类型例如单核细胞或源自单核细胞的树突细胞的转分化 ) 的条件下培 养。( 这里使用的 “转分化” 是指分化细胞的表型调节过程， 通常无需任何细胞分裂， 由 此分化细胞分化为形态和 / 或功能上不同的细胞类型 )。例如， 除分化为树突细胞之外， 单核细胞可以被转变为其它造血或非造血细胞类型， 包括例如巨噬细胞、 破骨细胞和内皮 样细胞， 取决于培养条件 ( 参见， 例如 Becker 等， J.Immunol.139 ： 3703， 1987 ； Nicholson 等， Clin Sci.99 ： 133， 2000 ； Havemann 等， in Novel Angiogenic Mechanisms ： Role of CirculatingProgenitor Endothelial Cells 47-57(Nicanor I.Moldovan 编辑， 2003))。 而且， 白细胞富集群体可以在使用任何各种细胞因子或生长因子诱导相对未分化细胞亚型 ( 例如多能祖细胞和干细胞 ) 分化为造血或非造血系的条件下培养。这种分化可以在用本 领域技术人员已知的方法扩充细胞之前或之后诱导。
在本发明的某些实施方案中， 干细胞富集的细胞群体可以用于影响需要再生或种 群恢复的人中细胞或组织的再生或种群恢复。 这种人可以罹患给予干细胞将有益于患者的 任何病情， 包括帕金森氏病、 糖尿病、 慢性心脏病、 肾病、 肝衰竭、 癌症、 脊髓损伤、 多发性硬 化、 早老性痴呆， 或可能需要基因治疗以预防遗传或外遗传缺陷的患者的任何病情。
在本发明的某些实施方案中， 干细胞的受体是自体的或可以是对供体同种异体 的。受体可能需要骨髓再生， 因为该个体已经历重度骨髓抑制治疗。在另一个实例中， 该受 体可能需要心脏组织修复， 因为该个体已经历心肌梗塞或正罹患充血性心力衰竭或心功能 不全。在任何一种情况下， 都可以将用本发明方法分离的富集干细胞群体输入循环中。在 已经历心肌梗塞或正罹患心功能不全或心力衰竭的受体中， 可以将干细胞富集群体直接输 入冠状动脉或直接应用于受损的心脏组织。 给予干细胞和干细胞富集群体的方法和组合物 是本领域技术人员已知的并且认为不是本发明的新颖性的一部分。 具体实施方式
提供下列实施例仅仅作为本发明各个方面的例证且不应被看作是以任何方式限 制本发明。
实施例 1 ：
这个实施例简短描述了从自正常供体收集的骨髓样品富集干细胞群体。 在通过切 向流过滤富集之前， 用皱缩诱导剂处理骨髓样品。简言之， 从正常志愿者髋骨抽取 50ml 骨 髓， 添加 15ml 补充有组胺的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 防止凝固。贮存过夜后， 这种制备物的 三分之一 ( 约 33ml) 与 33ml 30％二甲基亚砜 (DMSO) 混合于水中。在室温下孵育 10 分钟 后， 添加 3ml 25％人血清白蛋白 (HSA) 溶液并将混合物装填到上面简单描述的， 而在 2002 年 6 月 19 日申请的美国临时专利申请编号 60/390,730 和 WO 2004/000444( 每篇在此引入 作为参考 ) 中充分描述的切向流过滤装置的再循环室中。两次容积调整后， 混合物中的细 胞受到切向流过滤， 连续添加含 0.625％ HSA 的 PBS。在运行结束时， 收集细胞并分析。发 + 现该制备物基本上清除了红细胞和血小板。CD34 细胞百分比从总细胞数量的 4.78％增加 至 18.2％， 而荧光流分析测定的中性白细胞闸门中的细胞百分比从 53.9％减少至 51.7％。中性白细胞闸门中细胞的平均前向散射从大约 400 减少至大约 250， 表明细胞损害。 迄今为 止最佳的方法由用 DMSO 和 PBS 的混合物处理骨髓吸出物 10-20 分钟， 随后在 TFF 装置上过 滤 60 分钟组成。DMSO 休克导致 PMN′ s 皱缩， 对存在的其它细胞群体无附带损害。结果是 + + + CD34 /CD45 和 CD133 细胞群体的浓缩， 同时提供数量减少的 PMN 细胞和淋巴细胞群体。在 一个方案中， 用含 DMSO 的稀释 PBS 处理骨髓吸出物 20 分钟， 随后添加人血清白蛋白 ( 为了 细胞的稳定 ) 和随后加载到 TFF 装置上。结果可以变化， 取决于进料的具体细胞浓度。表 I 阐明了两个运行实例。
表 I. 来源于两名志愿者骨髓吸出物的细胞制备物在 TFF 系统上进行干细胞浓缩 后的表征
运行 1 起始 BM CD34+/45+ CD133+/45PMN’ s CD3 TFF 运行之后 CD34+/45+ CD133+/45PMN’ s CD3 18％ 未测定 53％ 7％ 13％ 1.3％ 53％ 10％ 5％ 未测定 74％ 16％ 4.2％ 0.01％ 66％ 18％ 运行 2表 I 显示了由于细胞大小的减小和通过 TFF 系统的除去造成 PMN′ s 的部分减少 从最初高达 74％至 53％。CD34+/45+ 细胞群体的富集是运行 1 中从 5％至 18％， 和运行 2 中 从 4.2％至 13％。此外， 淋巴细胞群体有减少， 运行 1 中从 16％至 7％， 和运行 2 中从 18％ 至 10％。回收的祖细胞数量是运行 1 中 1.1 千万和运行 2 中 1.6 千万， 远远超过这里参照 的临床试验中回收的数量。这些源自骨髓的干细胞能够起正常干细胞作用， 因为已经进行 了集落形成试验， 短时期内颤动集落形成。应当注意的是如运行 2 中所示， CD133+ 细胞也存 在于分离和浓缩的干细胞群体中， 起始物质中存在 0.1％而最终制备物中存在 1.3％。
实施例 2
这个实施例描述了如上所述的富含干细胞的细胞群体将如何用于治疗已经患有 急性心肌梗塞的患者。简言之， 在植入支架后， 将 TFF 从骨髓纯化的干细胞进料已经历急性 心肌梗塞患者的冠状动脉。 随后心肌重塑导致左心室最终容积增加并使死于随后心力衰竭
的机会降低。
在此提供的实施例意欲阐明而不是限制要求保护的本发明的范围。 本发明的其它 变形对于本领域普通技术人员是显而易见的并且被附加权利要求所包含。 在此引用的所有 出版物、 专利、 专利申请和其它参考文献也在此引入作为参考。