靶向神经元和神经胶质人类胚胎干细胞系.pdf

本发明涉及包含靶向基因构建体的人类干细胞系，并且特别涉及包含经由同源重组插入Olig2基因座内的报道基因的人类胚胎干细胞系(hESC)。hESC系仍是多能的，并且维持正常核型，并且允许通过荧光显微镜检查和通过FACS的分选显现Olig2。因为Olig2在运动神经元和少突胶质细胞的发育中是重要的，所以本发明提供了研究干细胞分化成运动神经元和少突胶质细胞，以及研究影响此种分化的固有和外源性因子的方法。本发明的hESCs还提供了研究和测定用于细胞分化的优化因子和条件的方法。

1.  包含靶向进入基因内的报道基因的人类干细胞，所述基因在分化前在所述人类干细胞中不表达。

2.  权利要求1的人类干细胞，其中所述人类干细胞是胚胎干细胞。

3.  权利要求1的人类干细胞，其中所述报道基因靶向进入olig2基因座内。

4.  权利要求1的人类干细胞，其中所述报道基因编码荧光蛋白质。

5.  权利要求1的人类干细胞，其中所述荧光蛋白质选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。

6.  权利要求1的人类干细胞，其中所述报道基因通过同源重组靶向。

7.  分离的干细胞系，其包含权利要求1的人类干细胞。

8.  体外细胞培养物，其包含权利要求1的人类干细胞。

9.  生物体，其包含权利要求1的人类干细胞。

10.  组织，其包含权利要求1的人类干细胞。

11.  筛选化合物的方法，其包括：
a)提供包含靶向进入基因内的报道基因的人类干细胞，所述基因在分化前在所述人类干细胞中不表达；
b)使所述人类干细胞与所述至少一种化合物接触；
c)培养所述人类干细胞；和
d)就所述报道基因的表达测定所述人类干细胞。

12.  权利要求11的方法，其中所述测定通过选自荧光显微镜检查和荧光激活细胞分选的方法来执行。

13.  权利要求11的方法，其中所述培养包括在这样的条件下培养所述人类干细胞，使得允许所述人类干细胞分化。

14.  权利要求11的方法，其中提供了多个细胞，并且所述接触步骤包括在高流通量测定法中使所述多个细胞与化合物文库接触。

15.  权利要求11的方法，其中所述化合物选自蛋白质、肽、多肽和小有机化合物。

16.  权利要求11的方法，其中所述人类干细胞是胚胎干细胞。

17.  权利要求11的方法，其进一步包括选择化合物的步骤。

18.  权利要求17的方法，其进一步包括在人类动物中测试所述化合物的步骤。

19.  权利要求18的方法，其进一步包括包装所述化合物用于在动物中使用的步骤。

20.  筛选神经毒素的方法，其包括提供：
a)提供包含插入Olig2基因座内的报道基因的人类干细胞；
b)使所述人类干细胞与怀疑是神经毒素的所述至少一种化合物接触；和
c)就所述报道基因的表达测定所述人类干细胞。

21.  权利要求20的方法，其中所述测定通过选自荧光显微镜检查和荧光激活细胞分选的方法来执行。

22.  权利要求20的方法，其中所述人类干细胞是胚胎干细胞。

靶向神经元和神经胶质人类胚胎干细胞系
发明领域
本发明涉及包含靶向基因构建体的人类干细胞系，并且特别涉及包含经由同源重组插入Olig2基因座内的报道基因的人类胚胎干细胞系。
发明背景
人类干细胞具有充当实验模型以研究在体内不易取得的人类发育的方面的潜力。人类干细胞还具有在研究负责疾病发作和进展的分子和细胞机制中有用的潜力。Menedez等人，Current Gene Ther.5：375-85(2005)。
其为位于染色体中的DNA序列与新引入的DNA序列的同源重组的基因靶向提供了用于特异性改变哺乳动物基因组的方法。Thomas和Capecchi，Cell 51：503-512(1987)。基因靶向已应用于小鼠胚胎干细胞(mESC)系，以研究神经元分化。Xian等人，Stem Cells 21：41-49(2003)描述了包含关于Olig2基因座的GFP敲入的mESCs(RW4ES)的产生。Xian和Gottlieb，Glia 47：88-101(2004)报告了GFP-Olig2敲入mESCs的使用(如Xian 2003中所述)。Xian等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.327：155-162(2005)描述了GFP-Olig2敲入小鼠的使用(Xian，2003)，以开发用RA和Shh的培养条件，用于ES细胞沿着神经通路的快速和有效分化以用于HTS潜力。
然而，人类干细胞中的基因靶向已证明是困难的。Zwaka和Thomson，Nature Biotech.21：319-321(2003)报告难以达到在人类胚胎干细胞(hESCs)中高的、稳定转染率，并且对于mESCs建立的电穿孔方案在hESCs中工作很差。Yates和Daley，Gene Ther.13(20)：1431-9)(2006)报告HR(同源重组)在hESCs中未广泛采用(与mESCs比较)，并且迄今仅存在3个HR靶向hESC系(2个HPRT系和1个Oct4系)。根据该作者，这是部分由于在将DNA转染到hESCs内遇到的主要困难。此外，迄今，仍未靶向在未分化的人类干细胞中未表达的基因。
因此，本领域需要在基因中包含靶向突变的人类干细胞系，所述基因在未分化的人类干细胞中表达。
发明概述
本发明涉及包含靶向基因构建体的人类干细胞系，并且特别涉及包含经由同源重组插入Olig2基因座内的报道基因的人类胚胎干细胞系。因此，在某些实施方案中，本发明提供了包含插入基因内的报道基因的人类干细胞，所述基因在分化前在所述人类干细胞中不表达。在某些实施方案中，人类干细胞是胚胎干细胞。在某些实施方案中，报道基因插入olig2基因座内。在某些实施方案中，报道基因编码荧光蛋白质。在某些实施方案中，荧光蛋白质选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含前述人类干细胞的分离的干细胞系。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含前述人类干细胞的体外细胞培养物。在某些实施方案中，本发明提供了包含前述人类干细胞的生物体。在再进一步的实施方案中，本发明提供了包含前述人类干细胞的组织。
在某些实施方案中，本发明提供了筛选化合物的方法，其包括：a)提供包含插入基因内的报道基因的人类干细胞，所述基因在分化前在所述人类干细胞中不表达；b)使所述人类干细胞与所述至少一种化合物接触；c)培养所述人类干细胞；和d)就所述报道基因的表达测定所述人类干细胞。在某些实施方案中，人类干细胞包含插入Olig2基因座内的报道基因。在某些实施方案中，测定通过选自荧光显微镜检查和荧光激活细胞分选的方法来执行。在某些实施方案中，培养包括在这样的条件下培养所述人类干细胞，使得允许所述人类干细胞分化。在某些实施方案中，提供了多个细胞，并且所述接触步骤包括在高流通量测定法中使所述多个细胞与化合物文库接触。在某些实施方案中，化合物选自蛋白质、肽、多肽和小有机化合物。在某些实施方案中，人类干细胞是胚胎干细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括选择化合物的步骤。在某些实施方案中，该方法进一步包括在人类动物中测试所述化合物的步骤。在某些实施方案中，该方法进一步包括包装所述化合物用于在动物中使用的步骤。
在某些实施方案中，本发明进一步提供了筛选神经毒素的方法，其包括提供：a)提供包含插入Olig2基因座内的报道基因的人类干细胞；b)使所述人类干细胞与怀疑是神经毒素的所述至少一种化合物接触；和c)就所述报道基因的表达测定所述人类干细胞。在某些实施方案中，测定通过选自荧光显微镜检查和荧光激活细胞分选的方法来执行。在某些实施方案中，人类干细胞是胚胎干细胞。

附图描述
图1提供了关于人类Olig2的序列。
图2提供了本发明的Olig2报道基因(绿色荧光蛋白)构建体的序列。
定义
如本文所使用的，术语“干细胞”意指全能或多能或多潜能的并且能够分化成一个或多个不同细胞类型的细胞。
如本文所使用的，术语“胚胎干细胞”意指衍生自受精后约7天的胚胎的干细胞。
如本文所使用的，术语“成人干细胞”意指衍生自出生后的生物体的干细胞。
如本文所使用的，术语“中胚层细胞系”意指显示与中胚层细胞相关的特征的细胞系。
如本文所使用的，术语“内胚层细胞系”意指显示通常与内胚层细胞相关的特征的细胞系。
如本文所使用的，术语“神经细胞系”意指显示通常与神经细胞系相关的特征的细胞系。此种特征的例子包括但不限于，GFAP、神经元特异性烯醇酶、Neu-N、神经丝-N或tau的表达。
如本文所使用的，术语“全能的”意指细胞分化成分化生物体中的任何细胞类型，以及胚胎外材料例如胎盘的细胞的能力。
如本文所使用的，术语“多能的”指能够分化成任何分化的细胞类型的细胞系。
如本文所使用的，术语“多潜能的”指能够分化成至少2个分化的细胞类型的细胞系。
如本文所使用的，术语“分化”如就分化细胞系统中的细胞而言使用的，指通过其细胞从一个细胞类型(例如，多潜能、全能或多能的可分化细胞)分化成另一个细胞类型例如靶分化细胞的过程。
如本文所使用的，术语“细胞培养”指细胞的任何体外培养。这个术语内包括的是连续细胞系(例如具有永生化表型)、原代细胞培养、有限细胞系(例如非转化细胞)、和在体外维持的任何其他细胞群体，包括卵母细胞和胚胎。
如本文所使用的，术语“报道基因”或“报道构建体”指包括编码蛋白质的核酸的遗传构建体，所述蛋白质可容易地检测或可容易地测定，例如有色蛋白质、荧光蛋白质或酶例如β-半乳糖苷酶。
如本文所使用的，术语“基因靶向”指外源DNA整合到细胞基因组内在其中它的表达可以合适地控制的位点处。这种整合作为同源重组的结果而发生。
如本文所使用的，“敲入”方法指经由同源重组将所需核酸序列例如编码报道基因的序列插入宿主细胞中的特定基因座内的操作。
如本文所使用的，术语“基因组”指生物体的遗传材料(例如染色体)。
术语“目的核苷酸序列”指任何核苷酸序列(例如RNA或DNA)，其的操作可以由本领域普通技术人员认为由于任何原因(例如治疗疾病、赋予改良的特性、目的蛋白质在宿主细胞中的表达、核酶的表达等)希望的。此种核苷酸序列包括但不限于，结构基因(例如报道基因、选择标记基因、癌基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码序列，和不编码mRNA或蛋白质产物(例如启动子序列。多腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)的非编码调节序列。
如本文所使用的，术语“目的蛋白质”指由目的核酸编码的蛋白质。
如本文所使用的，术语“外源基因”指在宿主生物体或细胞中非天然存在的基因，或人工引入宿主生物体或细胞内的基因。
术语“基因”指包含产生多肽或前体(例如胰岛素原)所需的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留全长或片段的所需活性或功能性质(例如酶促活性、配体结合、信号转导等)。该术语还包含结构基因的编码区，并且包括在任一末端上位于编码区邻近在5’和3’末端上约1kb或更多的距离的序列，从而使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5’并且存在于mRNA上的序列称为5’非翻译序列。位于编码区的3’或下游并且存在于mRNA上的序列称为3’非翻译序列。术语“基因”包含基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含由称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列间隔的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可以包含调节元件例如增强子。内含子从核或原始转录物中去除或“剪接掉”；内含子因此不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译过程中作用于指定新生多肽中的氨基酸顺序或次序。
如本文所使用的，术语“基因表达”指基因中编码的遗传信息通过基因的“转录”(即，经由RNA聚合酶的酶促作用)转换成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程，并且对于蛋白质编码基因，通过mRNA的“翻译”转换成蛋白质的过程。基因表达可以在该过程中的许多阶段处进行调节。“上调”或“激活”指增加基因表达产物(即，RNA或蛋白质)的生产的调节，而“下调”或“阻遏”指减少生产的调节。涉及上调或下调的分子(例如，转录因子)通常分别称为“激活物”或“阻遏物”。
如本文所使用的，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”、“DNA编码”、“RNA序列编码”和“RNA编码”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸沿着脱氧核糖核酸或核糖核酸链的次序或顺序。这些脱氧核糖核酸或核糖核酸的次序决定氨基酸沿着多肽(蛋白质)链的次序。DNA或RNA序列因此编码氨基酸序列。
如本文所使用的，术语“互补的”或“互补性”就通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)而言使用。例如，序列“5′-A-G-T-3′”与序列“3′-T-C-A-5′”互补。互补性可以是部分的，其中仅某些核酸的碱基根据碱基配对原则相匹配。或者，在核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。这在扩增反应中，以及依赖核酸之间的结合的检测方法中特别重要。
术语“同源性”或“同一性百分比”当就核酸而言使用时，指互补性程度。存在部分同源性(即部分同一性)或完全同源性(即完全同一性)。部分互补的序列是至少部分抑制完全互补的序列与靶核酸序列杂交的序列，并且涉及使用功能术语“基本上同源的”。完全互补的序列与靶序列的杂交的抑制可以使用杂交测定法(DNA或RNA印迹、溶液杂交等)在低严格性条件下进行检查。基本上同源的序列或探针(即能够与另一种目的寡核苷酸杂交的寡核苷酸)将竞争且抑制完全同源的序列与靶序列在低严格性的条件下的结合(即杂交)。这并不是说低严格性条件是这样的，使得允许非特异性结合；低严格性条件需要2个序列彼此的结合是特异性(即选择性)相互作用。非特异性结合的不存在可以通过使用第二种靶进行测试，所述第二种靶缺乏甚至部分互补性程度(例如，小于约30％同一性)；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不与第二种非互补靶杂交。
本领域众所周知的是可以采用众多等价条件，以包括低严格性条件；考虑因子诸如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)以及靶(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等)的性质以及盐和其他组分(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)的浓度，并且杂交溶液可以改变以产生与上文列出的条件不同但等价的低严格性杂交的条件。此外，本领域已知在高严格性条件下促进杂交的条件(例如增加杂交的温度和/或洗涤步骤、在杂交溶液中使用甲酰胺等)。
当就双链核酸序列例如cDNA或基因组克隆而言使用时，术语“基本上同源的”指在如上所述的低严格性条件下可以与双链核酸序列的任一或两条链杂交的任何探针。
当就单链核酸序列而言使用时，术语“基本上同源的”指在如上所述的低严格性条件下可以杂交(即它是......的互补体)单链核酸序列的任何探针。
如本文所使用的，术语“杂交”就互补核酸的配对而言使用。杂交和杂交的强度(即核酸之间的结合强度)受此种因子如核酸之间的互补性程度、涉及的条件的严格性、形成的核酸的T_m、和核酸内的G：C比的影响。在其结构内包含互补核酸的配对的单个分子被说成是“自杂交的”。
如本文所使用的，术语“T_m”就核酸的“解链温度”而言使用。解链温度是在其下双链核酸分子的群体变得一半解离成单链的温度。用于计算核酸的T_m的等式是本领域众所周知的。如由标准参考文献指示的，T_m值的简单估计可以通过等式进行计算：T_m＝81.5+0.41(％G+C)，当核酸在1M NaCl下的水溶液中时(参见例如，Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization，in Nucleic AcidHybridization[1985])。其他参考文献包括考虑结构以及序列特征用于计算T_m的更复杂计算。
如本文所使用的，术语“严格性”就在其下进行核酸杂交的温度条件、离子强度和其他化合物例如有机溶剂的存在使用。用“高严格性”条件，核酸碱基配对将仅在具有高频率的互补碱基序列的核酸片段之间发生。因此，“弱”或“低”严格性条件通常是衍生自遗传上不同的生物体的核酸需要的，因为互补序列的频率通常较少。
“高严格性条件”就核酸杂交而言使用时，包括等价于在42℃下在溶液中结合或杂交的条件，所述溶液由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄·H₂O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调整至7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成，随后为在包含0.1X SSPE、1.0％SDS的溶液中在42℃下洗涤，当采用长度约500个核苷酸的探针时。
“中等严格性条件”就核酸杂交而言使用时，包括等价于在42℃下在溶液中结合或杂交的条件，所述溶液由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄·H₂O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调整至7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成，随后为在包含1.0X SSPE、1.0％SDS的溶液中在42℃下洗涤，当采用长度约500个核苷酸的探针时。
“低严格性条件”就核酸杂交而言使用时，包括等价于在42℃下在溶液中结合或杂交的条件，所述溶液由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄·H₂O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调整至7.4)、0.1％SDS、5X Denhardt′s试剂[50X Denhardt′s每500ml包含：5gFicoll(类型400，Pharamcia)、5g BSA(部分V；Sigma)]和100μg/ml变性鲑精DNA组成，随后为在包含5X SSPE、0.1％SDS的溶液中在42℃下洗涤，当采用长度约500个核苷酸的探针时。
如本文所使用的，术语“以可操作的组合”、“以可操作的次序”和“可操作地连接”指核酸序列以这样的方式连接，使得产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。该术语还指氨基酸序列以这样的方式连接，使得产生功能蛋白质。
如本文所使用的，术语“调节元件”指控制核酸序列表达的一定方面的遗传元件。例如，启动子是促进可操作地连接的编码区的转录起始的调节元件。其他调节元件是剪接信号、多腺苷酸化信号、终止信号、RNA输出元件、内部核糖体进入位点等(下文定义)。
真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短排列组成，所述DNA序列与涉及转录的细胞蛋白质特异性相互作用(Maniatis等人，Science 236：1237[1987])。启动子和增强子元件已从各种真核来源中分离，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞以及病毒中的基因(类似的控制元件，即启动子也在原核生物中发现)。特定启动子和增强子的选择依赖待使用何种细胞类型以表达目的蛋白质。某些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其他的在有限的细胞类型子集中起作用(关于综述，参见Voss等人，Trends Biochem.Sci.，11：287[1986]；和Maniatis等人，同上)。例如，SV40早期基因增强子在来自许多哺乳动物物种的广泛多样的细胞类型中非常活跃，并且已广泛用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质(Dijkema等人，EMBO J.4：761[1985])。在广泛范围的哺乳动物细胞类型中活跃的启动子/增强子元件的2个其他例子是来自人类延长因子1α基因(Uetsuki等人，J.Biol.Chem.，264：5791[1989]；Kim等人，Gene 91：217[1990]；以及Mizushima和Nagata，Nuc.Acids.Res.，18：5322[1990])以及劳斯肉瘤病毒(Gorman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777[1982])和人类巨细胞病毒(Boshart等人，Cell 41：521[1985])的长末端重复的那些。
如本文所使用的，术语“启动子/增强子”指包含能够提供启动子和增强子功能(即，由启动子元件和增强子元件提供的功能，参见上文关于这些功能的讨论)的序列的DNA区段。例如，逆转录病毒的长末端重复包含启动子和增强子功能。增强子/启动子可以是“内源”或“外源”或“异源的”。“内源”增强子/启动子是在基因组中与给定基因天然连接的那种。“外源”或“异源”增强子/启动子是借助于基因操作(即分子生物学技术例如克隆和重组)放置与基因并列的那种，从而使得那种基因的转录由连接的增强子/启动子指导。
如本文所使用的，术语“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”指，当与目的核苷酸序列连接时，能够控制目的核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。启动子一般尽管不一定位于它控制其转录成mRNA的目的核苷酸序列的5’(即上游)，并且提供通过RNA聚合酶的特异性结合和其他转录因子的位点用于起始转录。
启动子可以是组成型或调节型的。术语“组成型”当就启动子而言使用时，意指启动子在不存在刺激(例如，热休克、化学制品等)的情况下能够指导可操作地连接的核酸序列的转录。相比之下，“调节型”启动子是在刺激(例如，热休克、化学制品等)的存在下能够指导可操作地连接核酸序列的转录水平的启动子，其不同于在不存在刺激的情况下可操作地连接的核酸序列的转录水平。
如本文所使用的，术语“体外”指人为环境以及在人为环境内发生的过程或反应。体外环境可以由试管和细胞培养组成，但不限于试管和细胞培养。术语“体内”指自然环境(例如动物或细胞)以及在自然环境内发生的过程或反应。
发明详述
本发明涉及包含靶向基因构建体的人类干细胞系，并且特别涉及包含经由同源重组插入所需基因座内的报道基因的人类胚胎干细胞系。在某些实施方案中，人类干细胞系是人类胚胎干细胞(hESC)系。在某些实施方案中，人类干细胞系仍是多能的，维持正常核型，并且允许检测基因的基因表达，所述基因当人类干细胞系处于未分化状态时不表达，但当分化成特定细胞类型时表达。在某些优选实施方案中，基因表达通过插入的报道基因的表达进行检测。在某些实施方案中，报道基因编码荧光蛋白质，并且基因表达通过荧光显微镜检查或通过FACS的分选进行检测。
在某些优选实施方案中，人类干细胞系包含经由同源重组插入Olig2基因座内的报道基因。Olig2是在中枢神经系统中的运动神经元和少突胶质细胞分化中起关键作用的转录因子。脊髓的pMN结构域中的Olig2⁺细胞产生运动神经元和少突胶质细胞，具有用于治疗脊髓损伤和其他运动神经元病症例如MS和ALS的潜力的细胞类型。因为Olig2在运动神经元和少突胶质细胞的发育中是重要的，所以本发明提供了研究干细胞分化成运动神经元和少突胶质细胞，以及研究影响此种分化的固有和外源性因子的方法。本发明的人类干细胞系还提供了研究和测定用于细胞分化的优化因子和条件的方法。
A.报道基因构建体
在某些实施方案中，遗传构建体包含编码报道基因的核酸，所述报道基因插入或“敲入”人类干细胞中的所需基因座内。用于产生遗传构建体用于在产生敲入细胞系中使用的方法和用于产生该细胞系的技术是本领域技术人员已知的，并且可以在例如下述中发现：Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory；Yoo等人，2003，Neuron，37：383；Watase等人，2002，Neuron，34：905；Lorenzetti等人，2000，HumanMolecular Genetics，9：779；和Lin等人，2001，Human MolecularGenetics，10：137。
在某些实施方案中，本发明的报道基因构建体包含侧面为5’核酸序列和3’核酸序列的编码报道基因的核酸序列，所述5’核酸序列与目的靶基因同源，所述3’核酸序列与目的基因序列同源。在某些实施方案中，报道基因核酸序列与5′和3′侧翼序列在框内，从而使得当报道基因构建体经由同源重组插入靶基因内时，表达包含功能报道基因产物例如绿色荧光蛋白的融合蛋白。
本发明并不限于任何特定报道基因核酸序列的使用。事实上，考虑了各种报道基因核酸序列的使用。在一个实施方案中，本发明提供了关于用编码荧光蛋白质的报道基因转染干细胞的组合物和方法，其中所述蛋白质的表达提供了无需处死细胞在干细胞中跟踪表达分析的可靠方法。在某些实施方案中，报道基因编码荧光蛋白质，其中荧光蛋白质发出例如绿色、红色、黄色、青色(例如水绿色或青绿色)、蓝色、黄色(GenBank登记号AY278271)、橙色(Genbank登记号AY278265)、橙红色(GenBank登记号AY278270)或橙黄色(GenBank登记号AY678267)荧光。编码荧光蛋白质的荧光基因的例子可以在例如Promega Corporation、Invitrogen、Clontech、Stratagene、BDBiosciences Pharmingen、Evrogen JSC商购获得。荧光蛋白质源于各种来源，例如海洋无脊椎动物、暗礁珊瑚虫等，并且包括但不限于来自Aqueorea、Montastrea(GenBank登记号AY218848)、Zoanthus、Discosoma和Heterectis属。另外的荧光蛋白质的例子可以在例如美国专利号6,884,620和6,645,761中发现。本发明并不限于荧光蛋白质编码基因，并且考虑来自任何来源的任何荧光编码基因用于与本发明一起使用。在某些实施方案中，编码荧光蛋白质的基因已通过用于哺乳动物翻译机器的密码子优化进行优化用于哺乳动物表达。
在一个实施方案中，本发明提供了关于用编码酶促蛋白质的报道基因转染干细胞的组合物和方法，其中所述蛋白质的表达提供了无需处死细胞在干细胞中跟踪表达分析的可靠方法。例如，报道酶促蛋白质的表达在底物利用后提供光输出。产生光作为底物(例如萤光素、腔肠素)利用的副产物的此种酶促蛋白质的例子包括但不限于，萤光素酶、β-半乳糖苷酶和β-内酰胺酶。萤光素酶编码报道基因(例如萤火虫属物种(Photinus sp.)(GenBank登记号AY738222)、海肾属物种(Renilla sp.)(GenBank登记号AF025844)、光叩甲属物种(Pyrophorus sp.)(GenBank登记号AY258591和AY258593)等)从Promega Corporation、Stratagene和Clontech商购可得，例如，β-半乳糖苷酶编码报道基因从Promega Corporation和Clontech商购可得，并且例如，β-内酰胺酶编码报道基因可从Invitrogen获得。在某些实施方案中，发光产生报道基因已通过用于哺乳动物翻译机器的密码子优化进行进一步优化用于哺乳动物表达。
本发明并不限于任何特定5’和3’靶基因侧翼序列的使用。事实上，考虑了各种5’和3’靶基因侧翼序列的使用。例如，可以靶向各种不同基因，并且可以靶向不同区域中的基因。在某些优选实施方案中，靶基因是在未分化的干细胞中不表达或基本上不表达的基因。在某些特别优选的实施方案中，靶基因是人类Olig2。因此，在某些优选实施方案中，报道基因构建体包含与人类Olig2同源的5′和3′侧翼序列[图2，SEQ ID NO：1]，其中侧翼序列侧接报道基因核酸序列。在某些优选实施方案中，5′和3′侧翼序列长度约5-约10千碱基，并且与SEQ ID NO：1中的相应序列95％-100％同源。在某些特别优选的实施方案中，基因靶向构建体对应于SEQ ID NO：2。
在进一步优选的实施方案中，报道基因构建体进一步包括可选标记。本发明并不限于任何特定可选标记的使用。事实上，考虑了各种可选标记的使用，包括但不限于，显性可选标记，例如在哺乳动物细胞中赋予对于药物G418的抗性的细菌氨基糖苷3’磷酸转移酶基因(也称为neo基因)，赋予对于抗生素潮霉素的抗性的细菌潮霉素G磷酸转移酶(hyg)基因，和赋予在霉酚酸的存在下生长的能力的细菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(也称为gpt基因)。其他可选标记不是显性的，因为它们的使用必须与缺乏相关酶活性的细胞系结合使用。非显性可选标记的例子包括与tk^-细胞系结合使用的胸苷激酶(tk)基因、与CAD缺陷细胞结合使用的CAD基因、和与hprt^-细胞系结合使用的哺乳动物次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因。可选标记在哺乳动物细胞系中的使用的综述在Sambrook，J.等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1989)第16.9-16.15页中提供。
B.干细胞系
本发明并不限于任何特定类型的人类干细胞的使用。事实上，考虑了各种类型的人类干细胞的使用。用于获得来自人类、猴、小鼠、大鼠、猪、牛和绵羊的全能或多能细胞的方法先前已得到描述。参见例如，美国专利号5,453,357；5,523,226；5,589,376；5,340,740；和5,166,065(所有这些通过引用特别合并入本文)；以及Evans等人，Theriogenology 33(1)：125-128，1990；Evans等人，Theriogenology 33(1)：125-128，1990；Notarianni等人，J.Reprod.Fertil.41(Suppl.)：51-56，1990；Giles等人，Mol.Reprod.Dev.36：130-138，1993；Graves等人，Mol.Reprod.Dev.36：424-433，1993；Sukoyan等人，Mol.Reprod.Dev.33：418-431，1992；Sukoyan等人，Mol.Reprod.Dev.36：148-158，1993；Iannaccone等人，Dev.Biol.163：288-292，1994；Evans & Kaufman，Nature 292：154-156，1981；Martin，Proc Natl Acad Sci USA 78：7634-7638，1981；Doetschman等人Dev Biol 127：224-227，1988)；Giles等人Mol Reprod Dev 36：130-138，1993；Graves & Moreadith，Mol ReprodDev 36：424-433，1993和Bradley等人，Nature 309：255-256，1984。
灵长类动物胚胎干细胞(ESCs)可以优选通过美国专利号5,843,780和6,200,806中公开的方法获得，所述专利各自通过引用合并入本文。灵长类动物(包括人类)干细胞也可以得自商业来源，例如WiCell，Madison，WI。用于分离ESCs的优选培养基是“ES培养基”。ES培养基由80％达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；无丙酮酸盐、高葡萄糖配方，Gibco BRL)与20％胎牛血清(FBS；Hyclone)、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)、1％非必需氨基酸母液(Gibco BRL)组成。优选地，胎牛血清批次通过测试低传代mESC系(ES_jt3)——仅为了这个测试目的开发的细胞系——的克隆铺平板效率进行比较。FBS批次必须进行比较，因为已发现批次在其支持胚胎细胞生长的能力方面显著不同，但就支持胚胎细胞测定FBS批次的能力的任何其他方法将充当备选。
在ES培养基的存在下，在鼠类胚胎成纤维细胞的汇合层上分离灵长类动物ESCs。胚胎成纤维细胞优选得自来自远亲杂交的CF1小鼠(SASCO)的12天大的胎儿，但其他品系可以用作备选。组织培养皿优选用0.1％明胶(I型；Sigma)进行处理。恒河猴胚胎的回收已得到证实，具有平均0.4-0.6活胚胎/恒河猴/月的回收，Seshagiri等人Am J Primatol 29：81-91，1993。来自绒猴的胚胎收集也得到充分证明(Thomson等人″Non-surgical uterine stagepreimplantation embryo collection from the common marmoset，″J Med Primatol，23：333-336(1994))。此处，通过短暂暴露于链霉蛋白酶(Sigma)从胚泡中去除透明带。对于免疫外科，胚泡暴露于在DMEM中1∶50稀释的兔抗绒猴脾细胞抗血清(用于绒猴胚泡)或1∶50稀释的兔抗恒河猴(用于恒河猴胚泡)30分钟，随后在DMEM中洗涤5分钟3次，随后暴露于1∶5稀释的豚鼠补体(Gibco)3分钟。
在DMEM中进一步洗涤2次后，通过轻轻吸液从完整的内细胞团(ICM)中去除裂解的滋养外胚层细胞，并且使ICM在小鼠灭活的(3000拉德γ辐射)胚胎成纤维细胞上铺平板。7-21天后，用在立体显微镜下的直接观察用微量吸管从内胚层长出中取出ICM衍生的团，暴露于补充有1％鸡血清的0.05％Trypsin-EDTA(Gibco)3-5分钟，并且经由火焰抛光的微量吸管通过轻轻吸液而轻轻分离。
将分离的细胞再次铺平板在新鲜的ES培养基中的胚胎饲养层上，并且就菌落形成进行观察。个别选择证实ESC样形态的菌落，并且如上所述再次分开。ESC样形态定义为具有高核质比和显著核仁的致密菌落。随着培养物变得密集，所产生的ESCs随后每1-2周通过短暂胰蛋白酶消化或暴露于达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(不含钙或镁并且含2mM EDTA)进行常规分离。早期传代细胞也在液氮中进行冷冻且贮存。
在某些实施方案中，利用脐带血干细胞或脐带基质干细胞。此种干细胞的来源是本领域已知的。Brunstein等人，Br.J.Haematol.137(1)：20-35(2007)；Sun等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.354(4)：919-23(2007)；McGuckin等人，Acta Neurobiol.Exp.66(4)：321-9(2006)；Riodan等人，Transl.Med.30：5-8(2007)；Weiss等人，Stem Cell Rev.2(2)：155-62(2006)。
在某些实施方案中，将上文描述的报道基因构建体引入所需细胞系内。本发明不受引入方法的限制。在某些优选实施方案中，报道基因构建体通过电穿孔引入所需干细胞系内。在某些实施方案中，所采用的条件在下文实施例2中描述。在某些优选实施方案中，电穿孔在低电压和低电容的条件下进行。在某些优选实施方案中，电压为约150V-约350V，并且最优选约250V。在某些优选实施方案中，电容为约150-350μF，优选约250μF。在某些实施方案中，干细胞系在电穿孔前无需饲养细胞进行培养。在某些实施方案中，在电穿孔后，干细胞系在饲养细胞系优选小鼠胚胎成纤维细胞上铺平板。在某些实施方案中，干细胞系在电穿孔优选Accutase^TM后用酶进行收获。电穿孔后，在优选实施方案中，使用抗生素优选G418选择包含报道基因构建体的克隆。在优选实施方案中，G418为约50-200μg/ml的剂量。
在优选实施方案中，将报道基因构建体引入在未分化的干细胞中不表达的基因内。如下文实施例中所述，报道基因在未分化的干细胞中不表达的事实使克隆的选择和细胞系的发育变得复杂，所述细胞系正确表达报道基因，因为细胞在鉴定报道基因的表达前必须进行诱导以分化。认为例示的人类干细胞系是第一种人类干细胞系，以包含在未分化的干细胞中不表达的基因中的靶向插入。本文描述的方法可以用于靶向在未分化的干细胞中不表达的其他所需基因。在优选实施方案中，本发明的细胞系仍是多能或全能的，具有正常核型，并且允许通过例如荧光显微镜检查或荧光激活细胞分选的方法显现报道基因。在优选实施方案中，报道基因的表达充当用于使细胞分化成特定细胞类型的标记。在优选实施方案中，当靶向Olig2时，标记基因的表达在分化成运动神经元和少突胶质细胞的过程中发生。
C.细胞系的使用
本发明的细胞系具有各种用途。特别地，本发明的细胞系用于筛选对于调节人类干细胞分化成所需细胞类型例如少突胶质细胞和运动神经元有用的化合物，用于鉴定在细胞类型例如运动神经元和少突胶质细胞的再生或生长中可能有用的化合物，从而使得可以治疗脊髓损伤和中枢神经系统的疾病或病症，并且用于筛选神经毒性的化合物。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了筛选测定法。本发明的筛选方法利用包含插入目的基因座例如olig2基因座内的报道基因的干细胞系。例如，在某些实施方案中，本发明提供了筛选化合物的方法，所述化合物改变(例如阻断或触发)插入目的基因座内的报道基因的表达。化合物或试剂可能干扰转录，通过例如与包含在目的基因座内的基因的启动子区相互作用。备选地，化合物或试剂可能干扰其为目的基因座的生物活性的上游或下游的途径。
在一种筛选方法中，候选化合物就其影响插入目的基因座内的报道基因的表达的能力进行评估。在优选实施方案中，目的基因座中的基因是在未分化的干细胞中不表达的基因。在某些实施方案中，候选化合物对目的基因座中的基因表达的影响通过检测包含报道基因构建体的细胞的荧光水平进行测定。在其他实施方案中，mRNA表达可以通过任何合适的方法进行检测。
特别地，本发明提供了用于鉴定调节剂即候选或测试化合物或试剂(例如蛋白质、肽、拟肽、类肽、小分子或其他药物)的筛选方法，所述调节剂与插入的报道构建体上游的启动子结合，或者与结合插入的报道构建体上游的启动子的蛋白质或蛋白质的表达相互作用，其对例如插入的报道构建体的表达具有抑制(或刺激)作用。因此鉴定的化合物可以用于在治疗方案中直接或间接调节靶基因产物(例如Olig2)的活性，以阐述靶基因产物的生物功能，或鉴定破坏正常靶基因相互作用的化合物。例如调节Olig2的活性或表达的化合物在与中枢神经系统的功能相关的疾病治疗中有用，并且对于在治疗对于运动神经元和少突胶质细胞的损伤中有用。
在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选候选物或测试化合物的测定法，所述候选物或测试化合物改变目的基因例如Olig2的表达，所述基因在特定细胞类型例如运动神经元或少突胶质细胞的分化过程中表达。在另一个实施方案中，本发明提供了用于筛选候选物或测试化合物的测定法，所述候选物或测试化合物与蛋白质结合，或调节蛋白质的活性，所述蛋白质改变目的基因例如Olig2的表达。
本发明的测试化合物可以使用在本领域已知的组合文库方法中的众多方法中的任何来获得，包括生物文库；类肽文库(具有肽的功能性，但具有新的、非肽主链的分子的文库，所述分子对酶促降解有抵抗力但仍保留生物活性；参见例如，Zuckennann等人，J.Med.Chem.37：2678-85[1994])；可空间寻址的平行固相或液相文库；需要重叠合法的合成文库方法；‘单珠单化合物’文库方法；和使用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库和类肽文库方法优选与肽文库一起使用，而其他4种方法可应用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。
用于合成分子文库的方法的例子可以在本领域中发现，例如在下述中：DeWitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909[1993]；Erb等人，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 91：11422[1994]；Zuckermann等人，J.Med.Chem.37：2678[1994]；Cho等人，Science 261：1303[1993]；Carrell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33.2059[1994]；Carell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061[1994]；和Gallop等人，J.Med.Chem.37：1233[1994]。
化合物的文库可以存在于溶液中(例如Houghten，Biotechniques13：412-421[1992])、或在珠(Lam，Nature 354：82-84[1991])、芯片(Fodor，Nature 364：555-556[1993])、细菌或孢子(美国专利号5,223,409；通过引用合并入本文)、质粒(Cull等人，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 89：18651869[1992])上、或在噬菌体上(Scott和Smith，Science 249：386-390[1990]；Devlin Science 249：404-406[1990]；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382[1990]；Felici，J.Mol.Biol.222：301[1991])。
在一个实施方案中，测定法是基于细胞的测定法，其中使表达插入目的基因座内的报道基因的细胞与测试化合物接触，并且测定测试化合物调节报道基因的表达的能力。测定测试化合物调节报道基因表达的能力可以通过监控例如荧光、发光、颜色等中的变化来完成。合适的监控方法包括但不限于，荧光激活细胞分选(FACS)和荧光显微镜检查。
在某些其他实施方案中，本发明的细胞用于毒性测试。在某些实施方案中，使本发明的细胞与怀疑是毒素的化合物接触，并且报道基因的表达得到修饰。在某些优选实施方案中，化合物怀疑是神经毒素。
在某些实施方案中，本发明的细胞在高流通量筛选测定法中使用。在某些实施方案中，高流通量筛选测定法用于鉴定潜在药物。在某些优选实施方案中，本发明的细胞用于筛选药物，所述药物对于治疗神经学病状有用，或对于治疗中枢神经系统的组分例如运动神经元和少突胶质细胞的损伤有用。
在进一步的实施方案中，本发明的细胞用于监控在靶细胞类型的分化过程中对固有或外源性因子的应答。在某些优选实施方案中，靶细胞类型是运动神经元或少突胶质细胞。在某些实施方案中，本发明的细胞用于鉴定用于开发所需细胞类型的细胞的优化条件，所述细胞类型例如运动神经元或少突胶质细胞。
实施例
实施例1
hOlig2-EGFP敲入载体的产生
包含Olig2基因的人BAC克隆购自Invitrogen(目录#RP11-585D4)。使用同源重组在DH5α中构建靶向载体。hOlig2的翻译起始密码子命名为+1位置自始至终用于描述Olig2基因。为了产生靶向构建体，pENTR1a(Invitrogen)进行修饰以在DH5α中作为低拷贝质粒生长，再命名为pStartK，并且用作模板以扩增在attL1和attL2外的片段。引物包含与hOlig2的侧翼序列同源的2个突出端，从而使得当这个PCR产物转化成ET感受态的hOlig2 BAC时，由于如由氨苄青霉素选择的同源重组，全长hOlig2基因以及其～2kb上游和其～5.3kb下游序列拉出到pStartK内。所产生的质粒命名为pStartK-hOlig2，并且它的序列通过限制测序进行验证。随后，扩增包含hOlig2外显子2(分别为-19至+30和+976至+1025)的总共100bp同源臂、2个AscI位点和cat(编码氯霉素的基因)的片段，并且与pStartK-hOlig2一起共转染到ET感受态的DH5α内，寻求由cat替换hOlig2外显子2，并且所产生的质粒通过氯霉素和氨苄青霉素进行选择。阳性质粒通过部分测序进行验证，并且命名为pStartK-hOlig2cam。pStartK-hOlig2cam随后通过AscI进行消化，并且使EGFP-新霉素片段纯化且连接到pStartK-hOlig2cam内，产生pStartK-hOlig2eGFP，其中cat由编码EGFP和新霉素的序列交换(新霉素的表达由RNA Pol II启动子驱动)。为了给这种载体添加阴性选择位点，使pStartK-hOlig2eGFP与基因通道(Invitrogen)质粒一起温育，所述质粒包含attR1和attR2位点以及Tk2——胸苷激酶基因。与克隆酶(clonase)(Invitrogen)一起温育后，hOlig2eGFP片段经由LR重组进行交换，并且与TK2基因连接。最终构建体通过氨苄青霉素进行选择，并且命名为pWSTK3_hOlig2eGFP。当递送到hESCs内时，仅同源重组将具有切割的TK2基因，并且在阴性选择药物6-TG或FIAU下存活。靶向载体的序列在图2中提供(SEQ ID NO：2)。
实施例2
在人类胚胎干细胞系BG01中产生Olig2-GFP敲入克隆
使BG01 hESC系维持在hESC培养基中的丝裂霉素C(Sigma)灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)层上，所述hESC培养基包含DMEM-F12、20％敲除血清、1％非必需氨基酸、55mM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺(上述全部来自Invitrogen)，补充有4ng/ml碱性FGF(Peprotech)，或在用MEF条件化的培养基中在Matrigel(BD Biosciences)包被的皿上24小时。
为了产生Olig2-GFP报道KI系，使用accutase(Sigma)分离总共5×10⁶至1×10⁷BG01细胞，并且与30μg线性化pWSTK3_hOlig2eGFP(靶向载体)一起温育。DNA和细胞的混合物随后转移至4mm比色杯，并且使用Bio-Rad Xcell Total系统以250V，250μF的单脉冲进行电穿孔。将电穿孔的细胞铺平板在MEF层上用于恢复。转染后72小时，每天将G418(50μg/ml用于前3-4天，并且在1周后增至200μg/ml(Invitrogen)和FIAU(125nM，Maravek Biochmicals)加入培养基中。在双重选择21天后人工挑选抗性克隆，并且铺平板在MEF饲养层或Matrigel包被的皿上用于进一步扩增。
DNA印迹分析用于鉴定靶向克隆。如上所述获得总共10⁶克隆，由其提取基因组DNA。通过DNA印迹分析，使来自每个克隆的HindIII消化的基因组DNA与衍生自同源臂的5’的探针杂交。证实6个克隆正确靶向Olig2位点。Olig2-GFP敲入hESCs的阳性克隆维持在包含100-200mg/ml G418的hESC培养基中。细胞进行常规核分型(CellLine Genetics，Madison，WI)。在对于运动神经元和少突胶质细胞形成有利的条件下，在分化17天后GFP阳性细胞在荧光显微镜检查下可见。
对于分化研究，Olig2-GFP敲入克隆维持在hESC培养基中，并且通过使用胶原酶IV(1mg/ml，Invitrogen)进行分离。细胞进行研磨以制备小团块，其随后转移至Ultralow附着皿(Corning)以形成EBs。EBs在MDFK培养基(DMEM-F12、5％敲除血清、1x ITS-X、1％非必需氨基酸、55mM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺，全部来自Invitrogen)中悬浮培养5天。通过每隔一天添加2μM全反式视黄酸(RA，Sigma)和30nM重组音猥(Shh，R&D systems)，进一步诱导EBs以表达Olig2-GFP，共另外10-20天。随后通过执行Olig2抗体染色的免疫细胞化学，在荧光显微镜下就GFP的表达以及Olig2和GFP的共标记检查由这些Olig2-GFPKI克隆产生的EBs。
实施例3
人类胚胎干细胞的转染
由于细胞的生长习性，人类胚胎干细胞(hESCs)难以转染。与可以由单个细胞生长的小鼠干细胞相反，hESCs趋于以团块生长并且一般难以由单个细胞形成。hESCs中的同源重组看起来非常难以达到，因为迄今在hESCs中仅已靶向2种基因，Oct4和HPRT。这2种基因在hESCs中表达，这帮助选择转化株，即使当转化率很低时。即使具有这个优点，用hESCs的结果与小鼠ESCs形成显著对比，其中已通过同源重组成功靶向数百种基因。Yates和Daley，Gene Ther.13(20)：1431-9(2006)，报告HR(同源重组)在hESCs中(与mESCs比较)仍未广泛采用，并且迄今仅存在3个HR靶向的hESCs系(2个HPRT系和1个Oct4系)。该不良结果部分由于在将DNA转染到hESCs中遇到的主要困难。Zwaka和Thomson，Nat Biotechnol.21(3)：319-21(2003)，报告尽管关于Oct4和HPRT1基因的靶向频率类似于在mESCs中获得的结果，但重要的是确定在人和mESCs之间的这个比率的相似性对于在ESCs中不表达的基因是否适用。
迄今，仍未靶向在hESCs中不表达的基因，除本文描述的工作外。为了克服在靶向在hESCs中不表达的基因中固有的困难，采用几种方法以优化转染率和靶向率。这些方法包括化学转染，包括脂质介导的转染试剂，例如Lipofectamine 2000和FuGene，Amaxa核因子(核穿孔(nucleoporation))和电穿孔(Bio-Rad Xcell总系统)。化学转染和核穿孔都不产生任何靶向克隆。随后利用优化的电穿孔条件，并且在8个电穿孔循环后导致具有约10^-8-10^-7的转染率的6个靶向克隆。
测试下述参数：
培养方法：必须确定hESCs应在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养者上还是在不含饲养细胞的基质上生长。发现在电穿孔前不与饲养者一起培养并且在电穿孔后铺平板在MEFs层上的hESCs给出最高转染率以及靶向率。这个结果先前未得到报告。
细胞收获：还必须确定应使用何种方法以在电穿孔前收获细胞。测试了许多不同酶，包括胰蛋白酶(分离细胞的最常用的酶-这也是用于传代小鼠ESCs的酶)、胶原酶IV(通常用于hESC传代)和Accutase^TM。导致靶向克隆的使用的唯一酶是accutase。
电穿孔条件：还必须测试不同电穿孔条件。测试了5种条件：800V，10mF；250V，250mF；500V，500mF；250V，250mF；320V，200mF。在这些中，通常对于小鼠ESCs起作用的高电压例如800V，或高电压高电容例如500V，500mF在hESCs中不起作用。然而，低电压和低电容例如250V，250mF给出最高转染率和靶向率。事实上，所有靶向克隆得自使用较低电压和低电容的电穿孔。
用于药物选择的剂量：还必须确定用于选择靶克隆的合适剂量。此处再次，对于小鼠ESCs起作用的剂量(例如500-1000μg/ml G418)对于hESCs不起作用(对于G418选择，使药物剂量从50逐步增加到200μg/ml)。较高的药物浓度杀死所有hESCs。
扩增且维持转染克隆：还必须开发方法用于扩增且维持转染克隆。发现酶促和人工剥离的组合对于获得且维持转染克隆最佳。