通过TREM1的炎症治疗、检测和监控.pdf

本发明提供了通过抑制/拮抗TREM-1表达/活性/信号转导和/或DAP12/TyroBP表达/活性而治疗受试者炎症性疾病/紊乱的方法。本发明还包括通过检测受试者或来自受试者的样本中TREM-1和/或DAPl2/TyroBP表达或活性来检测受试者中炎症性疾病存在的方法，其中升高的表达或活性是所述炎症性疾病的指征。本发明进一步提供了通过检测患者或来自患者的样本中分泌型磷蛋白1(SPP1)和/或一种或多种其他生物标志物的水平来评价给予患者的TREM-1调节剂的功效的方法。

1、  一种治疗受试者炎症性疾病的方法，所述方法包括降低TREM-1介导的信号转导的步骤。

2、  如权利要求1所述的方法，其中所述炎症性疾病由IgE介导。

3、  如权利要求1所述的方法，其中所述炎症性疾病为呼吸系统疾病。

4、  如权利要求1所述的方法，其中所述疾病为哮喘。

5、  如权利要求1所述的方法，其中所述炎症性疾病为类风湿性关节炎。

6、  如权利要求1所述的方法，其中所述降低步骤包括降低TREM-1的表达。

7、  如权利要求6所述的方法，其中所述降低步骤包括向受试者施用干扰RNA。

8、  如权利要求7所述的方法，其中所述干扰RNA为shRNA。

9、  如权利要求8所述的方法，其中所述shRNA包括SEQ ID NO：9-18中任一个所编码的RNA。

10、  如权利要求7所述的方法，其中所述干扰RNA为siRNA。

11、  如权利要求10所述的方法，其中所述siRNA包括SEQ IDNO：23-26中的任一个。

12、  如权利要求1所述的方法，其中所述降低步骤包括抑制TREM-1活性。

13、  如权利要求12所述的方法，其中通过施用选自小分子、拟肽、肽抑制剂、配体融合蛋白、特异性结合TREM-1的抗体或其片段、特异性结合TREM-1配体的抗体或其片段、可溶性TREM-1受体、可溶性TREM-1受体融合蛋白及其组合的化合物来抑制TREM-1活性。

14、  如权利要求1所述的方法，其中所述降低步骤包括直接抑制TREM-1介导的信号转导中的非TREM-1蛋白质的表达或活性。

15、  如权利要求14所述的方法，其中所述非TREM-1蛋白质为DAP12/TyroBP。

16、  如权利要求1所述的方法，其中所述降低步骤包括在受试者中诱导对内源性TREM-1或DAPl2/TyroBP蛋白的免疫应答。

17、  如权利要求16所述的方法，其中所述降低步骤包括向受试者施用包含佐剂和TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其免疫原性片段的免疫原性组合物。

18、  特异性结合TREM-1的抗体或其片段。

19、  如权利要求18所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是单克隆抗体或单克隆抗体片段。

20、  如权利要求18所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是单结构域抗体。

21、  一种治疗受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如权利要求19所述的抗体或其片段的步骤。

22、  包含SEQ ID NO：9-22中任一个所编码的RNA的shRNA。

23、  一种治疗有需要的受试者的炎症性疾病的方法，所述方法包括通过施用选自小分子、拟肽、肽抑制剂、配体融合蛋白、特异性结合TREM-1的抗体或其片段、特异性结合TREM-1配体的抗体或其片段、可溶性TREM-1受体、可溶性TREM-1受体融合蛋白及其组合的化合物来降低TREM-1介导的信号转导的步骤。

24、  评价向有需要的患者所施用TREM-1调节剂的功效的方法，所述方法包括在患者中或来自患者的样本中检测分泌型磷蛋白1(SPP1)的水平。

25、  如权利要求24所述的方法，其中所述SPPl水平在来自患者的体液样本中检测。

26、  如权利要求24所述的方法，进一步包括将SPP1水平与参照比较的步骤，其中与参照相比SPP1水平的升高是TREM-1活性升高的指征，其中与参照相比SPP1水平的降低是TREM-1活性降低的指征。

27、  如权利要求26所述的方法，其中所述参照对应于在施用所述TREM-1调节剂之前的时间点在患者或者来自患者的样本中测得的SPP1水平。

28、  筛选能够调节TREM-1信号的候选试剂的方法，所述方法包括步骤：
将表达TREM-1的细胞与候选试剂接触；和
评价所述表达TREM-1的细胞的分泌型磷蛋白1(SPP1)水平，以确定所述候选试剂是否调节TREM-1活性。

29、  监测治疗慢性炎症的患者的方法，所述方法包括步骤：
向有需要的患者施用TREM-1调节剂；
在患者或来自患者的样本中检测分泌型磷蛋白(SPP1)水平；和
将所检测到的SPP1水平与参照比较，从而监测所述患者。

30、  如权利要求29所述的方法，其中所述SPP1水平在来自患者的体液样本中检测。

31、  如权利要求29所述的方法，其中与参照相比SPP1水平的降低是TREM-1介导的炎症减轻的指征。

32、  如权利要求29所述的方法，其中与参照相比SPP1水平没有变化是TREM-1介导的炎症没有变化的指征。

33、  如权利要求29所述的方法，其中与参照相比SPP1水平的升高是TREM-1介导的炎症加重的指征。

34、  如权利要求29所述的方法，其中所述参照对应于在施用所述TREM-1调节剂之前的时间点或同时在患者或来自患者的样本中检测的SPP1水平。

35、  如权利要求29所述的方法，其中所述参照对应于已知未患慢性炎症的对照受试者的SPP1水平。

36、  检测受试者中存在炎症性疾病的方法，所述方法包括步骤：
在受试者或来自受试者的样本中检测TREM-1或DAPl2/TyroBP的表达或活性，其中升高的表达或活性是所述炎症性疾病的指征。

37、  在受试者中监测炎症性疾病的方法，所述方法包括步骤：
(a)在第一时间对患者或来自患者的第一样本检测TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性；
(b)在后来的第二时间对患者或来自患者的后来的第二样本检测TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性；和
(c)比较(a)和(b)的所述表达或活性，其中表达或活性的改变是疾病状态改变的指征。

38、  如权利要求37所述的方法，其中所述炎症性疾病是类风湿性关节炎。

39、  评价受试者中炎症性疾病的治疗的方法，所述方法包括步骤：
(a)在第一时间对患者或来自患者的第一样本检测TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性；
(b)在后来的第二时间对患者或来自患者的后来的第二样本检测TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性；
(c)在所述后来的第二时间或后来的第二样本之前进行治疗；和
(d)比较(a)和(b)的所述表达或活性，其中表达或活性的改变是疾病状态改变的指征。

40、  如权利要求39所述的方法，其中在第一时间或第一样本之后给予所述治疗。

41、  如权利要求39所述的方法，进一步包括基于所述比较的结果修改对受试者治疗的疗程。

通过TREM-1的炎症治疗、检测和监控
相关申请的交叉引用
[0001]本申请主张2007年11月2日递交的美国临时专利申请No.61/001,687、2007年4月11日递交的美国临时专利申请No.60/923,131、2007年2月28日递交的美国临时专利申请No.60/904,264和2007年1月16日递交的美国临时专利申请No.60/880,804的优先权，其完整公开通过引用作为参考。
发明背景
[0002]类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性炎症性疾病，影响约1-2％的人口(Feldman(2002)Nature Rev.Immunol.2(5)：364-371；Mount等人(2005)Nature Rev.Drug Discovery 4(1)：11-12)。RA的特点是动关节中骨和软骨的慢性炎症及破坏。疾病发病通常是在25至50岁的年龄，其中三分之一的病人在20年之内会变得严重残疾。
[0003]虽然RA的确切病因不明，已有人提出RA的形成涉及传染病或环境暴露(Firestein(2005)J Clin.Rheumatology 11(3Supp.)：S39-44)。先天免疫的局部诱导可以激活滑膜内层中的细胞并准备好遗传性易感个体中后续适应性免疫应答的区域(Firestein(2005)J Clin.Rheumatology 11(3supp.)：S39-44)。已确诊的类风湿性关节炎患者滑膜的特征在于显著的滑膜内膜内层增生、血管分布增加和内层之下炎性细胞的积聚。对RA滑膜的活检也揭示了许多促炎细胞因子，如TNF-α，IL-1β，IL-6，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的自发产生(Feldman等。(1996)Ann.Rev.Immunol.14：397-440)。发现中和TNF-α活性的抗体取消了多种细胞因子的产生，这导致了新型抗TNF-α疗法治疗RA的发现。最近的临床结果显示了RA的不一致性，并提示了其他因素也可能导致这种疾病的发病机制。
[0004]髓样细胞表达的触发受体-1(TREM-1)是最近发现的免疫球蛋白样细胞表面受体，主要表达在中性粒细胞和CD14^高单核细胞的亚群上(Colonna等。(2000年)Seminars in Immunol.12(2)：121-27)。TREM-1有短的细胞内结构域，且TREM-1信号传导是通过衔接蛋白DAP12/TyproBP介导的。DAP12/TyroBP是一种具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的跨膜蛋白，并作为衔接蛋白行使功能，与TREM-1和其他跨膜受体结合。
[0005]在急性炎症过程中，TREM-1表达被各种Toll样受体(TLR)配体上调(Bouchon等人(2001)Nature 410(6832)：1103-07；Bleharski等人(2003)J.Immunol.170(7)：3812-18；Murakami等人(2006)54(2)：455-62)。例如，已经暗示TREM-1涉及与脓毒症相关的急性炎症(Colonna(2003)Nat.Rev.Immun.3(6)：445-53)。在脓毒症中，细胞表面TREM-1和可溶性TREM-1的表达以一种与疾病的严重程度相关的方式升高(Gibot等人(2005)New England J.Med.350(5)：451-58；Gibot等人(2005)Critical Care Med.33(4)：792-96)。在尿酸一钠(MSU)诱导的痛风炎症模型中，在浸润的腹膜巨噬细胞和中性粒细胞中快速诱导TREM-1的表达。此外，TREM-1的活化刺激多种促炎细胞因子和趋化因子的产生。
[0006]此外，TREM-1与TLR和Nod样受体在这些细胞因子产生中的协同效应放大了炎症反应(Bouchon等人(2001)Nature 410(6832)：1103-07；Bleharski等人(2003)J.Immunol.170(7)：3812-18；Netea等人(2006)J.Leukocyte Biol.80(6)：1454-61)。这些数据表明了增加的TREM-1表达和TREM-1表达细胞向炎症位点的迁移可能通过炎症反应的放大而促成急性炎症。
[0007]TREM-1在急性炎症反应中的作用，还通过使用TREM-1胞外域-Fc融合蛋白或TREM-1胞外域合成肽保护小鼠免于致死性LPS或细菌诱导的脓毒性休克而证实(Bouchon等人(2001)Nature 410(6832)：1103-07；Gibot等人(2004)J.Exp.Med.200(11)：1419-26)。TREM-1-FC的也可防止酵母多糖-A诱导的肉芽肿形成，这表明TREM-1可以在慢性炎症以及急性炎症中发挥作用(Nochi等人(2003)Am.J.Path.162(4)：1191-201)。此外，越来越多的证据表明，可溶形式TREM-1的循环水平是针对多种炎症性疾病的生物标志物，包括脓毒症、肺炎、急性胰腺炎、消化性溃疡(Gibot等人(2005)Intensive Care Med.31(4)：594-97；Gibot等人(2004)New England J.Med.350(5)：451-58；Wang等人(2004)World J.ofGastroenterology 10(18)：2744-46；Koussoulas等人(2006)Eur.J.Gastroenterology & Hepatology 18(4)：375-79)。
发明概述
[0008]本发明部分基于下述发现：TREM-1和/或DAP12/TyroBP的过表达与自身免疫性疾病和/或炎症性疾病的出现有关。因此，TREM-1和/或Dap12/TyroBP是用于自身免疫性疾病和炎症性疾病的预防和治疗的新型治疗靶标。一方面，本发明涉及使用TREM-1和/或DAP12/TyroBP拮抗剂治疗或预防炎症性疾病。能够用于本发明的拮抗剂包括，例如，抗体(包括例如：抗体片段、单链抗体Fv、产生自任何物种的单结构域抗体，所述物种包括例如：人、小鼠、骆驼、骆马、鲨鱼、山羊、兔和牛，更详细的说明见下文)；可溶性受体(包括截短的受体、天然可溶性受体、或包含与第二蛋白质(例如免疫球蛋白的Fc部分)融合的受体(或其片段)的融合蛋白)；肽抑制剂；小分子；配体融合物和结合蛋白。TREM-1和DAP12/TyroBP是类风湿性关节炎的有效生物标志物，因为这些基因在患有类风湿性性关节炎的个体中过表达。TREM-1是表达在特定细胞类型上的细胞受体，如中性粒细胞和单核细胞亚群，而且TREM-1也以可溶性形式存在。TREM-1信号转导由衔接蛋白DAP12/TyroBP介导。TREM-1的活化诱导促炎细胞因子和趋化因子的产生。因此，TREM-1提高的表达可能会导致或促使在RA、哮喘和其它炎症疾病中观察到的炎症，如慢性炎症性疾病和呼吸系统炎症/疾病。所以，TREM-1和/或DAP12/TyroBP是用于治疗、调节和/或预防类风湿性关节炎和其它炎症疾病相关的症状有前途的治疗靶标。
[0009]一方面，本发明提供了一种通过减少TREM-1介导的信号转导来治疗炎症性疾病的方法，这种炎症性疾病诸如，例如，慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)。减少TREM-1介导的信号转导可包括调节、抑制和/或拮抗TREM-1受体和/或涉及TREM-1信号转导的其他分子(如DAP12/TyroBP)，从而减轻、治疗、预防、缓和和/或改善与TREM-1介导的炎症相关的症状。在一些实施方案中，通过抑制TREM-1转录、选择性切割内源性TREM-1mRNA或抑制内源性TREM-1mRNA翻译来降低TREM-1蛋白表达。例如，TREM-1蛋白的表达可以通过给予干扰RNA来降低，例如shRNA(如，SEQ ID NO：9-22中任意一个编码的shRNA)或siRNA(例如SEQ ID NO：23-26中的任意一个)。在其他的实施方案中，TREM-1的活化通过给予小分子、拟肽、肽抑制剂、配体融合蛋白、结合TREM-1的抗体或抗体片段、结合TREM-1配体的抗体或抗体片段、可溶性TREM-1受体或其配体结合部分、或可溶性TREM-1受体融合蛋白来抑制。本发明其它实施方案提供通过直接抑制TREM-1信号转导通路中的非TREM-1成员(例如，TREM-1辅助蛋白DAP12/TyroBP)治疗炎症性疾病的方法，该炎症性疾病诸如，例如，慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)。在一些实施方案中，通过在受试者中对内源性TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白诱导免疫应答而在受试人中降低TREM-1介导的信号转导。例如，可对受试者施用包含佐剂和TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其免疫原性片段的免疫原性组合物，以引发对该内源性蛋白的免疫应答。
[0010]本发明的另一方面提供了与TREM-1结合而不会激活受体的抗体或抗体片段。该抗体或抗体片段可以是例如单克隆抗体。本发明其它的实施方案提供治疗受试者(例如人)的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的结合TREM-1但不激活受体的抗体或抗体片段的步骤。
[0011]另一方面，本发明提供了SEQ ID NO：9-22中任意一个编码的shRNA。
[0012]本发明指出，TREM-1的活化导致许多基因的差异表达，如分泌型磷蛋白1(SPP1)，它可以作为TREM-1活性的标志物。因此，在另一方面，本发明提供特异性针对TREM-1活性和对TREM-1活性有指示性的标志物。一个或多个这些标志物水平的变化与TREM-1的活性变化相关。因此，本发明还提供通过检测这些标志物中的一个或多个的水平来评价TREM-1的活性，和/或评价给予需要这种治疗的患者(例如病人)TREM-1调节剂的疗效的方法。例如，可在患者或来自患者的样本中检测分泌型磷蛋白1(SPP1，也称为骨桥蛋白(OPN)、骨涎蛋白I(BSPI)、早期T-淋巴细胞活化蛋白1(ETA-1)或MGCl10940)的水平，而且SPP1水平的变化与TREM-1的信号变化相关。SPP1水平可以在患者或来自患者的任何临床相关样本中检测，如体液样本(如血清、滑液、气管液，唾液)。在一个实施方案中，该方法进一步包括将SPP1水平与参考水平比较的步骤，其中与参考水平相比SPP1水平的增加可以是TREM-1活性增加的指征，其中相对于参考水平SPP1水平的下降可以是TREM-1活性降低的指征。该参考水平可以是，例如，在给予TREM-1调节剂之前患者或来自患者的样本中检测的SPP1水平。下面较详细的说明了根据本发明可用于评估TREM-1活性的其他标志物，如图8A所示。
[0013]在又一方面，本发明提供了筛选能够调节TREM-1信号转导的候选试剂的方法。该方法包括将表达TREM-1的细胞与候选试剂接触，并检测该表达TREM-1的细胞的分泌性磷蛋白1(SPP1)的水平，以确定该候选试剂是否调节TREM-1活性。可以根据本发明筛选的候选试剂包括，例如，干扰RNA、小分子、拟肽、肽抑制剂、配体融合蛋白、结合TREM-1的抗体或其片段、结合TREM-1配体的抗体或其片段、可溶性TREM-1受体、可溶性TREM-1受体融合蛋白，以及它们的组合。在其他的实施方案中，该方法包括将表达TREM-1的细胞与TREM-1激活剂(例如，交联抗体)接触。在又一些实施方案中，该方法可以包括将测得的SPP1水平与参考水平比较。SPP1水平相对于参考水平的增加可以作为TREM-1信号转导增加的指征，SPP1水平相对于参考水平的下降可以作为TREM-1信号转导下降的指征。在一个实施方案中，参考水平对应于将TREM-1表达细胞接触候选试剂之前测得的该细胞的SPP1水平。下面更详细说明根据本发明可用于评估TREM-1活性的其他标志物，例如，参见图8A。
[0014]本发明的另一方面提供了监测治疗病人的炎症或慢性炎症的方法。该方法包括对有需要的患者(例如病人)施用TREM-1调节剂、检测患者或来自患者的样本中分泌型磷蛋白1(SPP1)水平，并将检测到的SPP1水平与参考水平比较。SPP1水平可以在患者或来自患者的样本中检测，如体液样本(如血清、滑液、气管液、唾液)。与参考水平相比，SPP1水平的减少是TREM-1介导的炎症降低的指征，而与参考水平相比，SPP1水平没有改变或升高则分别表明TREM-1介导的炎症并没有改变或者有升高。在一些实施方案中，参考水平对应于在给予TREM-1调节剂之前或同时在患者或来自患者的样本中检测的SPP1水平。在其他的实施方案中，参考水平对应于对照受试者(例如人)或来自对照受试者的样本的SPP1水平，其中已知对照受试者没有慢性炎症。下面更详细说明根据本发明可用于评估TREM-1活性的其他标志物，例如，参见图8A。
[0015]另一方面，本发明涉及检测受试者(例如人)患有炎症疾病的方法，例如，慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)。炎症性疾病包括，例如，关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、与狼疮有关的关节炎或强直性脊柱炎)、硬皮病、系统性红斑狼疮、血管炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、自身免疫性皮肤病、重症肌无力、炎症性肠病(IBD)、节段性回肠炎、结肠炎、溃疡性结肠炎、糖尿病(I型)、炎症，如皮肤(如牛皮癣，急性和慢性荨麻疹(风疹))、心血管系统(如动脉粥样硬化)、神经系统(如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症)、肝脏(如肝炎)、肾脏(如肾炎)和胰腺(例如，胰腺炎)；心血管疾病，如胆固醇代谢病、氧自由基损伤；与创伤愈合相关的病症；呼吸系统疾病，如哮喘和COPD(例如，囊性纤维化)；急性炎症(如，内毒素血症、败血症、脓毒性休克、中毒性休克综合征和感染性疾病)；移植排斥反应和过敏症(比如过敏症、血管性水肿、特应性、昆虫叮咬变应性、变应性鼻炎)。可根据本发明检测的其他病症包括缺血。该方法包括在受试者或得自受试者的样本中检测TREM-1(例如，膜结合的TREM-1，可溶性TREM-1)或DAP12/TyroBP表达或活性的步骤。(在此申请中，“或”可以指“和/或”，因此，如果需要该方法可以包括检测TREM-1和DAP12/TyroBP两者，也可以包括表达及活性的检测)。用于实施本发明这个方法和其他方法的样本是其中的TREM-1和/或DAP12/TyroBP可以检测的任意样品，包括例如，包括关节组织、滑液、滑膜，或任何其他与临床有关的体液或组织的样本，无论是，例如，循环的样本(如血液，血浆或淋巴)，还是集中在慢性炎症位点、免疫系统的组织、或曾经暴露于慢性炎症位点的组织或体液的样本。检测到升高的TREM-1或DAP12/TyroBP表达或活性是炎症疾病存在的指征，例如，慢性炎症性疾病，如RA。该方法可包括额外步骤来将受试者或来自受试者的样本中TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性与已知参考水平相比较。比较的结果(例如增加的表达或活性)，是炎症性疾病存在的指征。参考水平可以，例如，是炎症性疾病存在的指征，或是区分正常表达和表达升高的阈值等。
[0016]本发明还提供了通过如下步骤在受试者(如人)中检测诸如慢性炎症性疾病(诸如RA或哮喘等)等炎症性疾病存在的方法：检测TREM-1或DAP12/TyroBP在受试者或来自受试者的样本中的表达和将受试者或样本中的TREM-1或DAP12/TyroBP表达与参考水平比较。比较的结果(例如表达的增加)是炎症性疾病存在的指征。参考水平可以是炎症性疾病存在的指征，或是区分正常表达和表达升高的阈值等。
[0017]另一方面，本发明提供了在受试者(例如人)中监测诸如慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)等炎症性疾病的方法。该方法受益于如下了解：TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性在受试者中随时间的变化(对受试者或来自受试者的样本在不同时间测定)可以用作疾病状态改变的指征。该方法包括在两个或更多个不同的时间(此处有时称为第一时间和后来的第二时间)检测受试者或来自受试者的样本的TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性，并比较观察到的表达或活性。TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性随时间的降低可以作为炎症性疾病减轻的指征，而TREM-1或DAP12/TyroBP的表达或活性随着时间的增加则可以是炎症性疾病严重的指征。
[0018]该监测方法也用于评估对受试者(如人)的诸如慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)等炎症性疾病的治疗。在受试者中进行后来的第二时间的TREM-1或DAP12/TyroBP表达或活性检测之前进行治疗，或在取后来的第二个样本之前进行治疗。治疗可以在监测方法开始之前或之后(第一时间对受试者进行检测之前或之后，或从受试者取第一个样本之前或之后)进行。此外，根据第一时间或在第一个样本中检测的TREM-1或DAP12/TyroBP表达或活性与后来的第二时间或在第二个样本中检测的TREM-1或DAP12/TyroBP表达的比较，可以对治疗的疗程进行修改。
[0019]本发明这些和其他方面，以及实施方案也在本申请的下列部分中详细说明，这些说明只是为了突出说明本发明的具体实施方案，而不是为了限制本发明，本发明的范围由所附的权利要求书限定。
附图简要说明
[0020]本专利或专利申请文件中包含至少一个彩图。应请求并支付必要的费用后，本专利或本专利申请公开的带有彩图的副本可以由专利局提供。
[0021]图1是显示TREM-1和DAP12/TyroBP在RA患者滑膜中表达的条形图。
[0022]图2是显示在鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型中TREM-1和DAP12/TyroBP mRNA的表达的条形图。
[0023]图3A展示了在RA阳性滑膜切片中的人TREM-1的代表性免疫组织化学染色图，TREM-1阳性指数大于1000。
[0024]图3B显示在骨关节炎(OA)对照切片中人TREM-1的代表性免疫组化染色的图，TREM-1阳性指数小于20。
[0025]图4是用ELISA法检测的来自RA和对照(HVOS)患者的人血浆样本中可溶性TREM-1水平的图。
[0026]图5显示了描述TREM-1交联后促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)活化的随时间变化的示例性蛋白质印迹图。
[0027]图6显示了成簇分析调节大于2倍，p小于0.01的基因的示例性ANOVA热图(ANOVA heat map)。个体供体示于左侧，平均平均值强度示于右侧。
[0028]图7显示了所有存在的基因的示例性散点图(“回应(calls)”)。针对TREM-1(x-轴)和LPS(y-轴)标绘Ln倍数改变(Ln foldchanges)，下调转换为负值。选择的基因突出显示。其45°轴分开两种治疗可比调节的基因。
[0029]图8A为列出了在TREM-1活化下上调大于4倍的示例性基因的表格。
[0030]图8B为列出了用LPS处理时上调大于4倍的示例性基因。
[0031]图9a为列出了共同上调大于4倍的示例性基因的表格，也就是说，这些基因是在TREM-1活化和在用LPS处理时都上调的基因。
[0032]图9b为列出了或者是在TREM-1活化时，或者在用LPS处理时下调大于4倍的示例性基因的表格。
[0033]图10A-B显示了用表达绿色荧光蛋白的人单核细胞系THP-1细胞的示例性吞噬实验结果。1微米珠呈红色。图10A显示处理后THP-1细胞的形态学变化。图10B表明，用α-TREM-1和LPS的处理诱导了微球吞噬。
[0034]图11A-F为示例性时程ELISA(time-course ELISA)。图11A为GM-CSF，图11B为M-CSF，图11C为G-CSF、图11D为INHBA(抑制素，βA(激活蛋白A，激活蛋白ABα多肽))，图11E为SPP1，图11F为IL-23。
[0035]图12是一系列条形图，表示TREM-1的交联以剂量依赖的方式在RA组织样本中诱导多种细胞因子的产生。
[0036]图13A-B为表示在从三个不同供体制备的组织样本中多种细胞因子的产生的图表。图13A显示了在三个供体样本中自发产生的细胞因子的比较。图13B显示三个供体样本中TREM-1交联后，细胞因子产生的比较。
[0037]图14为表示在K/BxN爪中升高的TREM-1表达的条形图。
[0038]图15为显示在mTREM-1-hFC转基因小鼠和野生型小鼠中应答K/BxN血清转移的踝增厚的图表。
[0039]图16为显示mTREM-1-hFC转基因小鼠在第14天应答K/BxN血清转移的踝增厚的图表。
[0040]图17是表示在表达mTREM-1-hFc融合蛋白的转基因小鼠中用抗IgE抗体攻击后耳肿胀的图
[0041]图18是表示在用mTREM-1-mFc蛋白预处理的小鼠中以抗IgE抗体攻击后耳肿胀的图表。
[0042]图19是表示在用mTREM-1-mFc蛋白预处理的小鼠中以抗IgE抗体攻击后耳朵肿胀的剂量反应的图表。
[0043]图20是表示抗-IgE抗体攻击后TREM-1敲除小鼠耳朵肿胀的图表。
[0044]图21是表示shRNA或siRNA敲除后用RT-PCR检测的TREM-1表达的条形图。
[0045]图22A-B为在TREM-1过表达的细胞系中用慢病毒shRNA敲除TREM-1之后，说明TREM-1表达的代表性蛋白质印迹图。
[0046][0046]图23是一个表格，列出了利用的人类基因组U133_plus 2.0阵列总结的纯化的人单核细胞全基因表达谱的结果(见实施例6)。
[0047]图24是一个表格，其进一步利用的人类基因组U133_plus 2.0阵列总结了纯化的人单核细胞全基因表达谱的结果(见实施例6)。
发明具体说明
[0048]本文提到的术语“核酸”是指多核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)，和在适当情况下的核糖核酸(RNA)。这个词也应理解为包括，适用于所述实施方案的，单链(如正义或反义的)和双链多核苷酸。
[0049]本文提到的“RA阳性”、“RA样本”和“RA组织”是指患有类风湿性关节炎的受试者，或来自患有类风湿性关节炎的受试者的任何组织、体液、或其他样本。“RA阴性”指未受影响的受试者或来自未受影响的受试者的任何组织、体液、或其他样本。
[0050]本文提到的术语“RA”指的是类风湿性关节炎。本文中所使用的术语“OA”指的是骨关节炎。
[0051]术语“抗体”包括完整的分子以及其功能性片段，如Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fc、Fd、Fd′、Fv、单链抗体(如scFv)、单可变结构域抗体(Dab)、双抗体(二价和双特异性)、和嵌合(如，人化的)抗体，其可以通过对完整抗体的修饰得到，或者利用重组DNA技术从头合成。这些功能性抗体片段仍然保有选择性地与各自的抗原或受体结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何抗体种类，包括，但不仅限于，IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，也可来自抗体的任何亚类(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。本发明的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。该抗体也可以是人抗体、人化抗体、CDR嫁接的抗体，或在体外产生的抗体。该抗体可以具有选自例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。该抗体还可以有选自例如，κ或λ的轻链。该抗体恒定区可以经更改(如经突变)以修饰抗体的性质(例如，增加或减少下列中的一个或多个：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能、或补体功能)。通常情况下，抗体与预定抗原特异性结合，如与例如神经退化、代谢、炎症、自身免疫和/或恶性疾病等疾病有关的抗原。
[0052]本发明的抗体也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可包括那些其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。其实例包括，但不限于，重链抗体、轻链天然缺失的抗体、来自传统的四链抗体的单结构域抗体、工程抗体和并非来自抗体的单结构域支架结构。单结构域抗体可以是本领域任何单结构域抗体，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可能来自任何物种，包括但不限于，小鼠、人、骆驼、骆马、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。在本发明的一个方面，单结构域抗体可以源自鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如源自在鲨鱼血清中发现称作新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的。制备源自NAR(“IgNAR”)可变区的单结构域抗体的方法记载在WO 03/014161和Streltsov(2005)ProteinSci 14：2901-2909中。根据本发明另一方面，单结构域抗体是天然形成的、称为缺乏轻链的重链抗体的单结构域抗体。这样的单结构域抗体披露于例如WO9404678中。为了清楚起见，这个源于轻链天然缺失的重链抗体的可变结构域在此处被称为VHH或nanobody，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH相区分。这种VHH分子可以来自于骆驼科物种中产生的抗体，例如骆驼、骆马、单峰驼、羊驼和原驼。除了骆驼科其它物种可能会产生轻链天然缺乏的重链抗体；这种VHH落在本发明的范围内。
[0053]本发明还设想使用小模块化免疫药物(Small ModularImmunoPharmaceuticals)(“SMIPsTM”)，其通常是指结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，包括融合到或者以另外的方式连接到免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽的结合结构域多肽，免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽又融合或以另外的方式连接到包括一个或多个天然或工程化的恒定区的区域，该恒定区来自除了CH1的免疫球蛋白重链，例如，IgG和IgA的CH2和CH3区，或IgE的CH3和CH4区(其更完整的描述见例如，Ledbetter，J.等的US 2005/0136049)。该结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白可进一步包括一个区域，其包括：融合或者以另外的方式连接到铰链区多肽的天然或工程化的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽(或者在构建体整体或部分来自IgE的情况下为CH3)；和天然或工程化的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或在构建体整体或部分来自IgE的情况下为CH4)，该多肽融合或者以另外的方式连接到所述CH2恒定区多肽(或者在构建体整体或部分来自IgE的情况下为CH3)。通常情况下，这种结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白具有选自下组中的至少一种免疫活性：抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、补体固定和/或结合靶标(例如靶抗原)。
[0054]本文中所使用的术语“反义”是指与特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。术语“反义链”是用来指与“正义”链互补的核酸链。反义分子可通过任何方法制备，包括通过以颠倒的方向将目的基因与病毒启动子连接，这允许互补链的合成。一旦引入细胞中，这种经转录的链结合细胞产生的天然序列形成二倍体。然后这些二倍体进一步阻断转录或翻译。“-”负标识有时用于指代反义链，和“+”正标识有时用于指代正义链。
[0055]本文提到的术语“受试者”和“患者”是指任何人类或非人类的哺乳动物。
[0056]本文提到的术语“检测”和以“检测”为词根的所有其他形式的词指的是确认一个或多个靶标的存在或不存在、一个或多个靶标的定量、或确定一个或多个生物标志物的阈值的存在或不存在。
[0057]本文提到的术语“关节组织”是指来自关节区域的任何组织或液体，非限制性包括：腱、韧带和滑膜。
[0058]本文提到的术语“炎症性疾病”以非限制性实例的方式包括，关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、与狼疮有关的关节炎或强直性脊柱炎)；硬皮病；系统性红斑狼疮；血管炎；多发性硬化；自身免疫性甲状腺炎；皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)；自身免疫性皮肤病；重症肌无力；炎症性肠病(EBD)；节段性回肠炎；结肠炎；溃疡性结肠炎；糖尿病(I型)；炎症，例如，皮肤(如牛皮癣，急性和慢性荨麻疹(风疹))、心血管系统(如动脉粥样硬化)、神经系统(如阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症)、肝脏(如肝炎)、肾(如肾炎)和胰腺(例如，胰腺炎)；心血管疾病，如胆固醇代谢病、氧自由基损伤；与创伤愈合相关的病症；呼吸系统疾病，如哮喘和COPD(例如，囊性纤维化)；急性炎症(如，内毒素血症、败血症、脓毒性休克、中毒性休克综合征和感染性疾病)；移植排斥反应和过敏症(比如过敏症、血管性水肿、特应性、昆虫叮咬变应性、变应性鼻炎)。
[0059]本文提到的术语“慢性炎症性疾病”是指炎症反应长期持续(例如，几周，几月，甚至无限期)的任何疾病，且其延长的时间段是由组织中炎症的成因刺激物持续刺激引起的。术语“慢性炎症性疾病”包括，例如，类风湿性关节炎。
[0060]本文提到的术语“指征”(例如，炎症性疾病的指征)指征兆或指示，或需要考虑的因素，而不是确切的证据或是其本身。一般来说，增加的TREM-1表达水平与炎症性疾病(例如，RA)的增加的可能性相关；因此，增加的TREM-1表达是炎性性疾病(如RA)存在的指征。同样，正常TREM-1表达水平一般与无炎症性疾病(如RA)的增加的可能性相关。
[0061]本文提到的术语“PCR”指聚合酶链式反应。
[0062]本发明包括将TREM-1和DAP12/TyroBP作为炎症性疾病(诸如慢性炎症性疾病等)生物标记物的鉴定，更具体地说，作为RA的生物标志物的鉴定。RA和正常滑膜组织转录谱的比较发现，人RA样本中TREM-1mRNA表达比正常上调高6.5倍，人RA样本中DAP12/TyroBPmRNA表达比正常上调高2倍(见实施例1)。在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，TREM-1mRNA在CIA的爪中比在正常小鼠的爪中的表达上调132倍，并且DAP12/TyroBP mRNA在CIA的爪中比在正常小鼠的爪中的表达上调8.21倍(见实施例2)。采用免疫组织化学方法发现，人类RA滑液样本含有数量增加的TREM-1表达细胞(见实施例3)。此外，在滑液培养物中TREM-1的活化以剂量依赖的方式诱导促炎细胞因子和细胞因子产生(见实施例9)。此外，与对照患者相比，在RA患者的人临床血浆样本中可溶性TREM-1水平升高(见实施例4)。作为RA的生物标志物的TREM-1和DAP12/TyroBP的鉴定，和TREM-1诱导促炎症反应的能力使得TREM-1和TREM-1信号转导通路的成员成为诸如慢性炎症性疾病(特别是RA)等炎症性疾病的理想治疗靶标。
基因表达的检测
[0063]本发明提供了通过检测或定量TREM-1或DAP12/TyroBP表达或活性来检测和监测诸如慢性炎症性疾病等炎症性疾病的方法。众所周知许多蛋白质、核酸、或感兴趣的活性水平的定量或不定量的检测方法，且其可用于本发明的实践中。
[0064]目的基因转录物可以用多种本领域已知的技术检测。一些有用的核酸检测系统包括准备纯化的样品的核酸组分，以及对样品进行直接检测，或扩增过程之后进行检测，例如检测关节组织样本中的TREM-1mRNA。可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)、反转录酶(RT)和偶联的RT-PCR进行扩增。核酸的检测可以通过例如用与目的核酸杂交的探针探测纯化的核酸组分来达成，许多情况下还会涉及扩增。Northern印迹、点印迹、微阵列、定量PCR和定量RT-PCR都是用于检测样本中核酸的众所周知的方法。核酸扩增也可以通过连接酶链反应、链置换扩增、自主序列复制或基于核酸序列的扩增进行。参见例如，Lewis(1992)GeneticEngineering News 12(9)：1；Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874-1878和Weiss(1991)Science 254：1292。核酸也可以通过测序检测，测序可以采用对目的核酸特异的引物(例如TREM-1cDNA序列)或针对连接到目的核酸的接头序列的引物。随机选择的mRNA或cDNA序列的测序可以提供对生物标志物的相对表达量的表征，这通过所有测序的含有对应于该生物标志物的核酸序列(例如TREM-1的cDNA或mRNA序列)的转录物的百分比来表征。或者，核酸可以原位检测而不经提取或纯化，例如通过杂交来检测。
[0065]例如，靶蛋白可以用一个或多个抗体免疫检测。在免疫检测中，可以直接或间接标记对生物标志物有特异结合亲和性的抗体，或与该抗体结合的第二抗体。抗体不需要是完整的：抗体可变结构域或其人工模拟物(如单链抗体)即可。合适的标记物包括但不限于，放射性核素(例如，125I、131I、35S、3H、32P、33P或14C)、荧光基团(例如，荧光素、FITC、多甲藻(黄)素叶绿素蛋白、罗丹明或PE)、发光基团(例如，加州帕洛阿尔托的量子点公司(Quantum Dot Corporation，Palo Alto，CA)提供的Qdot ^TM纳米颗粒)、吸收确定波长光的化合物或酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)。可以通过与生物素结合然后用采用上述分子标记的亲和素或链霉素检测而间接标记抗体。根据标记的性质检测或定量标记物的方法是本领域已知的。检测器的例子包括但不限于X光片、辐射计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计和光密度计。可以使用本领域熟悉的这些方法的组合(包括“多层”检测)来提高检测的灵敏度。
[0066]检测目标蛋白质的免疫学检验可以以各种已知方式进行，包括夹心法、竞争法(竞争RIA)，或桥免疫测定(bridge immunoassay)。参见，例如，美国专利NO.5,296,347、4,233,402、4,098,876和4,034,074.。检测目标蛋白质的方法一般包括将生物学样本与结合该蛋白质的抗体接触，并检测该蛋白质与该抗体的结合。例如，可以通过本领域已知的各种方法中的任何方法将对TREM-1有特异性结合亲和力的抗体固定在固体基质上，然后将该抗体暴露给该生物学样本。TREM-1与固体基质上的抗体的结合可利用表面等离子体共振的现象来检测，结合后会导致表面等离子体共振强度的改变，这种改变可以用适当仪器定性或定量检测到，例如设备(Biacore International AB，瑞典Rapsgatan)。或者，可以如上所述标记和检测该抗体。可以用已知量的蛋白质作出标准曲线以协助生物标志物水平的定量。
[0067]在其他实施方案中，使用捕获抗体被固定于固体基质的“夹心”检测法来检测目的蛋白质的水平。该固体基质可以与生物学样本接触，从而使得该样本中的任何目的蛋白质能够结合到该固定化的抗体上。可以利用对目的蛋白质有特异性结合亲和性的“检测”抗体来测定结合到上述捕获抗体的目的蛋白质的水平，方法如上所述。应了解，在这些夹心检验法中，捕获抗体不应该结合到与检测抗体所结合的抗原表位相同的抗原表位上(或在使用多克隆抗体的情况下，捕获抗体结合的抗原表位的范围不应该与检测抗体所结合的抗原表位的范围相同)。因此，如果一种单克隆抗体用作捕获抗体，检测抗体可以是另一种单克隆抗体，它结合的抗原表位或者与该捕获单克隆抗体结合的抗原表位在物理上完全分隔，或者仅仅与其部分重叠；检测抗体也可以是多克隆抗体，其结合到非捕获单克隆抗体结合的抗原表位上或结合到除捕获单克隆抗体结合的抗原表位以外的抗原表位上。如果多克隆抗体作为捕获抗体，检测抗体可以是单克隆抗体，它结合的抗原表位或者与该捕获多克隆抗体结合的任何抗原表位在物理上完全分隔，或者与其部分重叠；检测抗体或也可以是多克隆抗体，其结合到非捕获多克隆抗体结合的抗原表位上，或结合到除捕获多克隆抗体结合的抗原表位以外的抗原表位上。夹心检测可以作为夹心ELISA法、夹心蛋白质印迹检测或夹心免疫磁性检测法来实施。
[0068]适用的抗体(如捕获抗体)可以结合的固体基质包括但不限于，微孔板、管、如尼龙膜或硝酸纤维素膜等的膜、和珠子或颗粒(如，琼脂糖、纤维素、玻璃、聚苯乙烯，聚丙烯酰胺、磁性的、或可磁化珠或颗粒)。当使用自动免疫检测系统时，特别适用磁性颗粒或可磁化颗粒。
[0069]检测目标多肽的其他技术包括质谱-分光光度技术，例如电喷射离子化(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。参见，例如，Gevaert等人(2001)Electrophoresis 22(9)：1645-51；Chaurand等人(1999)J.Am.Soc.Mass Spectrom.10(2)：91-103。用于这种用途的质谱仪可购自应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加利福尼亚州福斯特城)；BrukerDaltronics(马萨诸塞州比尔里卡)和通用电气医疗集团(GE Healthcare)(新泽西州Piscataway)。
[0070]应理解，采用上述技术中的一种或多种可以容易地检测根据本发明的任何目的基因转录物或目的蛋白质的表达。
TREM-1活性的检测
[0071]可以评价TREM-1或DAP12/TyroBP的活性，例如，通过评价一个或多个(例如，两个或两个以上，三个以上，四个以上，五个以上，十个以上，或二十个以上)TREM-1响应基因的表达水平。表达水平可以是绝对或相对的，例如，如与对照样本或参考水平比较。可以通过测试样本和任选的对照样本的转录谱来测定基因差异表达。参考水平可以是对应于已知疾病状态样本的转录谱。阳性对照可以是，例如，其中TREM-1和/或DAP12/TyroBP已有意在一个或多个细胞中过表达的样本，其中已经通过例如加入交联抗体激活TREM-1或DAP12/TyroBP内源性或重组表达的细胞样本，或来自患有已知其严重程度的炎症性疾病或慢性炎症性疾病(例如RA)的受试者的样本。阴性对照可以是，例如，其中TREM-1和/或DAP12/TyroBP没有表达或激活的样本，或来自无炎症性疾病或慢性炎症性疾病(如，RA)的受试者的样本。
[0072]许多用核酸微阵列得到转录谱的实验方案都可以得到。示例性实验方案包括由Affymetrix结合使用其阵列而提供的实验方案。适合进行核酸微阵列杂交的样本可以从任何人的细胞或组织制备。当核酸微阵列包括用于非人类药物目的基因的探针时，可以制备用于相应的非人类物种的细胞或组织的样本。
[0073]用于与核酸微阵列杂交的样本可以是RNA(如mRNA或cRNA)或DNA(如cDNA)。多种方法可用于从组织分离RNA。这些方法包括但不限于试剂盒(德国希尔敦的Qiagen公司提供)，MasterPure^TM试剂盒(Epicentre Technologies提供)和(加州卡尔斯巴德的Gibco BRL公司提供)。也可以使用由Affymetrix公司提供的RNA分离的实验方案。
[0074]在一个实施方案中，分离出的RNA在与核酸微阵列杂交之前被扩增或标记。适用于RNA的扩增方法包括，但不仅限于，逆转录酶聚合酶链式反应，等温扩增，连接酶链反应，Qbeta复制酶方法。扩增产物可以是cDNA或cRNA。在一个实施方案中，用逆转录酶和引物将分离的mRNA反转录成cDNA，该引物由寡聚d(T)和编码噬菌体T7启动子的序列组成。该cDNA是单链的。该cDNA的第二链可以用DNA聚合酶合成，与RNase联合使用以破坏DNA/RNA杂交体。合成该双链cDNA后，加入T7RNA聚合酶以从双链cDNA的第二链转录cRNA。在一个实施方案中，最初分离出的RNA可以不经扩增而与核酸微阵列杂交。
[0075]cDNA、cRNA或其他核酸样本可以用一个或多个标记基团标记，以便对杂交的多核苷酸复合物检测。标记基团可以包括可以用光谱、光化学、生化、生物电子、免疫化学、电子、光学或化学检测手段检测的组合物。标记基团包括放射性同位素、化学发光化合物、标记的结合蛋白、重金属原子、光谱标志物如荧光标记物和染料、磁性标记物、结合的酶、质谱标签、自旋标记物、电子传递供体和受体，等等。
[0076]杂交反应可以以绝对或差异杂交的形式进行。在绝对杂交形式中，来自一个样本的多核苷酸与核酸微阵列的探针杂交。形成杂交复合物后检测的信号与样本中的多核苷酸水平相关。在差异杂交形式中，来自两个样本的多核苷酸用不同的标记基团标记。将这些不同标记的多核苷酸混合物添加到核酸微阵列。然后在来自两个不同的标记发出的光可单独检测的条件下，检测该核酸微阵列。在一个实施方案中，荧光团Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia Biotech，新泽西州皮斯卡塔韦)被用作差异杂交形式的标记基团。
[0077]可以用可商购的软件分析从核酸微阵列收集的信号，例如由Affymetrix或安捷伦科技公司(Agilent Technologies)提供的商业软件。用于扫描灵敏度、探针标记和cDNA或cRNA定量的对照也可以包括在杂交实验中。在进行进一步分析之前，杂交信号可以进行协调或标准化。例如，对于每个探针杂交信号可以标准化，以将在相似实验条件下使用多于一个微阵列时杂交强度的变化考虑在内。杂交信号也可以使用每个微阵列中含有的内部标准化对照所产生的强度来标准化。此外，可以使用具有在各个样本间相对一致的表达水平的基因来标准化其他基因的表达水平。在一个实施方案中，针对某些维持基因(看家基因)的探针包括在核酸微阵列中。选择这些基因，是因为它们显示出跨越各种组织的稳定表达水平。杂交信号可以以这些维持基因的表达水平为基础标准化或协调。
疾病或治疗的监测和评价
[0078]本发明提供了在受试者中监测诸如慢性炎症性疾病(例如，RA)等炎症性疾病的方法。对受试者的炎症性疾病的进展可以通过测量对应于诸如TREM-1或DAP12/TyroBP等一个或多个生物标志物的mRNA，或所编码的蛋白质表达水平或其活性来检测。靶基因mRNA或蛋白质表达水平可以在体内检测，或在取自例如，关节组织、滑液、滑膜或任何其他临床相关来源的样本中检测。对应于靶基因的mRNA和/或蛋白质的表达水平可以通过如上所述的标准方法检测。通过将受试者的靶标蛋白质或RNA水平与该受试者靶标蛋白质或RNA基线水平比较，可以监测受试者的疾病状态(例如，疾病的改善、加剧或复发)。例如，第一时间检测的受试者的TREM-1表达水平可以与后来的第二时间受试者的TREM-1表达水平比较。TREM-1mRNA或蛋白质的表达水平随时间的升高是炎症性疾病发展的指征。TREM-1mRNA或蛋白质的表达水平随时间的降低是炎症性疾病减轻的指征。
[0079]受试者中例如TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白质或RNA的水平也可用于监测治疗效果。通常，获得受试者目的蛋白质或RNA的基线水平(例如治疗前的)，并且与在治疗后或治疗期间的多个时间点(例如治疗后1天或更多天、数周或数月)测得的目的蛋白质或RNA的水平相比较。比较的结果可表明过去治疗的效果，并可由此对未来的治疗作出相应的修改。例如，在TREM-1蛋白质或RNA水平相对于以前检测水平的减少一般表明对治疗方案的阳性应答，因此，类似的治疗应继续下去。同样，通过将受试者的目的蛋白质或RNA水平与其目的蛋白质或RNA基线水平比较，或与之前检测的目的蛋白质或RNA水平比较，可以监测受试者的疾病状态(例如，疾病的改善、加剧或复发)。
治疗
[0080]本发明提供通过抑制和/或拮抗TREM-1介导的信号转导来治疗诸如慢性炎症性疾病(如RA)或呼吸系统紊乱/疾病(如哮喘)等炎症性疾病的方法。抑制和/或拮抗TREM-1介导的信号转导可以通过直接抑制TREM-1或通过抑制和/或拮抗TREM-1信号通路中的非TREM-1成员来达成，如TREM-1辅助蛋白DAP12/TyroBP。适合的抑制剂和/或拮抗剂可以，例如，降低编码TREM-1的核酸的表达、降低TREM-1蛋白质水平，或抑制TREM-1的活性。抑制剂和/或拮抗剂的例子以非限制举例的方式包括，例如：反义寡核苷酸；干扰RNA；TREM-1的抗体；TREM-1配体的抗体；TREM-1配体结合位点的竞争剂，包括TREM-1受体与其配体结合片段、可溶性截短的TREM-1受体、可溶性TREM-1受体融合蛋白，例如包含IgG免疫球蛋白的Fc部分的TREM-1融合蛋白、配体融合蛋白；拟肽；肽抑制剂；小分子；及其组合。
反义寡核苷酸
[0081]反义寡核苷酸可以通过降低下述靶标的mRNA和蛋白质的水平用来抑制TREM-1、DAP12/TyroBP、或TREM-1或DAP12/TyroBP信号通路中的任何其他成员。反义抑制是指给予或原位产生在细胞条件下与编码一个或更多个受试者目的等位基因的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交或结合的核酸序列或其衍生物，以通过例如抑制其转录和/或翻译来抑制该目的等位基因的表达。其结合可以通过传统的碱基对互补，或例如，在结合到DNA双链体的情况下，通过在双螺旋的大沟内的特异性相互作用而实现。一般情况下，反义抑制涉及本领域常用的技术范围，包括任何依靠对核酸序列特异性结合的抑制。本发明的反义构建体可以作为，例如表达质粒来输送，该表达质粒当在细胞中转录时，产生与细胞mRNA的至少唯一的一部分互补的RNA，该细胞mRNA编码内源性基因的目的序列或目的等位基因。另外，反义构建体可以是离体产生的核酸，该核酸当引入细胞中时，通过与内源性基因的目的等位基因的mRNA和/或基因组序列杂交而引起其表达抑制。这种核酸优选是耐内源性核酸酶(如外切核酸酶和/或内切核酸酶)的修饰的寡核苷酸，因此在体内稳定。对核酸进行诸如硫代磷酸酯的修饰，以提高他们抵抗核酸酶降解的抗性、亲和力和被摄取的能力。用作反义寡核苷酸的示例性核酸为DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯以及甲基膦酸酯类似物(参见美国专利NO 5,176,996；5,264,564和5,256,775)。
[0082]反义核酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或“其修饰体”，可以是单链或双链。如此处所述，“其修饰体”涉及修饰过的核酸，例如在其碱基基团、糖基或磷酸盐骨架上修饰过的核酸，例如，以提高稳定性、半衰期、杂交、效果等。可能的修饰包括但不仅限于：向分子的5′和/或3′端加入核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸侧翼序列；在寡聚脱氧核糖核苷酸骨架中使用硫代磷酸酯或2′O-甲基而不是磷酸二酯键连接。该核酸可包括其他附加基团，例如肽(例如，靶向体内宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜(例如，见PCT公开号WO88/09810，1988年12月15号出版)或血脑屏障(例如公开号WO 89/10134，1988年4月25日公开)转运的试剂，杂交触发的裂解剂或嵌入剂。为此，该寡核苷酸可以连接到另一分子上，例如，肽，杂交触发的交联剂，转运剂，杂交触发的裂解剂等
[0083]该反义核酸可以任选地包括选自下组的至少一个修饰的碱基基团，该组包括但不限于，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫脲苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖辫苷(galactosylqueosine)，肌苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶，β-D-甘葡聚糖辫苷(mannosylqueosine)，5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N-6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-乙醇酸(oxyacetic acid)(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，辫苷，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫脲嘧啶，2-硫脲嘧啶，4-硫脲嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯，尿嘧啶-5-乙醇酸(v)，5-甲基-2-硫脲嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
[0084]反义寡核苷酸的合成方法是已知的，包括固相合成技术。用于这种合成的设备可从包括如应用生物系统公司(加利福尼亚州福斯特城)等一些厂商那里商购。另外，含有指导反义转录物的产生的调节元件的表达载体可用于生产反义分子。
[0085]本领域可以理解，反义寡核苷酸序列不需要与其要杂交的目的核酸序列在生理条件下100％互补。在生理条件下当反义寡核苷酸与TREM-1核酸的结合干扰TREM-1核酸的正常功能，而且其对非靶序列的非特异性结合被最小化时反义寡核苷酸得到杂交。
RNAi
[0086]本发明还涉及使用RNA干扰(RNAi)抑制TREM-1、DAP12/TyroBP或TREM-1或DAP12/TyroBP信号通路中的任何其他成员的表达。本发明的RNAi分子可以被设计为特异性抑制TREM-1、DAP12/TyroBP、或TREM-1或DAP12/TyroBP信号通路中的任何其他成员。任何类型的RNA干扰序列都可用于本发明。其非限制性的例子包括短干扰RNA(siRNA)分子或短发夹RNA(shRNA)。可用多种算法进行RNAi序列设计。在一个实施方案中，用于siRNA的目的序列包括大约18，19，20个或更多个核苷酸。2dT可以在siRNA合成过程中添加到3′端，从而形成“AA”悬垂。在许多情况下，目的序列中的GC含量为35％至55％，而该序列不包括任何连续4个A或T(即AAAA或TTTT)、连续3个G或C(即GGG或CCC)，或一行中的7个“GC”。也可以采用更严格的标准。例如，目的序列的GC含量可限定为45％至55％，并排除任何含有三个连续相同碱基(即GGG、CCC、TTT或AAA)或具有5个或更多个碱基的回文序列的任何序列。此外，目的序列可以选择为具有与其他变种或基因序列同源性低的序列。可以通过在表达目的基因产物的细胞中引入或表达该RNAi序列来对RNAi分子的效果进行评估。目的基因产物的mRNA或蛋白质水平的实质改变是RNAi分子在抑制该基因表达中的有效性的指征。在细胞中表达RNAi分子的方法为本领域所公知，其中包括，例如，慢病毒载体。
免疫原性组合物
[0087]可采用激发对TREM-1或DAP12/TyroBP免疫应答的组合物来减少TREM-1信号。该组合物可以包括TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其片段或变体(例如，具有增强的与人MHC分子结合能力的变体或片段)用于激发对人TREM-1或人DAP12/TyroBP的免疫应答。这些蛋白质、片段或变体可以提供为分离的多肽，或带有额外的肽序列，例如，在融合蛋白或与诸如载体蛋白等其他多肽的共轭物中的额外的肽序列。在一些实施方案中，在免疫原性组合物中提供编码蛋白质、片段或变体的核酸，来代替这些蛋白质、片段或变体自身。
[0088]优选免疫原性组合物还包含佐剂。佐剂可以是增强或加强对外源性抗原免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫刺激剂的实例包括：铝盐；可生物降解的微球(如polylactic galactide)；脂质体(化合物被包含其中)；细胞因子(诸如例如GM-CSF或IL-2、IL-7、IL-12，或编码它们的核酸)和CpG多核苷酸。
[0089]如上所述，疫苗可以包含编码TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白质或其部分或变体的DNA，还可以含有编码如细胞因子等佐剂蛋白质的DNA，从而使多肽可以在体内生成。该DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的各种DNA输送系统中，包括核酸表达载体，基因输送载体和细菌表达系统。各种基因输送技术为本领域公知。适宜的核酸表达系统包含在受试者中表达所必需的DNA序列(如合适的启动子和终止信号)。细菌输送系统涉及给予在其细胞表面表达多肽的免疫原性部分或分泌该抗原表位的细菌(如卡介苗)。在一个实施方案中，用病毒表达系统引入DNA(例如，牛痘或其他痘病毒，逆转录病毒或腺病毒)，这可能涉及使用非致病性(缺陷型)、具备复制能力的病毒。将DNA纳入这种表达系统的技术是本领域普通技术人员所公知的。也可以是“裸”DNA，例如Ulmer等人(1993)Science 259：1745-1749中所述。裸DNA的摄取通过将DNA包被到生物可降解珠上来提高，该生物可降解珠能够有效地运送到细胞内。疫苗可既包括多核苷酸又包括多肽成分。这种疫苗可提供增强的免疫应答。
配体结合竞争剂
[0090]TREM-1信号也可以通过给予结合TREM-1配体的竞争剂来抑制。这可以例如通过给予TREM-1细胞外结构域的可溶性片段来达成，其可选择地偶联到载体蛋白(如本领域已知的IgG免疫球蛋白)上。例如，已经公开了给予用TREM-1片段和人IgG1的Fc部分形成的TREM-1-Fc融合蛋白，并且其证明能够有效保护防止微生物败血症(见例如，美国专利公开号No.2005-0260670，其以整体合并于此作为参考)。融合蛋白的IgG Fc部分可来自任何IgG亚类(如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)。TREM-1/IgG融合蛋白的制备方法是已知的。例如Bouchon等人(2000)Am.Assoc.Immun.164(10)：4991-95描述和教导了如何产生可溶性TREM-1-Fc融合蛋白。基于TREM-1和DAP12/TyroBP与RA的相关性，目前预计，相似地将适宜的TREM-1片段给予RA患者会降低疾病的严重程度。重要的是，对人的治疗并不一定需要给予野生型的人TREM-1片段：也可以使用来自其他哺乳动物的其他TREM-1片段，而且其中可以引入一个或多个氨基酸取代，只要该片段还保有与内源性人TREM-1竞争与配体结合的能力即可。
结合配偶体
[0091]治疗例如RA和哮喘等炎症性疾病的其他手段包括给予结合剂，如蛋白质，肽和/或抗体或其部分(例如，Fab，F(ab′)₂，Fv或单链Fv片段)，这种结合剂与治疗靶点相互作用，例如结合和/或中和治疗靶点。本发明的治疗靶点包括，例如，TREM-1、TREM-1配体、DAP12/TyroBP和TREM-1信号转导通路的任何其他成员。对RA或哮喘患者给予抗TREM-1结合剂，例如抗TREM-1抗体，可以通过抑制和/或拮抗TREM-1或DAP12/TyroBP活性或TREM-1信号传导而减轻疾病的症状。该抗体可以是分离的抗体。在一个实施方案中，该抗体是拮抗性抗体。在另一实施方案中，该抗体是中和抗体。在进一步的实施方案中，抗体调节、降低和/或抑制一个或多个TREM-1相关的活性，包括但不限于调节、降低和/或抑制TREM-1与TREM-1配体和/或DAP12/TyroBP相互作用；调节、降低和/或抑制TREM-1介导的信号转导；调节、降低和/或抑制TREM-1激活的促炎症细胞因子和/或趋化因子的表达；和调节、降低和/或抑制TREM-1激活的基因的表达，例如SPP1。本发明的抗TREM-1抗体可以包括，例如，特异性结合TREM-1的抗体和/或结合TREM-1受体的膜结合形式而不激活TREM-1受体的抗体。在某些实施方案中，抗体或其片段直接或间接用可检测物质标记，以方便结合或未结合的抗体的检测。适用的可检测物质包括，例如，酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。制备和筛选用于本发明的实施的抗体的方法为本领域所公知(参见，例如Harlow等人(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，(New York：ColdSpring Harbor Laboratory)。本发明的抗TREM-1抗体也可包括来自任何物种的单结构域抗体。也可以使用替代的结合结构域多肽来抑制和/或拮抗TREM-1或DAP12/TyroBP活性或TREM-1信号转导，例如SMIP^TM。这些抗体或其片段也可以用于诊断、监测和/或预防受试者的炎症性疾病，例如RA和哮喘。
实施例
[0092]实施例1：TREM-1和DAP12/TyroBP的转录谱分析
[0093]用基因表达分析的信使RNA的整体分析已经成功用于许多疾病来鉴别导致疾病发病的基因和用于新型治疗的潜在靶点(Battiwalla等人(2005)Genes and Immunity 6(5)：388-97)。利用基因表达分析，TREM-1和DAP12/TyroBP被鉴定为治疗炎症疾病(例如，RA)的潜在靶标。
[0094]简单地说，按照美国风湿病学会(American College ofRheumatology criteria)的标准，经当地的研究伦理委员会的预先批准，在手术过程中从RA患者中取了24个滑膜组织样本。在这24样本中，10个样本来自关节滑膜，14个样品来自腱滑膜。八个未受累(即正常)的滑膜组织来自非RA患者。未受累的滑膜组织来自3位因钝挫伤需要截肢的病人，而且滑膜分离自远离创伤点的位点。收获RA患者和非RA患者滑膜样本，并在液态氮中快速冷冻，并-80℃保存，直至处理。用(Santa Clara，CA)HG_U95A和B(人样本)寡核苷酸微阵列分离和分析总RNA。用MAS4算法得到来自阵列的表达测量值，并参照内在的(spiked-in)标准对其进行标准化以估计每百万记录的转录物(Hill等人(2001)Genome Biol.2(12)：RESEARCH0055)。
RNA分离
[0095]用PowerGen^TM 700匀浆机(Fisher Scientific，宾州匹斯堡)在组织裂解缓冲液(试剂盒，Promega，威斯康星州麦迪逊)中将冷冻的样品打散并裂解。用修订的制造商的建议方法提取总RNA。简单来说，加入异丙醇沉淀RNA，并用冷的75％乙醇洗涤两次。将沉淀溶于minikit的样本裂解缓冲液(RLT)中，根据制造商的建议纯化RNA(Qiagen，德国Hilden)。对于每个样品，在260nm测量紫外吸收以定量总RNA，并取等份样用2100Bioanalyzer^TM(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)分析，以确定RNA的完整性。
用于寡核苷酸阵列分析的杂交溶液的制备
[0096]用Choice^TM试剂盒(Invitrogen公司，加州卡尔斯巴德)和33pMol含有T7RNA聚合酶启动子的寡聚dT引物(Proligo有限责任公司，科罗拉多州博尔德)从5微克总RNA制备双链cDNA。通过加入下列试剂盒成分启动第一链cDNA合成：1×第一链缓冲液，10mM的DTT，500μM的dNTP，400U的RT II，40U的RNAase抑制剂。该反应在47℃下进行1小时。通过加入下列试剂盒成分进行第二链合成：1×第二链缓冲液，200μM再加入的dNTP，40U的大肠杆菌DNA聚合酶I，2U的大肠杆菌RNaseH，10U的大肠杆菌DNA连接酶。该反应在15.8℃进行2小时。在第二链反应的最后五分钟，加入T4DNA聚合酶(New England BioLabs，马萨诸塞州贝弗利)，使其终浓度为6U。采用固相可逆固定化技术纯化双链cDNA，并收集在20μl的10mMTris乙酸盐(pH 7.8)中。根据说明书用Bio Array^TM High Yield^TM RNA转录标记试剂盒(T7)(纽约法明代尔的Enzo公司)转录纯化的cDNA(10μl)。根据说明书使用小试剂盒(Qiagen，德国Hilden)纯化生物素标记的反义cRNA。在260nm测量紫外吸收来测定cRNA产量。
寡核苷酸微阵列杂交方法
[0097]为提高杂交效率，15微克的cRNA被片段化。根据制造商的建议，片段化的cRNA探针被用来形成寡核苷酸微阵列杂交溶液(Affymetrix，Santa Clara，CA)。杂交溶液含有11种原核RNA的混合物，每种具有不同的已知浓度，用来建立每个微阵列的内部标准曲线，并加入以测定待测基因的频率。在45℃将杂交溶液与两个玻璃珠(FisherScientific，Pittsburgh，PA)预杂交过夜。将杂交溶液转移到干净的试管中，在95℃加热1-2分钟，在最高速度微离心2分钟以沉淀不溶的碎片。标记的cRNA溶液与(Santa Clara，CA)Hg_U95Av2 & B寡核苷酸微阵列杂交，该微阵列上排列有25,128个人类基因序列。杂交后，回收cRNA溶液，按照Affymetrix的实验方案，洗涤微阵列，准备扫描。收集原始荧光数据，并用3.2 application(Affymetrix，Santa Clara，CA)简化(reduced)。
表达谱数据分析
[0098]使用Hill等人(2001)Genome Biol.2(12)：RESEARCH0055所述的杂化物经协调的频率标准化对原始数据进行加工。用GeneSpringGX^TM v7.3(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司)进行该经协调的频率数据的简化和分析。进行两种类型的分析。在第一种中，将所有的患病样本与正常样本比较。在第二种分析中，根据疾病的位点将数据细分，以便关节RA滑膜数据根据对照关节滑膜样本的平均值进行标准化，腱滑膜RA样本根据对照腱滑膜样本的平均值进行标准化。
[0099]为了确定那些与RA相关的转录物，来自各个疾病样本的基因转录物经协调的频率根据所有非类风湿基因转录物频率的平均值进行标准化。通过过滤那些相对于对照的平均值表达水平升高或降低的基因转录物，总数据减少。除了数据标准化的步骤，在过滤得到的数据上进行几个统计分析。用0.05的临界p值来确定假阳性率(False discovery rates，FDR)和Bonferroni的误差率判断族(family-wise error rates，FWER)。此外，在GeneSpring^TM中进行数据组的无监督分层聚类分析(unsupervisedhierarchical cluster analysis)和k最近邻分析(k-nearest neighbor)。用无监督分层聚类分析将得到的数据组可视化。
[00100]在第二次分析中，对关节和腱样本分别进行了分析。关节滑膜和腱滑膜样本根据它们各自位置特异性的对照的平均值进行标准化。如上所述相同的过滤和统计参数应用于每个分析。两套产生的数据组使用Venn分析组合，并接受基因和样本的无监督分层聚类分析。使用k最近邻分析法进行分析以区分四个参数：疾病，非疾病，关节和腱。此分析过程描述如下。然后具有最好区别的基因进行样本和基因的无监督分层聚类分析。
[00101]表达数据的统计分析在log-2经转化的表达测量上执行。样本组之间的倍数变化通过取每组log-2表达水平平均值的差异进行计算，和后端转化生成的log倍数变化为线性比例。各群体之间的差异表达的显著性由置换检验确定。简单地说，在每个关注的比较中，为每个probeset计算F-统计，采用组内误差估计，衍生于相似强度水平的集中的probesets的误差估计。观察到的F-统计涉及在样本标签的随机置换后，从同一数据组经相同计算的F-统计的空分布。差异表达的p值定义为置换F-统计的分数，比观察到的每个probeset的F-统计值大(Edington(1995)Randomization Tests(New York：Marcel Dekker)；Zar(1999)Biostatistical Analysis(New Jersey：Simon & Shuster))。
结果
[00102]滑膜活组织检查的基因表达分析表明，在RA患者中，TREM-1和DAP12/TyroBP mRNA的表达显著上调。图1是显示RA患者滑膜中TREM-1和DAP12/TyroBP表达的条形图。TREM-1表达的倍数变化根据正常滑膜样本进行标准化。RA阳性样本(n＝24)较未受累的样本(n＝8)的TREM-1 mRNA上调6.5倍(p值为1.98×10^-6)(图1)。此外，RA阳性样本(n＝24)较未受累的样本(n＝8)的DAP12/TyroBPmRNA上调2倍(p值为7.83×10^-4)(图1)。
[00103]除了在RA中上调外，TREM-1和DAP12/TyroBP mRNA的表达水平随RA的严重性而变化。RA患者中14例腱样本划分为两类临床定义的疾病亚型，侵入型和胞囊化型(encapsulated)，侵入型RA更具进行形式。侵入型腱滑膜样本(n＝7)与胞囊化型腱滑膜样本(n＝7)相比，TREM-1mRNA上调2.64倍(p值为1.36×10^-4)(图1)。同样，浸润型样本(n＝7)与胞囊化型样本(n＝7)相比，DAP12/Tyro12 mRNA表达上调1.4倍(p值为1.67×10^-2)(图1)。
[00104]在单核细胞，中性粒细胞和巨噬细胞中比较细胞特异性基因表达，表明在RA阳性滑膜组织中，炎性细胞浸润只构成TREM-1表达水平的部分增加。为了确定是否TREM-1表达的增加是由于RA滑膜中TREM-1阳性炎性细胞的侵入，我们全面研究了特异性表达在单核细胞(182个基因)，中性粒细胞(328个基因)和巨噬细胞(34个基因)中的基因的表达水平。这些基因的表达水平平均范围从1.22至1.59，标准差较大。TREM-1表达的增加主要是由于TREM-1基因的表达上调，而不是细胞浸润的大量增加。
实施例2：TREM-1和DAP12/TyroBP的定量实时PCR
[00105]在胶原诱导的关节炎模型中，TREM-1和DAP12/TyroBPmRNA过表达。在雄性DBA/1小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)上使用牛II型胶原(Chondrex，Redmond，WA)构建胶原诱导的关节炎(CIA)。小鼠至少每周3次监测疾病进展。个体四肢依据以下指标指定临床评分：(0)正常；(1)可见红斑，伴随一至两个肿胀的趾；(2)明显红斑，特点为爪肿胀和/或多趾肿胀；(3)大量肿胀延伸到踝或腕关节；及(4)四肢使用困难或关节僵硬。对于任何给定的小鼠所有肢体评分的总和产生潜在的全身最高评分为16。在不同疾病阶段使动物安乐死并收获组织。患病动物RNA从三个评分为3的爪和1个评分为4的爪制备。正常动物中提取的RNA由4个评分为0的爪制备。TREM-1mRNA使用下面的引物和探针定量：
正向引物CAGATGTGTTCACTCCTGTCATCA(413-436)(SEQ IDNO：1)；
反向引物CTGGGTGAGTATTTTGTGGT AATAAGG(494-468)(SEQ ID NO：2)；
探针：CCTATTACAAGGCTGACAGAGCGTCCCA(439-466)(EQID NO：3)。
标准曲线由已知浓度的mTREM-1生成。DAP12/TyroBP mRNA使用下面的引物和探针定量：
正向引物：CCTGGTCTCCCGAGGTCAA(255-273)(SEQ ID NO：4)；
反向引物：GGCGACTCAGTCTCAGCAATG(323-302)(SEQ IDNO：5)；
探针：TTGTTTCCGGGTCCCTTCCGCT(300-279)(SEQ ID NO：6)。
[00106]为了计算表达倍数的变化，TREM-1 RNA水平和DAP12/TyroBP RNA水平根据GAPDH mRNA的表达进行标准化。通过RT-PCR测得，CIA爪比正常小鼠爪的TREM-1mRNA上调132倍(图2)，而DAP12/TyroBP上调8.21倍(图2)。这些结果进一步证实，TREM-1和TREM-1信号相关蛋白的表达在RA疾病的患病位置是上升的。
实施例3：免疫组织化学检测TREM-1表达
[00107]多种滑膜样本进行免疫组织化学检测，以确定在蛋白质水平TREM-1表达是否增加。简单地说，通过肯尼迪风湿病学院(KennedyInstitute of Rheumatology)在患者手术过程中获得5例RA滑液样本，并且从New England Baptist医院获得两例OA组织。组织经福尔马林固定，石蜡包埋。免疫组化在4微米组织切片上进行。切片首先在二甲苯中脱蜡，并在系列梯度乙醇中再次水化。用PBS洗涤后，恢复抗原，并且细胞用Tween20透化。样本用小鼠抗TREM-1抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)在BiogenexTM i6000TM系统中按照标准方案进行免疫染色。所用的二级抗体和检测试剂来自Mach3TM小鼠探针HRP聚合物试剂盒(Biocare，Concord，CA)。免疫组织化学染色阳性的细胞定义为染为棕色的那些细胞。对于每一张切片，随机选取10个200x临近滑膜表面的观察视野，并对免疫组化阳性细胞进行计数和计算总和，作为免疫组化阳性细胞指数。
[00108]来自5例RA患者的切片免疫组化显示五例病人中三例具有高TREM-1水平，一例病人——RA4(表1)具有极高的水平。RA样本的两例(RA1和RA2)有低TREM-1水平并与来自骨关节炎患者的对照样本类似(OA1和OA2)(见表1)。图3A描述一个抗TREM-1标记的RA滑液组织样本的代表性视野。图3B描述抗TREM-1标记的，来自对照OA患者的滑液组织样本的一个代表性视野。
[00109]为了确定RA样本中TREM-1阳性细胞的细胞类型，TREM-1和CD163，CD14，CD68或髓过氧化物酶的双重免疫组化依次进行，首先使用TREM-1抗体，其次使用CD163(10D16，来自Labvision，Freemont，CA)，CD14(Labvision，Freemont，CA)，CD68(PG-Ml，来自Biocare，Concord，CA)，或髓过氧化物酶(Abeam，Cambridge，UK)抗体各自进行染色。没有切片得到髓过氧化物酶的染色，表明缺乏中性粒细胞。令人惊讶的是，只有来自RA5的切片得到CD68的染色，但这些切片没有得到TREM-1的共染色。来自RA3和RA5的TREM-1阳性细胞的一小部分(3-10％)被CD14或CD163共染色。在五个RA滑膜切片中，这些标志和TREM-1存在的差异反映了该疾病的异质性。
表1.RA和对照(OA)滑膜样本中TREM-1阳性细胞的指数。