一种寡肽 A 及其抗菌应用 技术领域 本发明涉及一种抗菌肽及其应用， 尤其涉及一种寡肽 A 及其抗菌应用， 属生物医 学技术领域。
背景技术 目前， 因抗菌药物的泛滥使用， 产生了一些新的问题， 如出现的相应耐药性致病 株， 即产生了细菌的耐药性， 而致病菌的耐药性已经日益严重地威胁着人类的健康和疾病 临床治疗。因此， 寻找全新类型的抗菌药物已成为解决耐药性问题又一对策。
抗菌肽是指分布于生物体内具有抵御外界微生物侵害、 清除体内突变细胞的一类 小分子多肽， 根据肽中氨基酸的数量的不同， 一般将由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化 合物叫做二肽， 同理类推还有三肽、 四肽、 五肽等， 一直到九肽 ； 也有文献把由 2 ～ 10 个氨基 酸组成的肽称为寡肽 ； 或称为短肽。与抗生素不同， 抗菌肽是特定基因编码的产物， 它通过 破坏细胞膜通透性使细胞内容物外流， 最终导致细菌死亡。 因此它不会使细菌产生抗药性， 因而避免了超级细菌的产生。
近年来， 肽在人体中的作用已引起科学界的高度重视。随着医学及生化技术的发 展， 多肽类药物将成为 21 世纪重要的诊断、 监测、 预防和治疗药。因此， 针对日益突出的细 菌的耐药性问题， 开发具有显著抑菌活性的寡肽即多肽药物， 具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足， 本发明要解决的问题是提供一种寡肽 A 及其抗菌应用。
本发明所述的寡肽 A， 其特征在于 ： 寡肽 A 是 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列， 具 体是 ： Gly Lys Ala Phe Val Lys Lys。
本发明所述寡肽 A 在制备抗细菌药物中的应用。
本发明提供的寡肽 A 具有显著的抑菌功能， 同时对正常细胞无毒性。
功能实验显示 ： 本发明所述寡肽 A 抗菌谱广， 无论是对革兰氏阳性菌、 还是对革兰 氏阴性菌， 都具有明显地抑制作用， 而且对真菌的抑制作用也很显著。 提示其在抗细菌药物 开发和应用方面有重要价值。
进一步的功能实验显示 ： 本发明的寡肽 A 对细菌的抑制作用在 10min 之内就开始 发挥， 20min 后抑制率即可达 75％以上， 40min 后就可达到 90％以上。本发明的寡肽 A 不仅 抗菌作用强， 而且稳定性好， 在 100℃煮沸 10min 后， 不仅活性还能保持 80％， 而且在酸、 碱 的环境中还能发挥其良好的抑菌作用。
本发明提供的寡肽 A 合成方便， 且不需任何修饰连接即具有抑菌功能， 同时对正 常细胞无毒性， 为抗细菌药物的开发提供了基础。
鉴于上述寡肽 A 的性质和功能， 本领域普通技术人员可以利用分子生物学技术， 根据氨基酸与密码子的对应关系反推出核酸序列作为功能基因， 用于制备转基因动物或植 物以表达功能蛋白， 以进一步用于药物的开发和临床治疗。具体实施方式
实施例 1
本发明所述寡肽 A 的设计与合成
1、 依 据 目 前 国 际 主 要 抗 菌 肽 数 据 库 (http://www.imtech.res.in/raghava/ antibp/ ； http://aps.unmc.edu/AP/main.php ； http://www.bbcm.univ.trieste.it/ ； http://penbase.immunaqua.com/) 中登陆的抗菌肽的序列， 分析其一级结构与活性的对应 关系， 设计人工寡肽序列。
2、 利用蛋白质分析数据库 http://www.expasy.org/ 分析已知活性的多肽序列与 设计的寡肽序列的二级结构的相似度， 结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正。
3、 将设计的人工寡肽序列送至生物公司合成或利用自动多肽合成仪合成序列。 HPLC 检测纯度要大于 96％， 同时通过质谱检测确定多肽合成质量。样品以冻干状态保存。
4、 对合成后的寡肽进行抑菌功能检测筛选。
5、 通过功能检测， 最终获得具有抑菌功能的寡肽序列， 命名为寡肽 A， 其氨基酸序 列具体是 ： 6ly Lys Ala Phe Val Lys Lys。 实施例 2
利用液体生长抑制法检测本发明所述寡肽 A 的抑菌活性
2.1 材料、 试剂
1) 本发明所述寡肽 A 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成， 氨苄青霉素 (Amp) 为 solarbio 公司产品， 一次性滤器， 为美国 PALL 公司产品， 其它药品试剂为国产分析 纯。
2) 选用革兰氏阳性菌 ： 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn)、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach)、 藤 黄 微 球 菌 (Micrococcus luteus)、 藤黄八叠球菌 (Sarcina ureae)、 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)、 巨大芽胞杆菌 (Bacillus megaterium) ； 革兰氏阴性菌 ： 大肠杆菌 (Escherichia coli)、 弧 菌 (Vibrio)、 肺 炎 克 氏 杆 菌 (Klebsiella pneumoniae)、 粘 质 沙 雷 氏 菌 (Serratia marcescens)、 变 形 杆 菌 (Proteus)、 地 衣 芽 孢 杆 菌 (Bacillus licheniformis) ； 真菌 ： 茄 病 镰 刀 菌 (Fusarium solani)、 尖 孢 镰 刀 菌 (Fusarium oxysporum)、 瓜类炭疽病菌 (Colietetrichum lagenarium)、 苹 果 炭 疽 病 菌 (Gloeosporium album) 棉 花 黄 萎 病 菌 (Verticillium dahliae) 进行测试。
上述菌株均购自生物公司。
3) 封闭液 ： 0.4％ BSA(w/v)， 0.02％冰醋酸， 配制后过滤除菌。
4)PB 液体培养基 (PH7.4-7.6)
胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L
氯化钠 (NaCl) 5g/L。
2.2 实验
1) 向无菌 96 孔酶标板的孔中加入 200μL 封闭液， 室温封闭 24h。
2) 用 PB 液体培养基过夜培养上述各种细菌， 转培养使细菌处于对数生长期， 然后 用 PB 培养基调整菌液 OD600 约为 0.002 ； 备用。
3) 酶标板弃去封闭液， 每孔加 90μL 步骤 2) 所述菌液， 再加入用 10μL 无菌水配 好的各种浓度梯度 ( 浓度范围 ： 1mg/mL ～ 80mg/mL) 的本发明所述寡肽 A。 阴性对照为 90μL 菌液 +10μL 无菌水 ； 阳性对照为 90μl 菌液 +10μL 浓度为 0.25mg/mL 氨苄青霉素溶液 ( 终 浓度为 0.025mg/mL， 约 62μM)。
4) 将加好菌液和药品的酶标板置于 28℃摇床， 100rpm 恒温培养。分别在培养后 0h、 3h、 12h、 15h、 24h、 36h， 用 BIOTEK ELX800 酶标仪测定每孔的 630nm 吸光值 (OD630)。
5) 利用 sigmaplot10 和 Excel 软件分析处理数据。
结果表明， 本发明的寡肽 A 对无论是对 G+ 菌、 还是对 G- 菌都能被它很好地抑制， 而 且对真菌的抑制作用也不错 ； 15mg/mL ～ 60mg/mL 浓度范围内， 浓度越大抑菌效果越明显。 提示其在抗细菌药物开发和应用方面有重要价值。
实施例 3
以大肠杆菌 (Escherichia coli) 为指示菌。
质 量 浓 度 为 40mg/mL 的 本 发 明 寡 肽 A， 分 别 在 作 用 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)10min， 20min， 30min， 40min， 50min， 60min 和 90min 后涂板。
大肠杆菌抑制曲线显示 ： 本发明的寡肽 A 对细菌的抑制作用在 10min 之内就开始 发挥， 20min 后抑制率即可达 75％以上， 40min 后就可达到 90％以上。
实施例 4
以大肠杆菌 (Escherichia coli) 为指示菌。
将本发明的寡肽 A 溶液 (40mg/mL) 分成 8 份， 分别于 100℃加热 0min， 1min， 2min， 4min， 8min， 15min， 20min， 40min 后进行抑菌实验， 每个加热时间做 3 个平行组， 同时做空白 对照组。
背景技术 目前， 因抗菌药物的泛滥使用， 产生了一些新的问题， 如出现的相应耐药性致病 株， 即产生了细菌的耐药性， 而致病菌的耐药性已经日益严重地威胁着人类的健康和疾病 临床治疗。因此， 寻找全新类型的抗菌药物已成为解决耐药性问题又一对策。
抗菌肽是指分布于生物体内具有抵御外界微生物侵害、 清除体内突变细胞的一类 小分子多肽， 根据肽中氨基酸的数量的不同， 一般将由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化 合物叫做二肽， 同理类推还有三肽、 四肽、 五肽等， 一直到九肽 ； 也有文献把由 2 ～ 10 个氨基 酸组成的肽称为寡肽 ； 或称为短肽。与抗生素不同， 抗菌肽是特定基因编码的产物， 它通过 破坏细胞膜通透性使细胞内容物外流， 最终导致细菌死亡。 因此它不会使细菌产生抗药性， 因而避免了超级细菌的产生。
近年来， 肽在人体中的作用已引起科学界的高度重视。随着医学及生化技术的发 展， 多肽类药物将成为 21 世纪重要的诊断、 监测、 预防和治疗药。因此， 针对日益突出的细 菌的耐药性问题， 开发具有显著抑菌活性的寡肽即多肽药物， 具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足， 本发明要解决的问题是提供一种寡肽 A 及其抗菌应用。
本发明所述的寡肽 A， 其特征在于 ： 寡肽 A 是 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列， 具 体是 ： Gly Lys Ala Phe Val Lys Lys。
本发明所述寡肽 A 在制备抗细菌药物中的应用。
本发明提供的寡肽 A 具有显著的抑菌功能， 同时对正常细胞无毒性。
功能实验显示 ： 本发明所述寡肽 A 抗菌谱广， 无论是对革兰氏阳性菌、 还是对革兰 氏阴性菌， 都具有明显地抑制作用， 而且对真菌的抑制作用也很显著。 提示其在抗细菌药物 开发和应用方面有重要价值。
进一步的功能实验显示 ： 本发明的寡肽 A 对细菌的抑制作用在 10min 之内就开始 发挥， 20min 后抑制率即可达 75％以上， 40min 后就可达到 90％以上。本发明的寡肽 A 不仅 抗菌作用强， 而且稳定性好， 在 100℃煮沸 10min 后， 不仅活性还能保持 80％， 而且在酸、 碱 的环境中还能发挥其良好的抑菌作用。
本发明提供的寡肽 A 合成方便， 且不需任何修饰连接即具有抑菌功能， 同时对正 常细胞无毒性， 为抗细菌药物的开发提供了基础。
鉴于上述寡肽 A 的性质和功能， 本领域普通技术人员可以利用分子生物学技术， 根据氨基酸与密码子的对应关系反推出核酸序列作为功能基因， 用于制备转基因动物或植 物以表达功能蛋白， 以进一步用于药物的开发和临床治疗。具体实施方式
实施例 1
本发明所述寡肽 A 的设计与合成
1、 依 据 目 前 国 际 主 要 抗 菌 肽 数 据 库 (http://www.imtech.res.in/raghava/ antibp/ ； http://aps.unmc.edu/AP/main.php ； http://www.bbcm.univ.trieste.it/ ； http://penbase.immunaqua.com/) 中登陆的抗菌肽的序列， 分析其一级结构与活性的对应 关系， 设计人工寡肽序列。
2、 利用蛋白质分析数据库 http://www.expasy.org/ 分析已知活性的多肽序列与 设计的寡肽序列的二级结构的相似度， 结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正。
3、 将设计的人工寡肽序列送至生物公司合成或利用自动多肽合成仪合成序列。 HPLC 检测纯度要大于 96％， 同时通过质谱检测确定多肽合成质量。样品以冻干状态保存。
4、 对合成后的寡肽进行抑菌功能检测筛选。
5、 通过功能检测， 最终获得具有抑菌功能的寡肽序列， 命名为寡肽 A， 其氨基酸序 列具体是 ： 6ly Lys Ala Phe Val Lys Lys。 实施例 2
利用液体生长抑制法检测本发明所述寡肽 A 的抑菌活性
2.1 材料、 试剂
1) 本发明所述寡肽 A 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成， 氨苄青霉素 (Amp) 为 solarbio 公司产品， 一次性滤器， 为美国 PALL 公司产品， 其它药品试剂为国产分析 纯。
2) 选用革兰氏阳性菌 ： 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn)、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach)、 藤 黄 微 球 菌 (Micrococcus luteus)、 藤黄八叠球菌 (Sarcina ureae)、 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)、 巨大芽胞杆菌 (Bacillus megaterium) ； 革兰氏阴性菌 ： 大肠杆菌 (Escherichia coli)、 弧 菌 (Vibrio)、 肺 炎 克 氏 杆 菌 (Klebsiella pneumoniae)、 粘 质 沙 雷 氏 菌 (Serratia marcescens)、 变 形 杆 菌 (Proteus)、 地 衣 芽 孢 杆 菌 (Bacillus licheniformis) ； 真菌 ： 茄 病 镰 刀 菌 (Fusarium solani)、 尖 孢 镰 刀 菌 (Fusarium oxysporum)、 瓜类炭疽病菌 (Colietetrichum lagenarium)、 苹 果 炭 疽 病 菌 (Gloeosporium album) 棉 花 黄 萎 病 菌 (Verticillium dahliae) 进行测试。
上述菌株均购自生物公司。
3) 封闭液 ： 0.4％ BSA(w/v)， 0.02％冰醋酸， 配制后过滤除菌。
4)PB 液体培养基 (PH7.4-7.6)
胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L
氯化钠 (NaCl) 5g/L。
2.2 实验
1) 向无菌 96 孔酶标板的孔中加入 200μL 封闭液， 室温封闭 24h。
2) 用 PB 液体培养基过夜培养上述各种细菌， 转培养使细菌处于对数生长期， 然后 用 PB 培养基调整菌液 OD600 约为 0.002 ； 备用。
3) 酶标板弃去封闭液， 每孔加 90μL 步骤 2) 所述菌液， 再加入用 10μL 无菌水配 好的各种浓度梯度 ( 浓度范围 ： 1mg/mL ～ 80mg/mL) 的本发明所述寡肽 A。 阴性对照为 90μL 菌液 +10μL 无菌水 ； 阳性对照为 90μl 菌液 +10μL 浓度为 0.25mg/mL 氨苄青霉素溶液 ( 终 浓度为 0.025mg/mL， 约 62μM)。
4) 将加好菌液和药品的酶标板置于 28℃摇床， 100rpm 恒温培养。分别在培养后 0h、 3h、 12h、 15h、 24h、 36h， 用 BIOTEK ELX800 酶标仪测定每孔的 630nm 吸光值 (OD630)。
5) 利用 sigmaplot10 和 Excel 软件分析处理数据。
结果表明， 本发明的寡肽 A 对无论是对 G+ 菌、 还是对 G- 菌都能被它很好地抑制， 而 且对真菌的抑制作用也不错 ； 15mg/mL ～ 60mg/mL 浓度范围内， 浓度越大抑菌效果越明显。 提示其在抗细菌药物开发和应用方面有重要价值。
实施例 3
以大肠杆菌 (Escherichia coli) 为指示菌。
质 量 浓 度 为 40mg/mL 的 本 发 明 寡 肽 A， 分 别 在 作 用 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)10min， 20min， 30min， 40min， 50min， 60min 和 90min 后涂板。
大肠杆菌抑制曲线显示 ： 本发明的寡肽 A 对细菌的抑制作用在 10min 之内就开始 发挥， 20min 后抑制率即可达 75％以上， 40min 后就可达到 90％以上。
实施例 4
以大肠杆菌 (Escherichia coli) 为指示菌。
将本发明的寡肽 A 溶液 (40mg/mL) 分成 8 份， 分别于 100℃加热 0min， 1min， 2min， 4min， 8min， 15min， 20min， 40min 后进行抑菌实验， 每个加热时间做 3 个平行组， 同时做空白 对照组。
结果显示 ： 本发明的寡肽 A 在 100℃加热 8min 后， 其抑菌活性基本上没有变 ； 但随 着加热时间的延长， 抑菌活性有所降低， 到 15min 时活性降低了约 50％ ； 接近 20min 时， 本 发明的寡肽 A 活性几乎全部丧失 ； 不过加热时间在 10min 以内， 抑菌活性保持 80％以上。5102363627 A CN 102363645
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