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本发明涉及用于人体组织容量替代或者细胞培养的去脂支架(无脂支架)。更具体地说，本发明涉及制备用于人体组织容量替代或者细胞培养物的去脂支架(无脂支架)，所述方法包括：通过超声处理或者高压喷嘴喷射方法破碎脂肪组织以从脂肪组织碎片中分离脂类；除去分离的脂类以及脂类没有被分离的脂肪组织并进行灭菌。根据本发明，通过物理处理将脂类从脂肪组织中除去以尽可能保持其体积和微结构诸如细胞膜，因此本发明的支架对于人类组织容量替代来说是有用的。

1、  一种用于人体组织容量替代的支架，其通过从脂肪组织中除去脂类来制备。

2、  根据权利要求1所述的支架，其特征在于，所述脂类为小滴。

3、  一种用于细胞培养的支架，其通过从脂肪组织中除去脂类来制备。

4、  根据权利要求3所述的支架，其特征在于，所述脂类为脂滴。

5、  一种制备用于人体组织容量替代或者细胞培养的支架的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)通过超声处理方法破碎脂肪组织以从脂肪组织碎片中分离脂类；
(b)除去分离的脂类以及脂类没有被分离的脂肪组织；以及
(c)将无脂脂肪组织灭菌以得到无脂支架。

6、  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)在不使用蛋白酶的情况下进行。

7、  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)包括使用透明质酸酶处理脂肪组织碎片，接着超声处理。

8、  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括步骤(d)：对得到的支架进行干燥并粉末化。

9、  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂类为脂滴。

10、  一种制备用于人体组织容量替代或者细胞培养的支架的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)通过高压喷嘴喷射方法破碎脂肪组织以从脂肪组织碎片中分离脂类；
(b)除去分离的脂类以及脂类没有被分离的脂肪组织；以及
(c)将无脂脂肪组织灭菌以得到无脂支架。

11、  根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)在不使用蛋白酶的情况下进行。

12、  根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括步骤(d)：对得到的支架进行干燥并粉末化。

13、  根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述脂类为脂滴。

14、  根据权利要求5或10所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)通过过滤或者离心进行。

15、  根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在离心后使用乙醇或者蒸馏水洗涤得到的脂肪组织的步骤。

16、  根据权利要求5或10所述的方法，其特征在于，所述灭菌使用辐射或者环氧乙烷气体来进行。

用于人体容量替代或细胞培养的无脂支架及其用途
技术领域
本发明涉及一种用于人体组织容量替代(human tissue volumereplacement)或者细胞培养的去脂支架(无脂支架)，更具体涉及一种制备用于人体组织容量替代或者细胞培养物的去脂支架(无脂支架)，所述方法包括：通过超声处理或者高压喷嘴喷射方法破碎脂肪组织以从脂肪组织碎片中分离脂类；除去分离的脂类以及脂类没有被分离的脂肪组织；并对剩余脂肪组织碎片进行灭菌。
背景技术
用于人体组织容量替代的各种人造材料已经被开发并且在多种应用中实际使用，但是，这些具有容量逐渐减小的显著问题。
人或动物来源的异源真皮或者异源骨已经被用作相同处理之后的移植材料。但是，其处理非常复杂，并引起耗时延长以便获得权限许可，因为各种化学方法被另外应用于处理以消除人免疫蛋白和细胞的抗原性。而且，处理时具有的其他缺点在于这不能完全消除引起不利副作用的抗原性，需要相当大的处理成本，并且作为原材料的尸体供应受到限制，因此尸体以每lcc尸体500,000韩元的高价格被购买。
各种人造皮肤替代物正在被开发，更具体地说，许多产品诸如非细胞人造皮肤、通过培养患者自身的表皮和真皮细胞制备的按等级分层(双层结构)的细胞活性皮肤替代物(cellular living skin，LSE)等被开发，并且它们处于商业阶段前期(pre-commercial phase)。这些产品非常昂贵，因为它们通过对异源组织去细胞化(decellularizing)或者使用生物材料诸如胶原来制造。
来自人体的细胞人造皮肤在医疗处理方面具有极佳的伤口痊愈效果，例如迅速愈合伤口、减小疤痕等等。这种人造皮肤还被报道显示了没有由于自体同源细胞或者处理的异源组织所引起的免疫排斥反应。
使用壳聚糖、胶原、几丁质等的基质型人造皮肤被商业化并用来代替皮肤，其通过在基质上培养皮肤细胞新近发展起来的技术，现在处于临床实验阶段。但是，这些产品的大量生产还没有实现。
韩国专利号10-0469661公开了用于制备非细胞皮肤移植以生产并提供被称为“SureDerm”的产品的方法，从而达到一些用于组织再生的常常从海外进口的生物材料的国内生产。
但是，由于在保障人体皮肤的国内供应方面存在诸多限制，原材料主要靠进口以生产人造皮肤产品。
一般说来，上述被称为“填料”(filler)的人造皮肤产品常常使用动物来源的材料、合成材料和人来源的材料作为原材料制造，但是在使用的便利性、持久性及价格方面它们具有许多缺点。
另一种产品包括，例如：使用牛胶原制造的用于注射的Zyderm^R，为悬浮在胶原中的聚甲基丙烯酸甲酯小珠混合物的Artecoll^R，为改性透明质酸的Restylane^R，以及为AlloDerm^R的粉末状形式的Cymetra^R以及类似物。
购自LifeCell的市售AlloDerm^R是通过尸体真皮脱细胞化制备的人异源非细胞皮肤基质，并被用作移植物或插入物。这种产品具有的优点在于：通过除去原材料的所有细胞而完全消除了免疫排斥的可能性，并且与任何其他常规人造皮肤产品相比，由于使用天然人体组织而显示了高度的生物相容性。因此类似产品在国内领域已经得到发展，但难以找到皮肤供体，由此导致原材料需要由海外进口。
一般说来，从肥胖患者提取的脂肪组织被抛弃或者部分储存以便进一步使用。保持在大量组织中脂滴中的三酰甘油或者中性脂诸如固醇脂可通过氧化或者部分氧化并水解而被破坏，因此难以将脂肪组织储存2个月以上以重新使用。
脂类氧化通过经多聚不饱和脂肪酸氧化得到的反应物与氨基化合物诸如蛋白质之间的反应引起污染或者脂类减少，并产生毒性物质诸如过氧化氢、不饱和醛等等。此外，来自除人以外的动物例如猪、牛等的脂肪组织具有较低的液体脂肪含量(50％到70％)，并且部分与肌肉膜(panniculus muscularis)混合。另一方面，人脂肪组织与皮肤组织或肌肉层明显不同，并具有非常高的液体脂肪含量，因此仍然没有任何尝试通过处理人脂肪组织来发展新的生物移植材料。
同时，人工替代物意味着能够形成三维基质的支持材料，取自供体的组织细胞被种植在所述材料中，并且常常被称为载体或者人造支架。所述支架必须满足下列条件：
首先，支架应当保持待再生生物组织的形态结构；其次，它们应当充分诱导待培养细胞的粘着、生长和分化；第三，它们应当显示高度的生物相容性；第四，在形成支架之后它们必须安全地被吸收并降。对于再生生物组织的超精确三维人造支架技术的发展来说，制造用于组织再生以便有效分化成特定组织细胞的人造支架并产生于生物组织大体上类似的生物相容性材料是两个关键技术。
例如，用于骨和软组织再生的支架包括各种合成材料诸如合成或天然磷酸钙、聚乳酸或者聚乙醇酸；胶原以及以细胞为基础的天然聚合物等等。用于生产促进组织再生的支架的材料必须具有适于最佳细胞生长和细胞功能的微结构和化学成分。对于骨再生而言，这些材料必须具有与宿主骨相似的物理、化学和机械性质，因为这些性质可影响正常的骨骼生长和骨的功能。近年来，进行了许多关于天然聚合物的研究，特别是由许多关于壳聚糖和生物材料的使用方面的研究。
但是，由于在体内分解的组织相容性生物材料的使用方面存在限制，并且能够分化成各种身体组织的组织工程技术仍没有得到充分发展，在人体中每种器官的功能的可复制性方面存在限制。
另外，虽然组织相容性微粉末被用作用于三维细胞培养的微粉末，生物相容性物质诸如用作用于细胞培养的微粉末的聚L-乳酸(PLLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)的每克材料成本超过500,000韩元。特别是，对于细胞培养来说，与人体组织结构类似的结构应当被形成，但高度精确成形没有得到充分发展以足以形成人体组织状结构。
在可降解微粉末中使用以制造人造支架的生物材料诸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等通过常规工艺制造，包括：例如气泡形成/盐浸析；高压气体膨胀；乳液冷冻-干燥；溶剂浇注/微粒浸析技术；相分离以及类似技术。
但是，这些工艺具有的缺点在于诸如低重复性和高度精确制造以及复合三维结构方面的限制。因此，在制造多孔结构的情况下，上述工艺具有的问题在于，难以自由控制孔径大小和孔隙度，它们显示了孔之间的低交联性，从而引起细胞生长、养分供应、细胞扩散和迁移到人造支架中的困难及其生产所需的延长的时间段。
脂肪组织在储存或者运输方面具有难度，因为其包括达到总组织容量的98％的液体脂肪组织，并且在细胞培养时涉及所有变化，于是没有进行尝试来开发使用脂肪组织进行移植的材料。
但是，如果将脂类从脂肪组织中除去，脂肪组织容量可部分得到保持，同时保持其微结构。因此，认为脂肪组织可作为生物材料起到显著作用。
近来，有一些报道公开了海绵状结构促进细胞的生长和分化。基于这一事实，设想在体内效果或者细胞结构方面，待移植到人体的材料的容量比相同材料的重量更为重要。
因此，可以预期与其他组织相比，如果在脂肪组织处理过程中脂肪组织可含有连接组织和细胞膜的微结构的话，脂肪组织可以是相当有用的材料。
因此，本发明的发明人付出了极大的努力来开发具有三维结构的海绵状粉末，其中脂肪组织的容量保持在最大可能尺寸，脂类氧化被防止，并且现有人造支架的缺点得到完善，结果，他们确认当脂肪组织脂类被物理除去并干燥时，通过注射它们用于移植，脂肪组织可被用作用于人体组织容量替代的支架，同时可被用作细胞培养的支架，由此完成本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供用于人体组织容量替代或者细胞培养的去脂支架(无脂支架)以及生产该支架的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了用于人体组织容量替代或者细胞培养的支架，其通过从脂肪组织中除去脂类制备。
本发明还提供了制备用于人体组织容量替代或者细胞培养的支架的方法，所述方法包括下列步骤：(a)通过超声处理(sonification)将脂肪组织从脂肪组织碎片破碎成分离的脂类；(b)除去分离的脂类和脂类没有被分离的脂肪组织；以及(c)对得到的无脂肪组织进行灭菌以生产脂类被除去的支架。
在本发明中，步骤(a)优选通过以透明质酸酶处理脂肪组织碎片然后进行超声处理。
本发明还提供了制备用于人体组织容量替代或者细胞培养的支架的方法，所述方法包括下列步骤：(a)通过高压喷嘴喷射方法将脂肪组织从脂肪组织碎片破碎成分离的脂类；(b)除去分离的脂类和脂类没有被分离的脂肪组织；以及(c)灭菌得到的无脂肪组织以生产脂类被除去的支架。
在本发明中，步骤(a)优选不使用蛋白酶来进行，并且步骤(c)优选进一步包括用于粉末化的干燥步骤。脂类优选为脂滴。
在本发明中，步骤(b)优选通过过滤或者离心来进行，并优选进一步包括在离心后使用乙醇或者蒸馏水的洗涤步骤。灭菌优选通过使用辐射或者环氧乙烷(EO)气体来进行。
通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式以及上述目的对本领域技术人员来说是显而易见的。
附图说明
图1显示了使用油红O染色的脂肪组织的结果(A：×40倍，B：×100倍)。
图2显示了使用油红O染色的本发明的无脂粉末的结果(A：×200倍，B：×400倍)。
具体实施方式
本发明的优选实施方式提供了用于人体组织容量替代或者细胞培养的去脂支架(无脂支架)及其制备方法。
在本发明中，将在从肥胖患者体内抽取之后抛弃的脂肪组织破碎并超声处理以分离脂类。将分离的脂类和脂类没有被分离的脂肪组织过滤，离心，并使用70％乙醇洗涤，然后加入蒸馏水以除去细胞中尽可能多的脂类，诸如三酰甘油、固醇脂等等。
随后，将无脂脂肪组织冻干或者在空气中干燥，使用辐射或者EO气体灭菌以得到无脂粉末。
在本发明中，由于脂肪组织没有使用蛋白酶诸如胶原酶、脂酶、胰蛋白酶等处理以保持血红细胞、细胞外基质等，去脂支架(无脂支架)的容量和三维结构得到保持(见图2)。
蛋白酶处理可在体内引起安全问题，因此其要求另外的洗涤步骤，并且在获得韩国食品和药品管理委员会许可(Korea Food and DrugAdministration Approval)方面具有问题。
相反，根据本发明的用于人体组织容量替代和细胞培养的去脂支架(无脂支架)具有诸如增加产率并改进质量的优点。
在超声处理中，可加入透明质酸酶以便分离细胞。
将在从肥胖患者体内抽取之后抛弃的脂肪组织破碎并进行高压喷嘴喷射以从碎片中分离脂类。将所述分离的脂类和脂类没有被分离的脂肪组织过滤，离心并使用70％乙醇洗涤，再用蒸馏水洗涤以除去细胞中尽可能多的脂类，诸如三酰甘油、固醇脂及类似物。将无脂脂肪组织冻干或者在空气中干燥，使用辐射或者EO气体灭菌，从而得到无脂粉末。
在高压喷嘴喷射后，可通过仅仅使用蒸馏水洗涤减少蛋白质变性。这里，蛋白质变性在即使在由于蛋白质变性自体同源组织引起免疫排斥反应的情况下也减少到最小。
由于使用油红O对无脂粉末染色的结果，证明粉末不含脂类。
另外，如果在脂肪组织中残存有脂类，其将不被粉末化，于是脂肪组织粉末化可被用于证明其中是否存在脂类。
在本发明中，在这里使用的“用于人体组织容量替代指的是用于如下目的脂肪组织移植：皮肤中外形变形的矫正，诸如深皱纹的变细和面部和身体外形的改变；以及整个人体的变形部位的再生，包括例如肿瘤外科手术、损伤部位的缺陷等等。
在其中脂肪组织被用作用于人体组织容量替代的情况下，其必须包括生物相容性材料以减小对人体的副作用。这里，任何化学处理诸如酶处理必须完全受到限制。
当将脂类从脂肪组织中除去时，其能够长时间储存并且保持体积和微结构，诸如细胞膜，因此脂肪组织可被用作移植材料。
此外，根据本发明的以粉末形式制备的无脂粉末具有用于细胞粘着的表面和高度的生物相容性，因此使其能够用作用于细胞培养的支架。
实施例
此后，将进一步参照实施例对本发明进行描述。但是应当理解的是，这些实施例仅仅用于说明的目的，而不解释为对本发明的范围的限制。
虽然下列实施例使用来自肥胖患者的脂肪组织，但从尸体中提取的脂肪组织也能被用于本发明。
在下列实施例中，通过干燥并灭菌脂类被除去的脂肪组织以粉末形式制备支架。但是，显然本领域技术人员能够理解的是，为了制备支架，脂类被除去的脂肪组织也可以液态使用而不用干燥过程。
实施例1：无脂粉末的制备
1-1(制备实施例1)
将在从肥胖患者体内抽取之后抛弃的脂肪组织破碎并在60～80℃下在蒸馏水中超声处理(110W)10到15次，每次10分钟，以分离脂类。
分离的脂类以及脂类没有被分离的脂肪组织被过滤或以3500rpm离心5分钟，接着分别使用70％乙醇和蒸馏水洗涤。
对无脂脂肪组织碎片进行冻干或者空气干燥并使用辐射进行灭菌，从而得到无脂粉末。
1-2(制备实施例2)
将在从肥胖患者体内抽取之后抛弃的脂肪组织破碎，并通过将蒸馏水加入到碎片中以便使用高压喷嘴喷射，从脂肪组织碎片中分离脂类。
分离的脂类以及脂类没有被分离的脂肪组织被过滤或以3500rpm离心5分钟，接着分别使用70％乙醇和蒸馏水洗涤。
无脂脂肪组织碎片被冻干或者空气干燥并使用辐射灭菌，从而得到无脂粉末。
1-3(制备实施例3)
将在从肥胖患者体内抽取之后抛弃的脂肪组织破碎，并以1.1∶0.1的比例加入蒸馏水和透明质酸酶，接着在60～80℃下在蒸馏水中超声处理(110W)10到15次，每次10分钟，以分离脂类。
分离的脂类以及脂类被分离的脂肪组织被过滤并以3500rpm离心5分钟，接着分别使用70％乙醇洗涤然后用蒸馏水洗涤。
无脂脂肪组织碎片被冻干或者空气干燥并使用辐射灭菌，从而得到无脂粉末。
1-4(制备实施例4)
对从肥胖患者体内抽取之后废弃的脂肪组织进行破碎，并通过将蒸馏水加入到碎片中以便使用高压喷嘴喷射，以从脂肪组织碎片中分离脂类。
分离的脂类以及脂类没有被分离的脂肪组织被过滤并以3500rpm离心5分钟，接着使用蒸馏水洗涤。
无脂脂肪组织碎片被冻干或者空气干燥并使用辐射或者EO气体灭菌，从而得到无脂粉末。
实施例2：无脂粉末的染色
将在实施例1-1中制备的无脂粉末使用油红O染色并将在实施例1-1的粉末化步骤之前的脂肪组织用作对照组。
结果，观察到对照组含有脂类(见图1)，而脂类从实施例1-1中制备的无脂粉末中完全被除去(见图2)。
如同通过该实验结果证明的那样，能够理解本发明的无脂脂肪组织可被用作用于人类组织容量替代的支架。
此外，根据本发明的无脂脂肪组织为微粉末形式，因此其能够被用作用于细胞培养的支架，如图2中所示。
工业实用性
如上面详细描述的那样，本发明具有提供用于人体组织容量替代或者细胞培养的去脂支架(无脂支架)及其制备方法的效果。本发明的用于人体组织容量替代或者细胞培养的去脂支架(无脂支架)具有的优点在于，其过程很简单，因为脂类可从脂肪组织中被除去而不需要化学处理诸如酶处理，储存时间段由于脂类去除以及干燥过程而得到延长，微结构诸如细胞膜及其体积可尽可能得到保持，生产成本由于抛弃脂肪组织的回收而被降低，并且由于以粉末形式制备，它们可注射用于移植。
虽然已经参照上述优选实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员应当理解，对其进行的各种变化和修改都不偏离由所附权利要求书限定的本发明的范围。